1、植物种质资源植物种质资源的离体保存的离体保存 第十二章第十二章知识要求知识要求 n了解植物种质离体保存的类型与特点；了解植物种质离体保存的类型与特点；n了解超低温保存的特点与方法；了解超低温保存的特点与方法；n掌握植物种质低温保存的基本操作技术。掌握植物种质低温保存的基本操作技术。概念：概念：种质：种质：是决定生物遗传性状，并将遗传信息从亲代是决定生物遗传性状，并将遗传信息从亲代传递给子代的遗传物质。传递给子代的遗传物质。种质库：种质库：是指以种为单位的群体内的全部遗传物质，是指以种为单位的群体内的全部遗传物质，它有许多个体的不同基因所组成，又称基因库。它有许多个体的不同基因所组成，又称基因库
2、。种质资源：种质资源：具有种质并能繁殖的生物体统称为种质具有种质并能繁殖的生物体统称为种质资源或遗传资源。资源或遗传资源。n植物种质资源保存具体方法很多，植物种质资源保存具体方法很多，大体可分为两大体可分为两大类。大类。按按保存的地理位置保存的地理位置分为原地保存和异地保分为原地保存和异地保存（原生境保存和非原生境保存）。存（原生境保存和非原生境保存）。n一类是一类是原境保存原境保存，为此建立自然保护区、天然公，为此建立自然保护区、天然公园或就地保护处于危险或受威胁的植物；园或就地保护处于危险或受威胁的植物；n另一类是另一类是异境保存异境保存，为此需要建立各种基因库，为此需要建立各种基因库，如
3、种子园、种植园等田间基因库及种子库、花粉如种子园、种植园等田间基因库及种子库、花粉库等离体基因库。库等离体基因库。按照按照保存的具体方法保存的具体方法,品种资源的保存可分为种植保品种资源的保存可分为种植保存、贮藏保存、试管保存、基因文库保存。存、贮藏保存、试管保存、基因文库保存。1.1.种植保存种植保存 为了保持品种资源的种子或无性繁殖器官的生活为了保持品种资源的种子或无性繁殖器官的生活力力 ,并不断补充其数量，品种资源材抖须每隔一定时并不断补充其数量，品种资源材抖须每隔一定时间播种一次，即种植保存。间播种一次，即种植保存。在种植保存时，种植条件尽可能与原产地相似，以在种植保存时，种植条件尽可
4、能与原产地相似，以减少由于生态条件的改变而引起的变异和自然选择的影减少由于生态条件的改变而引起的变异和自然选择的影响。在种植过程中应尽可能避免或减少天然杂交和人为响。在种植过程中应尽可能避免或减少天然杂交和人为混杂。播种和收获时取样要有代表性以免因抽样而造成混杂。播种和收获时取样要有代表性以免因抽样而造成遗传漂移。总之要尽可能地保持原品种或类型的遗传特遗传漂移。总之要尽可能地保持原品种或类型的遗传特点和群体结构。此外，对来自自然条件悬殊地区的品种点和群体结构。此外，对来自自然条件悬殊地区的品种资源，可分别在不同生态地点异地种植保存。资源，可分别在不同生态地点异地种植保存。2 2、贮藏保存贮藏保
5、存 贮藏保存就是用控制贮藏条件贮藏保存就是用控制贮藏条件 (主要是温度和主要是温度和湿度湿度 )的方法，来保持品种资源种子的生活力。的方法，来保持品种资源种子的生活力。长期贮藏保存种子生活力的技术关键是低温和长期贮藏保存种子生活力的技术关键是低温和干燥，通过控制种子周围环境中的温湿度，迫使种干燥，通过控制种子周围环境中的温湿度，迫使种子处于代谢作用的最低限度。子处于代谢作用的最低限度。贮藏保存种质资源采用种质库，种质库分三种：贮藏保存种质资源采用种质库，种质库分三种：长期库、中期库和短期库。长期库、中期库和短期库。3 3、基因文库保存、基因文库保存 利用利用DNADNA重组技术，将种质材料的总
6、重组技术，将种质材料的总DNADNA或染或染色体所有片断随机连接到载体上，然后转移到色体所有片断随机连接到载体上，然后转移到寄主细胞中，通过细胞增殖，构成各个寄主细胞中，通过细胞增殖，构成各个DNADNA片断片断的克隆系。的克隆系。野外保存植物种质资源需要大量的土地和人力资源，成本高，且易遭受各种自然灾害的侵袭。种子库只能保存正常型种子，对于顽拗型、脱水敏感的种子和有性繁殖困难的植物则无能为力，而且种子库仅能保存基因，而不能保存特定的基因型材料。4.种质资源的离体保存种质资源的离体保存定义定义n植物种质离体保存：植物种质离体保存：是指对是指对离体培养离体培养的小植株、的小植株、器官、组织、细胞
