1、4.1 4.1 生物成分的分离与测定技术生物成分的分离与测定技术 探究探究点点一一 蛋白质分离技术蛋白质分离技术 不同生物组织细胞中所含的蛋白质种类和数量不尽相同，不同生物组织细胞中所含的蛋白质种类和数量不尽相同， 要研究某种蛋白质的结构、性质和功能，就必须将这种蛋要研究某种蛋白质的结构、性质和功能，就必须将这种蛋 白质从组织细胞中分离、纯化出来。通常用透析法和离心白质从组织细胞中分离、纯化出来。通常用透析法和离心 沉降法分离与纯化蛋白质。沉降法分离与纯化蛋白质。 2蛋白质的分离与纯化蛋白质的分离与纯化 (1)纯化原理：蛋白质之间以及蛋白质与其他物质之间在纯化原理：蛋白质之间以及蛋白质与其他物
2、质之间在 _、_、_的多少、的多少、 _性质等方面存在差异。性质等方面存在差异。 (2)分离、纯化：目前，常用的方法有透析法、离心沉降分离、纯化：目前，常用的方法有透析法、离心沉降 法和电泳法等。法和电泳法等。 透析法透析法 吸附吸附 分子大小分子大小 溶解度溶解度 所带电荷所带电荷 a原理：蛋白质水溶液具有亲水胶体溶液性质，不能透过原理：蛋白质水溶液具有亲水胶体溶液性质，不能透过 半透膜。半透膜。 b目的：去除小分子化合物杂质，如无机盐、单糖、双糖、目的：去除小分子化合物杂质，如无机盐、单糖、双糖、 氨基酸等。氨基酸等。 c常用的半透膜：肠衣、玻璃纸。常用的半透膜：肠衣、玻璃纸。 d步骤：将
3、待纯化的蛋白质溶液装入透析袋内，再把透析步骤：将待纯化的蛋白质溶液装入透析袋内，再把透析 袋放入透析液中即可。袋放入透析液中即可。 _法法 离心沉降离心沉降 a原理：在离心力的作用下，分子大小、密度不同的分子原理：在离心力的作用下，分子大小、密度不同的分子 沉降速度不同，从而被分离。沉降速度不同，从而被分离。 b目的：使分子大小、密度不同的不同种类的蛋白质彼此目的：使分子大小、密度不同的不同种类的蛋白质彼此 分离。分离。 _法法 a概念：带电颗粒在电场作用下向着与其概念：带电颗粒在电场作用下向着与其_的的 电极移动的现象。电极移动的现象。 b原理：不同的物质所带原理：不同的物质所带_，_、 _
4、不同，因此，在电场中的泳动速度不同。不同，因此，在电场中的泳动速度不同。 电泳电泳 电性相反电性相反 电荷不同电荷不同 颗粒的大小颗粒的大小 形状形状 c影响泳动的因素：带电颗粒的性质，即颗粒的大小、形影响泳动的因素：带电颗粒的性质，即颗粒的大小、形 状和所带净电荷的多少；此外还有电场强度、溶液的状和所带净电荷的多少；此外还有电场强度、溶液的 pH 等等 因素。因素。 d泳动特点：带电颗粒直径越小，越接近于球形，所带净泳动特点：带电颗粒直径越小，越接近于球形，所带净 电荷越多，则在电场中的泳动速度越快；反之，则越慢。电荷越多，则在电场中的泳动速度越快；反之，则越慢。 e支持物：滤纸、支持物：滤
5、纸、_、大分子凝胶等。、大分子凝胶等。 醋酸纤维薄膜醋酸纤维薄膜 透析法纯化的原理透析法纯化的原理 透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大 分子物质不能通过半透膜的性质，达到分离的目的。例分子物质不能通过半透膜的性质，达到分离的目的。例 如分离和纯化皂甙、蛋白质、多肽、多糖等物质时，可如分离和纯化皂甙、蛋白质、多肽、多糖等物质时，可 用透析法以除去无机盐、单糖、双糖等杂质。反之也可用透析法以除去无机盐、单糖、双糖等杂质。反之也可 将大分子的杂质留在半透膜内，而将小分子的物质通过将大分子的杂质留在半透膜内，而将小分子的物质通过 半透膜进入
6、膜外溶液中，而加以分离纯化。透析是否成半透膜进入膜外溶液中，而加以分离纯化。透析是否成 功与透析膜的规格关系极大。透析膜的膜孔有大有小，功与透析膜的规格关系极大。透析膜的膜孔有大有小， 要根据欲分离成分的具体情况而选择。透析膜有动物性要根据欲分离成分的具体情况而选择。透析膜有动物性 膜、火棉胶膜、羊皮纸膜膜、火棉胶膜、羊皮纸膜(硫酸纸膜硫酸纸膜)、蛋白质胶膜、玻、蛋白质胶膜、玻 璃纸膜等。璃纸膜等。 探究点二探究点二 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 不同的物质在同一电场中的泳动速度不同，泳动速度主要不同的物质在同一电场中的泳动速度不同，泳动速度主要 取决于带电颗粒的性质，即颗
7、粒的大小、形状和所带净电取决于带电颗粒的性质，即颗粒的大小、形状和所带净电 荷的多少。此外，电场强度、溶液的荷的多少。此外，电场强度、溶液的 pH 等因素对泳动速度等因素对泳动速度 也有影响。也有影响。 1原理原理 _。 血清中各种蛋白质在。 血清中各种蛋白质在 pH 为为 8.6 的缓冲液的缓冲液 中均带负电荷，在电场中都向正极移动。由于血清中各中均带负电荷，在电场中都向正极移动。由于血清中各 种蛋白质在同一种蛋白质在同一 pH 环境中所带负电荷的量不同，又由环境中所带负电荷的量不同，又由 于其分子大小不同，所以在电场中泳动速度也不同。分于其分子大小不同，所以在电场中泳动速度也不同。分 子子
