1、第四章第四章 目的基因的制备目的基因的制备第三节 目的基因的分离构建基因文库构建基因文库依据待分离目的基因的特性依据待分离目的基因的特性筛选分离出筛选分离出含有目的基因含有目的基因的的特定克隆子特定克隆子特性：特性：基因的序列、功能、在染色体上基因的序列、功能、在染色体上的位置和转录产物的位置和转录产物mRNA等。等。作为抗原作为抗原用免疫动物制备抗体用免疫动物制备抗体特异抗体筛选特异抗体筛选cDNAcDNA表达文库表达文库（一）根据特异蛋白分离目的基因（一）根据特异蛋白分离目的基因路线路线1 1核酸探针核酸探针路线路线2 2抗体筛选抗体筛选分离特异蛋白分离特异蛋白测定特异氨基酸序列测定特异氨
2、基酸序列推测编码蛋白的核苷酸序列推测编码蛋白的核苷酸序列人工合成寡核苷酸片段探针人工合成寡核苷酸片段探针一、目的基因的功能克隆一、目的基因的功能克隆从氨基酸顺序来指导合成寡核苷酸探针从氨基酸顺序来指导合成寡核苷酸探针注意：注意：1 1、设计的寡核苷酸探针必须能特异地识别目、设计的寡核苷酸探针必须能特异地识别目的基因，这种能在整个真核的基因，这种能在整个真核cDNAcDNA文库中与单一文库中与单一顺序特异结合的寡核苷酸探针的最短长度为顺序特异结合的寡核苷酸探针的最短长度为15-1615-16个核苷酸个核苷酸，但通常使用，但通常使用17-2017-20个个核苷酸的核苷酸的长度，即至少需要了解蛋白质
3、肽链上长度，即至少需要了解蛋白质肽链上6 6个连续个连续的氨基酸顺序的氨基酸顺序。2 2、由于遗传密码的简并性、由于遗传密码的简并性(degeneracy)(degeneracy)，大，大多数氨基酸有多数氨基酸有2 2种或种或2 2种以上的遗传密码，有的种以上的遗传密码，有的可多至可多至6 6种，因此，一种氨基酸存在多种可能种，因此，一种氨基酸存在多种可能的的DNADNA顺序。顺序。为了获得全部可能的顺序，通常要合成为了获得全部可能的顺序，通常要合成一组混一组混合的寡核苷酸探针合的寡核苷酸探针，其中只有一种探针能与目，其中只有一种探针能与目的基因完全互补。容易出现的基因完全互补。容易出现“假阳
4、性假阳性”。合成寡核苷酸合成寡核苷酸合成合成少数几种、甚至一种较长的寡核苷酸少数几种、甚至一种较长的寡核苷酸，一般，一般为为35-75个核苷酸探针。个核苷酸探针。选择选择密码子简并性尽可能少的蛋白质密码子简并性尽可能少的蛋白质顺序，或者顺序，或者根据不同生物根据不同生物密码子使用频率密码子使用频率的知识加以的知识加以推测推测，由此，得到的探针称为由此，得到的探针称为“猜测体猜测体”(guessmer)。多肽顺序测定已知多肽顺序测定已知脲酸盐氧化酶脲酸盐氧化酶（urate oxidase）的）的32个氨基酸顺序，根据这一氨基酸个氨基酸顺序，根据这一氨基酸顺序，在它的两端设计了两组简并寡核苷酸引物
5、。顺序，在它的两端设计了两组简并寡核苷酸引物。实验先提取实验先提取mRNA和反转录合成单链和反转录合成单链cDNA，然，然后用这两组引物进行后用这两组引物进行PCR，扩增出的片段插入载，扩增出的片段插入载体和转化体和转化E.Coli。实验再根据。实验再根据32肽的中间顺序设肽的中间顺序设计一个计一个猜测体探针猜测体探针，从转化菌落中筛选出一个阳，从转化菌落中筛选出一个阳性克隆，进而以该克隆的性克隆，进而以该克隆的cDNA插入片段作为探插入片段作为探针，在非常严谨的条件下从针，在非常严谨的条件下从cDNA文库中筛选出文库中筛选出全长全长2.2kb的编码脲酸盐氧化酶的的编码脲酸盐氧化酶的cDNA。