7、或原生质等材料，采用器官、组织、细胞或原生质等材料，采用限制限制、延缓延缓或或停止停止其生长的处理使之保存，在需要时可其生长的处理使之保存，在需要时可重新恢复其生长，并再生植株的方法。重新恢复其生长，并再生植株的方法。n自自1975年年Henshaw和和Morel 首次提出首次提出离体保存离体保存(conservation in vitro)植物种质的策略以来，该项植物种质的策略以来，该项技术受到植物界的极度重视。技术受到植物界的极度重视。意义：意义：n所占空间少，节省大量的人力、物力和土地；所占空间少，节省大量的人力、物力和土地；n便于种质资源的交流利用；便于种质资源的交流利用；n需要时，可
8、以用离体培养方法很快大量繁殖；需要时，可以用离体培养方法很快大量繁殖；n避免自然灾害引起的种质丢失。避免自然灾害引起的种质丢失。缺点：缺点：n对于限制或延缓生长的处理，需定期转移，连续对于限制或延缓生长的处理，需定期转移，连续继代培养；继代培养；n易受微生物污染或发生人为差错；易受微生物污染或发生人为差错；n多次继代培养有可能造成遗传性变异及材料和分多次继代培养有可能造成遗传性变异及材料和分化和再生能力的降低。化和再生能力的降低。超低温保存可在一定程度上避免这些问题。超低温保存可在一定程度上避免这些问题。n常用的离体保存方法有常用的离体保存方法有缓慢生长保存缓慢生长保存(slow growth
9、 conservation)和和超低温保存超低温保存(cryopreservation)。前者适合中短期保存，前者适合中短期保存，后者用于长期保存。后者用于长期保存。（一）缓慢生长保存（一）缓慢生长保存 n缓慢生长保存是通过调节培养条件，抑制保存材缓慢生长保存是通过调节培养条件，抑制保存材料生长，实现延长继代时间，减少操作和节省劳料生长，实现延长继代时间，减少操作和节省劳力的保存方法。力的保存方法。n影响离体保存的因素有保存时的光照、温度、湿影响离体保存的因素有保存时的光照、温度、湿度、季节变化，培养基中生长调节物质，种质资度、季节变化，培养基中生长调节物质，种质资源的地理分布和生态类型等，可
10、以根据具体材料源的地理分布和生态类型等，可以根据具体材料采取不同的方法来延缓其生长。采取不同的方法来延缓其生长。1降低培养温度降低培养温度n降低培养温度是植物组织培养物缓慢生长保存最降低培养温度是植物组织培养物缓慢生长保存最常用的方法。常用的方法。n葡萄和草莓茎尖培养物分别在葡萄和草莓茎尖培养物分别在99和和44下连续保存多年，下连续保存多年，每年仅需继代一次。每年仅需继代一次。n梨试管苗在梨试管苗在44下，每下，每2 2年继代一次，保存后，材料田间生年继代一次，保存后，材料田间生长正常。长正常。n芋头茎培养物在芋头茎培养物在99，黑暗条件下保存，黑暗条件下保存3 3年，仍有年，仍有100%1
11、00%的存的存活率。活率。n正确选择适宜低温是保存后高存活率的关键。正确选择适宜低温是保存后高存活率的关键。2 培养基中添加生长调节物质培养基中添加生长调节物质n常规组织培养是在培养基中添加生长素或细胞分常规组织培养是在培养基中添加生长素或细胞分裂素以促进外植体的生长和发育。而试管苗种质裂素以促进外植体的生长和发育。而试管苗种质保存添加的则是保存添加的则是生长延缓剂生长延缓剂或或生长抑制剂生长抑制剂来抑制来抑制保存材料的生长，延长其继代周期。保存材料的生长，延长其继代周期。n离体保存常用的生长调节物质有离体保存常用的生长调节物质有ABA(脱落酸脱落酸)、CCC(矮壮素矮壮素)、PP333(多效
12、唑多效唑)、B9(比久比久)、MH(青鲜素青鲜素)等。等。nABAABA对草莓试管苗芽增殖的抑制作用随对草莓试管苗芽增殖的抑制作用随ABAABA使用浓度的增加使用浓度的增加而明显增强，且均存在显著性差异。在草莓试管苗的离体而明显增强，且均存在显著性差异。在草莓试管苗的离体保存中，多效唑对草莓试管苗芽的分化有明显的促进作用，保存中，多效唑对草莓试管苗芽的分化有明显的促进作用，对草莓试管苗芽的伸长具有明显的抑制作用。对草莓试管苗芽的伸长具有明显的抑制作用。3 提高培养基渗透压提高培养基渗透压n提高培养基的渗透压可抑制培养材料的生长。提高培养基的渗透压可抑制培养材料的生长。n最常用的方法是在培养基中
13、加入甘露醇、醇等。最常用的方法是在培养基中加入甘露醇、醇等。这类化合物是惰性物质，不易被外植体吸收，抑这类化合物是惰性物质，不易被外植体吸收，抑制外植体生长的作用持久。制外植体生长的作用持久。n其作用机理是提高培养基的渗透势负值，造成水其作用机理是提高培养基的渗透势负值，造成水分逆境，降低细胞扩大生长所必需的膨压，使细分逆境，降低细胞扩大生长所必需的膨压，使细胞吸水困难，减弱新陈代谢，延缓细胞生长，同胞吸水困难，减弱新陈代谢，延缓细胞生长，同时细胞壁酶的活性受到抑制，生长受阻，减少了时细胞壁酶的活性受到抑制，生长受阻，减少了养分消耗。养分消耗。4适宜的光照强度适宜的光照强度n光因子对植物的光合