8、_而带电荷而带电荷_者，泳动速度较者，泳动速度较_；反之，则泳；反之，则泳 动速度动速度_。因此通过电泳可将血清蛋白分为。因此通过电泳可将血清蛋白分为 5 条条 区带，从正极端依次分为清蛋白、区带，从正极端依次分为清蛋白、1球蛋白、球蛋白、2球球 蛋白、蛋白、球蛋白和球蛋白和 球蛋白，经染色可计算出各蛋白球蛋白，经染色可计算出各蛋白 质含量的百分数。质含量的百分数。 较慢较慢 电泳现象电泳现象 小小 多多 快快 2实验步骤实验步骤 实验实验 步骤步骤 操作方法操作方法 配制配制 试剂试剂 配制配制_、染色液、漂洗液、染色液、漂洗液、 透明液透明液 架滤架滤 纸桥纸桥 取双层滤纸条，一端与支架前
9、沿对齐，另一取双层滤纸条，一端与支架前沿对齐，另一 端浸入端浸入_的的_， 待滤纸条， 待滤纸条 湿润后，驱除湿润后，驱除_，使滤纸紧贴于支架，使滤纸紧贴于支架 上上 用镊子夹取醋酸纤维薄膜， 识别出用镊子夹取醋酸纤维薄膜， 识别出_， 并在并在_的一角用笔做上记号， 然后的一角用笔做上记号， 然后 放在巴比妥缓冲液中浸泡放在巴比妥缓冲液中浸泡 20 min 巴比妥缓冲液巴比妥缓冲液 电泳槽电泳槽 缓冲液缓冲液 气泡气泡 浸泡浸泡 薄膜薄膜 光泽面光泽面 光泽面光泽面 取出薄膜，吸去多余的液体，平铺在玻璃板上，取出薄膜，吸去多余的液体，平铺在玻璃板上， 有记号的一面朝下。点样时用盖玻片在血清中
10、蘸有记号的一面朝下。点样时用盖玻片在血清中蘸 一下，在离薄膜一端一下，在离薄膜一端 23 cm 处轻轻按下，随即处轻轻按下，随即 提起提起 平悬平悬 薄膜薄膜 用镊子夹取薄膜将点样端平贴在电泳槽负极支架用镊子夹取薄膜将点样端平贴在电泳槽负极支架 的的“_”上，有上，有_的一面朝上，另一的一面朝上，另一 端端_于正极，呈于正极，呈_状态状态 盖上电泳槽盖，电泳盖上电泳槽盖，电泳 6090 min 染色染色 取下薄膜，放入取下薄膜，放入_中浸泡中浸泡 510 min 取出薄膜，在漂洗液中漂洗数次，直至蛋白质区取出薄膜，在漂洗液中漂洗数次，直至蛋白质区 _为止为止 用滤纸压平并吸干薄膜后，再浸入透明
11、液中约用滤纸压平并吸干薄膜后，再浸入透明液中约 5 min。取出后平贴于玻璃板上，干燥后成透明膜。取出后平贴于玻璃板上，干燥后成透明膜 脱色脱色 细心细心 点样点样 滤纸桥滤纸桥 记号记号 平贴平贴 绷直绷直 实施电泳实施电泳 染色液染色液 漂洗漂洗 底色脱净底色脱净 3. 实验结果实验结果 4优点和应用优点和应用 醋酸纤维薄膜电泳具有醋酸纤维薄膜电泳具有_、_、简便、简便、 _等优点， 广泛应用于血清蛋白、 血红蛋白、等优点， 广泛应用于血清蛋白、 血红蛋白、 糖蛋白等的分离和鉴定。糖蛋白等的分离和鉴定。 分辨率高分辨率高 微量微量 快速快速 归纳提炼归纳提炼 关于血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的
12、几点说明关于血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的几点说明 (1)薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。 (2)点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，吸水量点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，吸水量 以不干不湿为宜。以不干不湿为宜。 (3)点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或 印出凹陷影响电泳区带分离效果。印出凹陷影响电泳区带分离效果。 (4)点样应点在薄膜的毛面上点样应点在薄膜的毛面上,点样量要适中点样量要适中,不宜过多或过少。不宜过多或过少。 (5)电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样面电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样面 向下。向下。 (6)应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短， 着色不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进行复染。着色不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进行复染。