6、已知脲酸盐氧化酶的已知脲酸盐氧化酶的3232个氨基酸顺序个氨基酸顺序简并寡核苷酸引物。简并寡核苷酸引物。提取mRNA单链单链cDNA反转录合成简并寡核苷酸引物。简并寡核苷酸引物。转化转化E.ColiPCR，扩增目的基因目的基因DNA插入载体猜测体探针猜测体探针阳性克隆阳性克隆cDNA插入片段作为探针插入片段作为探针严谨的条件下从严谨的条件下从cDNA文库中筛选出全长文库中筛选出全长2.2kb的编码脲酸盐氧化酶的的编码脲酸盐氧化酶的cDNA利用抗体筛选目的利用抗体筛选目的cDNA1、构建、构建cDNA表达文库表达文库2、以融合蛋白的形式表达目的基因、以融合蛋白的形式表达目的基因3、考虑、考虑cD
7、NA片段在表达载体中的方向和阅片段在表达载体中的方向和阅读框架问题，保证读框架问题，保证cDNA的正确表达的正确表达根据特异蛋白分离目的基因的局限性根据特异蛋白分离目的基因的局限性特异蛋白的鉴定与分离纯化；特异蛋白的鉴定与分离纯化；某些基因产物的表达量非常微少，相关蛋白难以某些基因产物的表达量非常微少，相关蛋白难以分离纯化或量不足；分离纯化或量不足；并非所有基因都有蛋白产物，如并非所有基因都有蛋白产物，如tRNAtRNA基因；基因；仅少数基因能表达形成相应蛋白质，且不同时期、仅少数基因能表达形成相应蛋白质，且不同时期、不同条件下蛋白质的种类不完全相同；不同条件下蛋白质的种类不完全相同；由于遗传
8、密码简并性，难推导出十分特异的探针。由于遗传密码简并性，难推导出十分特异的探针。它主要是利用它主要是利用被克隆的被克隆的DNADNA片段片段与与寄主细胞寄主细胞的染色体的染色体DNADNA在在功能上有功能上有同源互补性同源互补性来进行目的来进行目的基因直接分离的。基因直接分离的。（二）功能互补法克隆基因（二）功能互补法克隆基因一种最简单的方式是，将大肠杆菌一种最简单的方式是，将大肠杆菌DNADNA的克隆的克隆片段片段“库库”中的重组中的重组DNADNA分子分别导入一种分子分别导入一种大肠杆菌营养缺陷型菌株大肠杆菌营养缺陷型菌株(auxotrophic(auxotrophic strain)st
9、rain)的受体细胞的受体细胞然后将受体细胞涂布在一种然后将受体细胞涂布在一种缺少该菌株所需要缺少该菌株所需要的营养底物的基本培养基的营养底物的基本培养基上上结果只有那些获得了营养缺陷型结果只有那些获得了营养缺陷型互补基因互补基因的受的受体细胞才会长成转化子菌落。体细胞才会长成转化子菌落。酵母吲哚甘油磷酸脱氢酶基因的克隆酵母吲哚甘油磷酸脱氢酶基因的克隆Eco R部分酶解面包酵母基因组得到许多部分酶解面包酵母基因组得到许多DNA片段片段DNA片段与片段与噬菌体载体重组噬菌体载体重组转入吲哚甘油磷酸脱氢酶型组氨酸缺陷型大肠杆菌菌株转入吲哚甘油磷酸脱氢酶型组氨酸缺陷型大肠杆菌菌株在不含组氨酸营养源的