14、作用和生长有着重要的影响。光因子对植物的光合作用和生长有着重要的影响。n调节光照强度以达到最佳的保存效果也是种质保调节光照强度以达到最佳的保存效果也是种质保存经常使用的方法之一。存经常使用的方法之一。n在较弱光照条件下，培养材料由于光合作用弱，在较弱光照条件下，培养材料由于光合作用弱，生长缓慢而利于保存。生长缓慢而利于保存。5合适的包扎物合适的包扎物n试管的包扎物也对保存材料的生长有影响，主要试管的包扎物也对保存材料的生长有影响，主要表现在不同的封口材料对试管中气体成分及其含表现在不同的封口材料对试管中气体成分及其含量等的变化，培养基的风干、污染等有不同程度量等的变化，培养基的风干、污染等有不
15、同程度的影响。因此，选择合适的包扎物对保存效果的的影响。因此，选择合适的包扎物对保存效果的影响很大。影响很大。n辛淑英（辛淑英（1989）在甘薯种质的保存研究中发现，）在甘薯种质的保存研究中发现，以以铝箔铝箔封口保存效果最佳，保持湿度效果好，还封口保存效果最佳，保持湿度效果好，还可以防止污染，而使用可以防止污染，而使用棉塞棉塞时间过长容易造成污时间过长容易造成污染染;使用使用橡皮塞橡皮塞容易造成缺氧，使材料死亡。容易造成缺氧，使材料死亡。6培养基的营养控制培养基的营养控制n植物生长发育依赖外界养分的供给，如果养分供植物生长发育依赖外界养分的供给，如果养分供应不足，植物生长缓慢，植株矮小。因此采
16、用应不足，植物生长缓慢，植株矮小。因此采用降降低培养基中的养分水平低培养基中的养分水平也可有效地抑制细胞生长，也可有效地抑制细胞生长，达到保存的目的。达到保存的目的。n如菠萝种质在不添加任何生长调节剂的如菠萝种质在不添加任何生长调节剂的1/2MS培培养基中保存养基中保存12个月后存活率为个月后存活率为92.2%，小苗的平，小苗的平均生长量只有均生长量只有1cm左右；保存苗转入分化培养基左右；保存苗转入分化培养基后，很快恢复生长并分化出丛生芽，在同一培养后，很快恢复生长并分化出丛生芽，在同一培养基中保存基中保存18个月后仍有个月后仍有85.7%的存活。的存活。7 降低培养环境中的氧气浓度降低培养
17、环境中的氧气浓度n通过降低培养材料周围的大气压力或氧含量来保通过降低培养材料周围的大气压力或氧含量来保存植物组织培养材料，这一想法最早是由存植物组织培养材料，这一想法最早是由Caplin（1959）提出的。近）提出的。近10年这方面的研究比较少。年这方面的研究比较少。n而权银等（而权银等（1989）在柑橘种质离体保存中对不同）在柑橘种质离体保存中对不同封口材料的比较研究表明，封口材料以其透气性封口材料的比较研究表明，封口材料以其透气性能影响试管内气体成分，从而影响保存效果。能影响试管内气体成分，从而影响保存效果。第二节第二节 超低温保存超低温保存 一、超低温保存概述一、超低温保存概述n通常将通
18、常将-80以下的温度称为超低温。超低温冷冻以下的温度称为超低温。超低温冷冻保存一般以液氮为冷源，使温度维持在保存一般以液氮为冷源，使温度维持在-196。n超低温通常指低于超低温通常指低于-80 的低温的低温，保存介质或容保存介质或容器有干冰器有干冰(-79)、超低温冰箱超低温冰箱(-80-150)、液、液氮氮(-196)和液氮蒸气相和液氮蒸气相(-140)等等，其中液氮最其中液氮最常用。常用。n生物材料在如此低温下，活细胞内的新陈代谢和生物材料在如此低温下，活细胞内的新陈代谢和生长活动几乎完全停止，处于生理停顿状态，因生长活动几乎完全停止，处于生理停顿状态，因而可使植物材料在该温度下不会发生遗
19、传性状的而可使植物材料在该温度下不会发生遗传性状的改变，但细胞活力和形态发生的潜能可保存。改变，但细胞活力和形态发生的潜能可保存。n超低温保存技术可极大地延长储存材料的寿命；超低温保存技术可极大地延长储存材料的寿命；n避免细胞和组织的染色体数目因长期继代而发生避免细胞和组织的染色体数目因长期继代而发生的变异；的变异；n避免了离体材料在长期无性繁殖过程中可能造成避免了离体材料在长期无性繁殖过程中可能造成的退化和病虫侵害；的退化和病虫侵害；n可有效、安全地长期保存那些珍贵稀有的种质。可有效、安全地长期保存那些珍贵稀有的种质。二、超低温保存的研究概况二、超低温保存的研究概况n1.超低温保存技术的发展
