1、、FOLIN酚法与考马斯亮蓝G-250法的比较 蛋白质的定量测定技术 利用软件制作标准曲线求出近似公式 蛋白质含量的计算 两种方法的比较蛋白质检测及含量的测定一、化学检测1、凯氏定氮法（Kjeldahl)：蛋白质中含氮量几乎是恒定的，平均含氮量为16%，只要测出蛋白质的含氮量，乘以6.25，即为蛋白质的含量。蛋白质+硫酸硫酸铵；然后碱化蒸馏使氨游离，硼酸吸收氨后，以标准酸滴定。灵敏度0.21.0mg。2、双缩脲法：蛋白质分子具有许多肽键，在碱性溶液中能与铜离子络合呈紫红色，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比。本法测定蛋白质溶液范围110mg,常用于需要快速但不需要十分精确的测定。3、Folin-酚试
2、剂法（Lowry）：利用蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基（酚基）与还原酚试剂（磷钨酸-磷钼酸）起蓝色反应。1951 年，Lowry 对此法进行了改进，先于检测样品中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提高了灵敏度。灵敏度1g。4、与染料的呈色反应：与氨基黑和考马斯亮蓝结合呈色，与考马斯亮蓝的呈色反应在一定浓度范围内可进行定量测定。灵敏度15g。二、光学检测1、荧光检测：常用的有邻苯二甲醛（OPT）法，当有强还原剂如巯基乙醇、二巯基苏糖醇等存在下，与氨基酸或肽反应产生强荧光性化合物，其激发波长为340nm,荧光波长为455nm，产物稳定，可用于氨基酸自动分析系统。2、紫外光检测：蛋白质分子中具有芳香簇氨
3、基酸残基，因此，对280nm的紫外光有最大吸收。且成正比符合Beer定律。不消耗样品，标准蛋白质与样品蛋白质的结构尽量相似。灵敏度10g。易受其它因素干扰（尿素、胆红素），需将蛋白质分离纯化后再测。三、免疫化学检测利用抗原抗体反应的一系列检测方法。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：实验对测定所要求的灵敏度和精确度；蛋白质的性质；溶液中存在的干扰物质；测定所要花费的时间。FOLIN-酚试剂法的原理和操作方法酚试剂法的原理和操作方法l又称Lowry法，利用的是蛋白质的官能基团与双缩脲和苯酚试剂的化学反应呈色现象，测定范围是25-250g蛋白质。lFolin酚试剂由甲试剂
4、和乙试剂组成。紫红色铜双缩脲复合物分子结构紫红色铜双缩脲复合物分子结构 蛋白样品与碱性铜（试剂甲）的反应l甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物。蛋白样品与试剂乙的反应l 乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸，硫酸，溴等组成。此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。l 此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。干干 扰扰 因因 素素 干扰双缩脲反应的基团，如-CO-NH2,-CH2-NH2,-CS-NH2以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂，如Tris缓冲剂以及蔗糖，硫酸铵，巯基化
5、合物均可干扰Folin酚反应。此外，所测蛋白质样品中若含酚类及柠檬酸均有干扰作用。浓度较低的尿素(约0.5左右)、胍(0.5左右)、硫酸钠(1)、硝酸钠(1)、三氯乙酸(0.5)、乙醇(5)、乙醚(5)、丙酮(0.5)等溶液对显色无影响。这些物质浓度高时，必须做校正曲线。若样品酸度较高，显色后色浅，则必须提高碳酸钠-氢氧化钠溶液的浓度1-2倍。FOLIN-酚试剂法的操作方法 操作方法（参考教材）：第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，如此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2
6、支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，如此类推。待最后一支试管加完试剂后，30放置15分钟，然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。注意事项：试剂乙只有在酸性条件下稳定，所以与甲试剂蛋白混合液混 时要迅速，以便在磷钼酸磷钨酸被破坏前，还原反应能发生。Folin酚试剂法实验表格酚试剂法实验表格管号 1 2 3 4 5 6 白菜抽提液标准蛋白质 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 （250g/ml）未知蛋白质 0.2 0.5 蒸馏水 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.5 试剂甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 混匀，于室温放置10mi
7、n。试剂乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 充分混匀后，于30反应15分钟。吸光度值（A650）每管中蛋白质的量（g）考马斯亮蓝G-250法原理和操作方法考马斯亮蓝G-250（Coomassia Brilliant BlueG-250简称CBG）法，利用的是通过蛋白质与染料结合呈色现象，测定范围10-100 g蛋白质；影响染料变色的物质，如酸、碱，氧化剂，去污剂等；在蛋白质含量高的时候线性关系出现偏差，并且不同蛋白质与色素结合状况有差异。操作方法参考教材，注意表格中加入标准蛋白的量有改动。注意事项：加入考马斯亮蓝试剂后，充分混匀，室温放置或等待测定时，要尽可能避光。尽可
8、能使每只管的反应时间和条件相同。考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法实验表格实验表格管号 1 2 3 4 5 6 白菜抽提液标准蛋白质溶液 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 （250g/ml）未知浓度蛋白质 0.2 0.5 蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.8 0.5考马斯亮蓝G250试剂 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 吸光度值（A595）每管中蛋白质的量（g）标准曲线的制作思 考1、蛋白质样品和呈色剂都不应有沉淀，有沉淀应过滤除去。2、染料与蛋白质结合后，形成的蓝色复合物易轻度沾附试管壁或比色皿，每次使用不能用有着色的比色皿。使用完后应立即清洗干静。3、分别计算出两种方法测得的小白菜中蛋白质的含量（单位：mg/ml），比较二者的结果，说明有什么不同（混合蛋白质溶解物中可能含有什么物质）？4、测定植物材料中蛋白质含量时，上述两种方法你会选择哪一种？