20、超低温保存技术的发展低温干燥；减压；超低温低温干燥；减压；超低温自从自从19731973年年NagNag等首次成功地超低温保存了胡萝卜悬浮等首次成功地超低温保存了胡萝卜悬浮细胞以来，国内外已对近细胞以来，国内外已对近200200种植物材料进行了超低温种植物材料进行了超低温保存。保存。n2.用于离体超低温保存的植物材料用于离体超低温保存的植物材料种子、胚、胚轴和体细胞胚种子、胚、胚轴和体细胞胚n保存常用干冻法保存常用干冻法 茎尖和分生组织茎尖和分生组织n大多用玻璃化法或包埋脱水法大多用玻璃化法或包埋脱水法n3.超低温保存的植物种类超低温保存的植物种类n超低温保存已涉及到不同的植物种类，如野生及超
21、低温保存已涉及到不同的植物种类，如野生及人工创造的谷类、豆类、薯类、油类、糖类、纤人工创造的谷类、豆类、薯类、油类、糖类、纤维类、蔬菜类、果树、树木、药用植物和藻类等。维类、蔬菜类、果树、树木、药用植物和藻类等。超低温冷冻保存为什么没有把细胞冻死？超低温冷冻保存为什么没有把细胞冻死？n细胞冰冻结冰保护性脱水理论细胞冰冻结冰保护性脱水理论n溶液的玻璃化理论溶液的玻璃化理论三、植物超低温冻存的细胞学基础三、植物超低温冻存的细胞学基础细胞冰冻结冰保护性脱水理论细胞冰冻结冰保护性脱水理论n常温下，细胞及其溶液处于渗透平衡的状态，当温度降到常温下，细胞及其溶液处于渗透平衡的状态，当温度降到冰点以下时，首
22、先是细胞外溶液部分冰点以下时，首先是细胞外溶液部分“冻结冻结”出冰；胞外出冰；胞外溶液的浓度升高，破坏了细胞内外溶液的平衡，水分由胞溶液的浓度升高，破坏了细胞内外溶液的平衡，水分由胞内通过细胞膜向外渗透，细胞收缩，细胞内浓度提高；当内通过细胞膜向外渗透，细胞收缩，细胞内浓度提高；当温度不断降低时，冻结和渗透过程不断进行，这种过程温度不断降低时，冻结和渗透过程不断进行，这种过程称称为保护性脱水为保护性脱水。n当复温时，温度升高，冻结的冰不断融化，水分由胞外向当复温时，温度升高，冻结的冰不断融化，水分由胞外向胞内渗透，使收缩的细胞膨胀，可能恢复原状。胞内渗透，使收缩的细胞膨胀，可能恢复原状。n精确
23、控制上述过程，能使细胞在降温、复温、渗透过程中精确控制上述过程，能使细胞在降温、复温、渗透过程中不被损伤而死亡。不被损伤而死亡。溶液的玻璃化理论溶液的玻璃化理论n溶液在降温时，如果没有均一晶核或晶核生长缺乏足够的溶液在降温时，如果没有均一晶核或晶核生长缺乏足够的时间，就首先形成过冷溶液。继续降温，均一晶核形成。时间，就首先形成过冷溶液。继续降温，均一晶核形成。如果降温速度不够快，就形成尖锐的冰晶。如果降温速度不够快，就形成尖锐的冰晶。降温速度足够降温速度足够快快，均一晶核很少或几乎没有形成，或均一晶核生长缺乏，均一晶核很少或几乎没有形成，或均一晶核生长缺乏足够的时间，溶液就进入无定型的玻璃化状
24、态。它是一种足够的时间，溶液就进入无定型的玻璃化状态。它是一种透明的固态，与液态相比，分子没有发生重排，因此与晶透明的固态，与液态相比，分子没有发生重排，因此与晶态不同。被称为玻璃态，此时的温度叫玻璃化形成温度。态不同。被称为玻璃态，此时的温度叫玻璃化形成温度。在玻璃化形成过程中，既没有溶液效应对细胞的损伤，也在玻璃化形成过程中，既没有溶液效应对细胞的损伤，也没有冰晶的形成对细胞造成的机械伤害。没有冰晶的形成对细胞造成的机械伤害。提高超低温冷冻保存的措施提高超低温冷冻保存的措施n由于植物细胞含水量比动物细胞高，冰冻保存由于植物细胞含水量比动物细胞高，冰冻保存难度大，如果直接将保存材料放入液氮中
25、，组难度大，如果直接将保存材料放入液氮中，组织和细胞由于细胞内水分结冰，引起组织和细织和细胞由于细胞内水分结冰，引起组织和细胞死亡，因而，超低温保存的植物材料必须借胞死亡，因而，超低温保存的植物材料必须借助于冷冻防护剂助于冷冻防护剂(cryoprotectant)。冷冻防护剂冷冻防护剂n防护机理：防护机理：n在水溶液中能强烈地结合水分子，水合作用的结果使溶液在水溶液中能强烈地结合水分子，水合作用的结果使溶液的黏稠度增加。当温度下降时，溶液冰点下降，即冰的结的黏稠度增加。当温度下降时，溶液冰点下降，即冰的结晶中心增长速度下降，使水的固化程度减弱。因而对于降晶中心增长速度下降，使水的固化程度减弱。
26、因而对于降低培养基冰点和植物组织、细胞冰点起重要作用。低培养基冰点和植物组织、细胞冰点起重要作用。n冷冻防护剂的使用提高了培养基渗透压，导致细胞的轻微冷冻防护剂的使用提高了培养基渗透压，导致细胞的轻微质壁分离，相对提高了组织和细胞的抗寒力。质壁分离，相对提高了组织和细胞的抗寒力。常用的冷冻防护剂常用的冷冻防护剂n渗透型冷冻防护剂渗透型冷冻防护剂:n多为小分子中性物质，在溶液中易结合水分子发生水合作多为小分子中性物质，在溶液中易结合水分子发生水合作用，使溶液粘性增加，弱化水的结晶过程，达到保护的目用，使溶液粘性增加，弱化水的结晶过程，达到保护的目的。的。n包括包括p二甲基亚砜（二甲基亚砜（DMS
27、O）（极易渗入细胞内部，可防止）（极易渗入细胞内部，可防止细胞在冷冻和融冰时，引起过度脱水而遭受破坏）细胞在冷冻和融冰时，引起过度脱水而遭受破坏）p甘油甘油p甘露醇甘露醇p脯氨酸脯氨酸p乙二醇乙二醇p丙二醇丙二醇n非渗透型冰冻保护剂非渗透型冰冻保护剂:n是聚合分子物质，能溶于水，但不能进入细胞，它使溶液呈是聚合分子物质，能溶于水，但不能进入细胞，它使溶液呈过冷状态，从而起到保护作用。此类冰冻保护剂对快速、慢过冷状态，从而起到保护作用。此类冰冻保护剂对快速、慢速冷却均有保护效果。速冷却均有保护效果。n常见的：常见的：p聚乙烯吡咯烷酮聚乙烯吡咯烷酮(Polyvingyl pyrollidone,P
28、VP)p葡聚糖葡聚糖(Dextrane)p聚乙二醇聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)p羟乙基淀粉羟乙基淀粉(Hydroxyethyl starch,HES)四、超低温保存的方法四、超低温保存的方法超低温保存的基本操作程序为：超低温保存的基本操作程序为：选择适宜年龄和生长状态的冷冻材料；选择适宜年龄和生长状态的冷冻材料；对生物材料进行预处理，提高分裂细胞的比例对生物材料进行预处理，提高分裂细胞的比例和减少细胞内自由水的含量，使材料达到最适和减少细胞内自由水的含量，使材料达到最适生理状态；生理状态；将材料装入试管或其他保存容器中，放入冰浴将材料装入试管或其他保存容器中，放入
29、冰浴中；中；在冰浴条件下加入在冰浴条件下加入0预冷的冷冻保护剂，冰浴预冷的冷冻保护剂，冰浴放置放置3045min；采用不同的降温冰冻方式进行冷冻，直至最后采用不同的降温冰冻方式进行冷冻，直至最后放入液氮中，并在液氮中停留至少放入液氮中，并在液氮中停留至少1h；保存后的化冻，一般采取在保存后的化冻，一般采取在3740温水浴中温水浴中快速化冻；快速化冻；材料化冻后的活力鉴定，进行再培养，观察恢材料化冻后的活力鉴定，进行再培养，观察恢复生长的速度及植株的再生能力，分析冻后材复生长的速度及植株的再生能力，分析冻后材料或再生植株的遗传性状。料或再生植株的遗传性状。1.材料的选择和预处理材料的选择和预处理
30、n由于植物的基因型、抗冻性以及器官、组织和细由于植物的基因型、抗冻性以及器官、组织和细胞的年龄、生理状态等因素对超低温保存的效果胞的年龄、生理状态等因素对超低温保存的效果有较大的影响。有较大的影响。n一般来说，体积小、细胞质稠密、无液泡、薄壁一般来说，体积小、细胞质稠密、无液泡、薄壁的小分生细胞的存活率高于含大量液泡的大细胞；的小分生细胞的存活率高于含大量液泡的大细胞；茎尖生长点、愈伤组织等培养物，解冻后只有具茎尖生长点、愈伤组织等培养物，解冻后只有具有上述特征的细胞才能存活。而较大的植物材料，有上述特征的细胞才能存活。而较大的植物材料，如茎尖、胚或试管苗等，由于高度液泡化的细胞如茎尖、胚或试
31、管苗等，由于高度液泡化的细胞易受损伤，冷冻后只有分生细胞能够重新生长。易受损伤，冷冻后只有分生细胞能够重新生长。n为了使保存材料达到超低温保存所要求的生理特为了使保存材料达到超低温保存所要求的生理特性，还要对材料进行预处理，总的原则是提高细性，还要对材料进行预处理，总的原则是提高细胞分裂与分化的同步化，减少细胞内自由水的含胞分裂与分化的同步化，减少细胞内自由水的含量，增强细胞抗寒力。量，增强细胞抗寒力。n目前主要有目前主要有3种预处理方式：种预处理方式：n（1）低温锻炼）低温锻炼 激活植物体内抗寒机制激活植物体内抗寒机制n（2）继代培养）继代培养 增加有丝分裂细胞数目增加有丝分裂细胞数目n（3
32、）预培养）预培养 培养基中加冷冻保护剂或诱导抗寒力物质培养基中加冷冻保护剂或诱导抗寒力物质2.冰冻方法冰冻方法n降温冰冻方法是影响超低温保存效果的关键因素降温冰冻方法是影响超低温保存效果的关键因素之一。之一。（1）快速冰冻法）快速冰冻法n将材料从将材料从0或预处理温度直接投入液氮，其降温速度在或预处理温度直接投入液氮，其降温速度在1000/min以上。这个过程可以使细胞内的水分子还未以上。这个过程可以使细胞内的水分子还未来得及形成结晶中心就降到了来得及形成结晶中心就降到了-196的安全温度，从而的安全温度，从而避免了细胞内结冰的危险。此法适用于那些高度脱水的材避免了细胞内结冰的危险。此法适用于
33、那些高度脱水的材料，如种子等。料，如种子等。（2）慢速冰冻法）慢速冰冻法n采用逐步降温的方法，以采用逐步降温的方法，以0.52/min的降温速度，从的降温速度，从0降到降到-30，-35或或-40，随即投入液氮，或者以此降，随即投入液氮，或者以此降温速度连续降温到温速度连续降温到-196。逐步降温过程可以使细胞内。逐步降温过程可以使细胞内水分有充足的时间不断流到细胞外结冰，从而使细胞内水水分有充足的时间不断流到细胞外结冰，从而使细胞内水分含量减少到最低限度，达到良好的脱水效果，避免细胞分含量减少到最低限度，达到良好的脱水效果，避免细胞内结冰。这种方法适合于液泡化程度较高的植物材料，如内结冰。这
34、种方法适合于液泡化程度较高的植物材料，如悬浮细胞、原生质体等。悬浮细胞、原生质体等。（3）分步冰冻法）分步冰冻法n此法将快速和慢速此法将快速和慢速2种冰冻方法结合起来。首先用较慢的种冰冻方法结合起来。首先用较慢的速度（速度（0.54/min）使植物材料从）使植物材料从0降至一定的预冷降至一定的预冷温度（一般为温度（一般为-40）并停留一段时间（一般）并停留一段时间（一般10min左左右），使细胞进行适当的保护性脱水，然后再浸入液氮冷右），使细胞进行适当的保护性脱水，然后再浸入液氮冷冻。冻。（4）逐级冰冻法）逐级冰冻法n植物材料经过冷冻保护剂植物材料经过冷冻保护剂0预处理后，逐级通过预处理后，逐
35、级通过-10，-15，-25，-35，-40等，每个温度停留等，每个温度停留10 min左右，左右，然后浸入液氮。然后浸入液氮。（5）干燥冰冻法）干燥冰冻法n将样品在含高浓度渗透性化合物（如甘油、糖类物质等）将样品在含高浓度渗透性化合物（如甘油、糖类物质等）培养基上培养一段时间，或者经硅胶、无菌空气干燥脱水培养基上培养一段时间，或者经硅胶、无菌空气干燥脱水数小时，或者用褐藻酸钙液泡包裹样品，无菌风进一步干数小时，或者用褐藻酸钙液泡包裹样品，无菌风进一步干燥，然后直接投入液氮；燥，然后直接投入液氮；n或者用冷冻保护剂处理后吸除表面水分，密封于金箔中进或者用冷冻保护剂处理后吸除表面水分，密封于金箔
36、中进行慢冻。行慢冻。n只要脱水足够，细胞内溶液浓度即可达到较高水平因而易只要脱水足够，细胞内溶液浓度即可达到较高水平因而易进入玻璃化状态。这种方法对某些植物的愈伤组织、体细进入玻璃化状态。这种方法对某些植物的愈伤组织、体细胞胚、胚轴、胚、花粉、茎尖及试管苗等较合适，但对大胞胚、胚轴、胚、花粉、茎尖及试管苗等较合适，但对大多数对脱水敏感的材料不适用。多数对脱水敏感的材料不适用。（6）脱水冰冻法）脱水冰冻法n将植物材料先用含有甘油和糖类的冷冻保护剂进行渗透脱将植物材料先用含有甘油和糖类的冷冻保护剂进行渗透脱水，再置于水，再置于-20-30的冷藏库内冻结脱水，然后立即的冷藏库内冻结脱水，然后立即投入
37、液氮中迅速冷冻。投入液氮中迅速冷冻。（7）玻璃化法）玻璃化法n在投入液氮前，使用高浓度的冰冻保护剂，或称之为玻璃在投入液氮前，使用高浓度的冰冻保护剂，或称之为玻璃化液，在化液，在25或或4下处理一段时间（一般下处理一段时间（一般1060min）。）。玻璃化法的主要程序为：选择适宜的材料；材料的预玻璃化法的主要程序为：选择适宜的材料；材料的预培养；装载液处理；在培养；装载液处理；在0或或25下用玻璃化液下用玻璃化液（PVS2）脱水；投入液氮保存；保存后快速化冻；）脱水；投入液氮保存；保存后快速化冻；去除玻璃化液；材料的恢复培养。去除玻璃化液；材料的恢复培养。（8）包埋脱水法）包埋脱水法n包埋脱水
38、法是参照人工种子技术，结合低温保存的需要，包埋脱水法是参照人工种子技术，结合低温保存的需要，将包裹和脱水结合起来，应用于超低温保存中。包埋脱水将包裹和脱水结合起来，应用于超低温保存中。包埋脱水法最早出现在法国学者保存马铃薯茎尖的研究中。法最早出现在法国学者保存马铃薯茎尖的研究中。（9）包埋玻璃化法）包埋玻璃化法n为了克服玻璃化法和包埋脱水法的缺点，有人将两者的优为了克服玻璃化法和包埋脱水法的缺点，有人将两者的优点结合起来，建立了包埋玻璃化法。点结合起来，建立了包埋玻璃化法。n需要指出的是，尽管各种冷冻方法各有自己的优需要指出的是，尽管各种冷冻方法各有自己的优缺点，但目前为止还没有一种方法普遍适
39、用于所缺点，但目前为止还没有一种方法普遍适用于所有的植物材料，所以必须根据不同材料来确定冷有的植物材料，所以必须根据不同材料来确定冷冻方法。冻方法。3.化冻和洗涤化冻和洗涤n目前，目前，多数研究采用快速化冻的方式，即将保存后的外多数研究采用快速化冻的方式，即将保存后的外植体材料在植体材料在2540的水浴中化冻的水浴中化冻12min，材料迅速通，材料迅速通过冰晶生长区（过冰晶生长区（-60-40)，从而避免了细胞再次结冰而，从而避免了细胞再次结冰而造成的伤害。在一些研究中，采用室温流动空气、自来水造成的伤害。在一些研究中，采用室温流动空气、自来水冲洗等进行材料化冻也取得了较好的效果。冲洗等进行材
40、料化冻也取得了较好的效果。n化冻后的材料需立即进行洗涤，化冻后的材料需立即进行洗涤，以除去材料组织中高浓以除去材料组织中高浓度的冷冻保护剂，避免影响材料恢复和继续生长。最常用度的冷冻保护剂，避免影响材料恢复和继续生长。最常用的洗涤方法是用含浓度为的洗涤方法是用含浓度为1.2 mol/L蔗糖的基本培养基蔗糖的基本培养基25下处理下处理10min，也有用浓度为，也有用浓度为1.52.0mol/L的山梨醇的山梨醇的培养液进行保护剂成分的洗涤。的培养液进行保护剂成分的洗涤。4.活性检测和恢复培养活性检测和恢复培养n冻后存活率的快速鉴定通常采用冻后存活率的快速鉴定通常采用FAD荧光双醋酸荧光双醋酸法、法
41、、TTC(氯化三苯四氮唑氯化三苯四氮唑)还原法、还原法、Evans(伊凡伊凡蓝蓝)法等。法等。n这些方法均以细胞内某些酶的活力检测为标准，这些方法均以细胞内某些酶的活力检测为标准，不能完全表征细胞与组织的再生能力。因此冻存不能完全表征细胞与组织的再生能力。因此冻存后材料的活力不能仅以此衡量。此外，染色法都后材料的活力不能仅以此衡量。此外，染色法都要破坏材料来检测。由此，出现了一种不破坏材要破坏材料来检测。由此，出现了一种不破坏材料，通过检测材料产生挥发性碳氢化合物如乙烯、料，通过检测材料产生挥发性碳氢化合物如乙烯、乙烷等含量的方法。乙烷等含量的方法。n冻后冻后再培养再培养虽然费时较长，却是检验
42、材料存活率虽然费时较长，却是检验材料存活率的最可靠方法。的最可靠方法。n通常将茎尖洗涤后，接种到恢复培养基通常将茎尖洗涤后，接种到恢复培养基7-15 d后后转入正常培养，转入正常培养，1周统计存活率，周统计存活率，1个月统计再生个月统计再生率。恢复培养时是否需要光照表现出物种差异。率。恢复培养时是否需要光照表现出物种差异。5.超低温保存后的遗传稳定性超低温保存后的遗传稳定性n种质资源保存的最根本的目的是保持遗传基因的种质资源保存的最根本的目的是保持遗传基因的稳定，控制遗传性状不发生变化。因此超低温冻稳定，控制遗传性状不发生变化。因此超低温冻存后材料的遗传特性的检测是十分必要的。存后材料的遗传特
43、性的检测是十分必要的。nLiu et al(2004)研究了超低温保存后苹果茎尖的形态学特征，并研究了超低温保存后苹果茎尖的形态学特征，并进行了同工酶分析及进行了同工酶分析及RAPD和和AFLP 分析，发现冻存材料化冻分析，发现冻存材料化冻后和对照材料具有相同的再生能力，在形态学上没有差异，可后和对照材料具有相同的再生能力，在形态学上没有差异，可溶性蛋白和溶性蛋白和POD酶也没有差异。进一步用酶也没有差异。进一步用RAPD 和和AFLP 研究研究DNA 水平的变化，也未发现两者有水平的变化，也未发现两者有DNA 水平的差异。水平的差异。n张玉进等发现玻璃化法冻存后魔芋的遗传特性未发生改变。其张
44、玉进等发现玻璃化法冻存后魔芋的遗传特性未发生改变。其他的研究结果也表明超低温保存后材料未发生染色体或他的研究结果也表明超低温保存后材料未发生染色体或DNA 水水平的变化，说明了超低温保存在保持种质资源遗传稳定性方面平的变化，说明了超低温保存在保持种质资源遗传稳定性方面具有其他保存方法所不具有的优越性。具有其他保存方法所不具有的优越性。五、影响超低温保存效果的主要因素五、影响超低温保存效果的主要因素1.材料的基本特性材料的基本特性n材料的基本特性包括植物的基因型、抗冻性及器官、组织材料的基本特性包括植物的基因型、抗冻性及器官、组织和细胞的年龄以及生理状态。不同基因型的植物离体材料和细胞的年龄以及
45、生理状态。不同基因型的植物离体材料对超低温冻存的反应各不相同。对超低温冻存的反应各不相同。2.预培养和低温锻炼预培养和低温锻炼n预处理对于调整植物离体材料的生理状态非常有效。通过预处理对于调整植物离体材料的生理状态非常有效。通过预处理的植物材料，减少了细胞内自由水的含量，使细胞预处理的植物材料，减少了细胞内自由水的含量，使细胞能经受低温胁迫，减少或避免了冷冻伤害，可大大提高材能经受低温胁迫，减少或避免了冷冻伤害，可大大提高材料的抗冻力。料的抗冻力。3.冰冻保护剂的应用冰冻保护剂的应用n一般的生物体在没有添加冰冻保护剂的情况下经历低温后一般的生物体在没有添加冰冻保护剂的情况下经历低温后是很难存活
46、下来的。所以，生物体的低温保存离不开冰冻是很难存活下来的。所以，生物体的低温保存离不开冰冻保护剂保护剂4.化冻方法化冻方法n液泡小、含水量少的细胞（如茎尖分生组织），可采用快液泡小、含水量少的细胞（如茎尖分生组织），可采用快速化冻的方法。液泡大、含水量高的细胞则一般需要采用速化冻的方法。液泡大、含水量高的细胞则一般需要采用慢速化冻法。慢速化冻法。5.再培养再培养n经冻存的材料会不可避免地受到不同程度的伤害。为了减经冻存的材料会不可避免地受到不同程度的伤害。为了减少再培养中的光抑制，利于离体材料恢复生长，冻存的材少再培养中的光抑制，利于离体材料恢复生长，冻存的材料一般在黑暗或弱光下培养料一般在黑
47、暗或弱光下培养12周，再转入正常光下培养。周，再转入正常光下培养。再培养所用的培养基一般是与保存前的相同，但有时需将再培养所用的培养基一般是与保存前的相同，但有时需将大量元素或琼脂含量减半，有时则在培养基中附加一定量大量元素或琼脂含量减半，有时则在培养基中附加一定量的的PVP、水解酪蛋白等成分以利于生长的恢复。、水解酪蛋白等成分以利于生长的恢复。六、六、植物种质资源超低温保存的展望植物种质资源超低温保存的展望n建立在离体培养技术基础上的超低温保存技术，在建立在离体培养技术基础上的超低温保存技术，在种质资源保存中独具潜力与优势。种质资源保存中独具潜力与优势。n超低温保存的材料涉及原生质体、悬浮细
48、胞、愈伤超低温保存的材料涉及原生质体、悬浮细胞、愈伤组织、体细胞胚、花粉胚、花粉、花药、种子、茎组织、体细胞胚、花粉胚、花粉、花药、种子、茎尖分生组织、芽、茎段，甚至植株幼苗等。尖分生组织、芽、茎段，甚至植株幼苗等。n同时，超低温保存技术在濒危植物资源的保存中发同时，超低温保存技术在濒危植物资源的保存中发挥了巨大作用。挥了巨大作用。植物种质超低温保存技术具有传统的原境保存和异植物种质超低温保存技术具有传统的原境保存和异境保存无法比拟的优点。境保存无法比拟的优点。n它能长期有效地保存植物种质而且不使种质资源它能长期有效地保存植物种质而且不使种质资源发生变异；发生变异；n还能使保存的植物种质材料免
49、受病、虫、毒的侵还能使保存的植物种质材料免受病、虫、毒的侵害，便于国际间的种质交换，随时快速繁殖大量害，便于国际间的种质交换，随时快速繁殖大量健康植株；健康植株；n而且还能防止种的衰老，延长花粉寿命，从而解而且还能防止种的衰老，延长花粉寿命，从而解决不同开花期和异地植物杂交上的困难；决不同开花期和异地植物杂交上的困难；n另外，研究还发现，超低温保存还可以去除一些另外，研究还发现，超低温保存还可以去除一些病毒。病毒。n虽然超低温保存是低温生物学中比较新的领域，虽然超低温保存是低温生物学中比较新的领域，但有许多问题需要解决。但有许多问题需要解决。n首先，超低温保存是一个非常复杂的过程，不同首先，超
50、低温保存是一个非常复杂的过程，不同植物和同一植物不同类型的材料，它们的超低温植物和同一植物不同类型的材料，它们的超低温保存的难易可能有不同，所以一定要根据材料本保存的难易可能有不同，所以一定要根据材料本身的特性，对影响超低温保存的因素进行研究。身的特性，对影响超低温保存的因素进行研究。n其次，超低温保存过程涉及到一系列的胁迫，它其次，超低温保存过程涉及到一系列的胁迫，它们有可能作为一种选择，对不同基因型的材料产们有可能作为一种选择，对不同基因型的材料产生选择效应，因此关于超低温保存后材料的遗传生选择效应，因此关于超低温保存后材料的遗传稳定性还需进一步探讨。稳定性还需进一步探讨。n今后，超低温保