10、基本培养基中培养在不含组氨酸营养源的基本培养基中培养只有引入了吲哚甘油磷酸脱氢酶基因的细菌才能生长只有引入了吲哚甘油磷酸脱氢酶基因的细菌才能生长二、序列克隆法二、序列克隆法（一）根据已知基因序列或同源基因序列分离目的（一）根据已知基因序列或同源基因序列分离目的基因基因根据根据已知基因序列已知基因序列或或同源基因序列同源基因序列制备制备探针探针 筛选基因文库筛选基因文库对阳性克隆测序对阳性克隆测序与已知基因序列或同源基因序列比较与已知基因序列或同源基因序列比较经转化鉴定是否为待分离的基因经转化鉴定是否为待分离的基因应应用用核核酸酸探探针针筛筛选选噬噬菌菌体体文文库库碱处理破碱处理破坏外壳蛋坏外壳
11、蛋白，保留白，保留DNAAdamsAdams等（等（Adams et al.,1991Adams et al.,1991）首次提出）首次提出表达序列标签表达序列标签（Expressed Sequence Tag,Expressed Sequence Tag,ESTEST）基因序列中，一段能特异的标记或表征基因的序列，基因序列中，一段能特异的标记或表征基因的序列，它有足够的信息显示该基因与其它基因的差异，长度它有足够的信息显示该基因与其它基因的差异，长度200-600bp200-600bp。ESTEST来源于一定环境下一个组织总来源于一定环境下一个组织总mRNAmRNA所构建的所构建的cDNAc
12、DNA文库文库,因此因此ESTEST也能说明该组织中各基因的表达水平。也能说明该组织中各基因的表达水平。（二）表达序列标签法（二）表达序列标签法（ESTsESTs）分离目的基因）分离目的基因利用利用EST寻找新基因的方法即表达序列标签法（寻找新基因的方法即表达序列标签法（ESTs）不同组织不同组织cDNAcDNA文库，随机挑选克隆并部分测序文库，随机挑选克隆并部分测序(EST)(EST)ESTEST序列对序列对GenBankGenBank、EMBLEMBL数据库检索数据库检索目标基因或多肽序列，分析已报道信息目标基因或多肽序列，分析已报道信息文库筛选或基因定位分文库筛选或基因定位分离目的基因离
13、目的基因结合生物信息学的手段，为人们提供一种快结合生物信息学的手段，为人们提供一种快速有效的发现新基因的方法速有效的发现新基因的方法 ESTEST策略的局限性策略的局限性难寻找出一些表达量极低或不表达的新基因难寻找出一些表达量极低或不表达的新基因类型类型不能检测出许多重要基因的内含子序列和调不能检测出许多重要基因的内含子序列和调控序列控序列不能确定克隆基因的功能不能确定克隆基因的功能只能检测已表达的基因，不能获得全部基因只能检测已表达的基因，不能获得全部基因信息信息1 1、差别杂交法、差别杂交法三三.筛选目的基因的差别杂交及减法杂交技术筛选目的基因的差别杂交及减法杂交技术也称为也称为差别筛选法
14、差别筛选法，特别适用于分离在，特别适用于分离在特定组特定组织织中或发育的中或发育的特定阶段特定阶段表达的基因以及表达的基因以及受生长受生长因子调节因子调节的基因，亦可有效地用来分离的基因，亦可有效地用来分离经特殊经特殊处理诱导表达处理诱导表达的基因。的基因。原理：原理：利用一对组织对基因表达的差异，筛选利用一对组织对基因表达的差异，筛选出在其中一种组织中受某种因素调控表达的一出在其中一种组织中受某种因素调控表达的一种或一组基因。种或一组基因。应用前提：应用前提：两种不同细胞群体两种不同细胞群体1 1目的基因目的基因表达表达2 2目的基因目的基因不表达不表达分别制备以上两种细胞群体的分别制备以上
15、两种细胞群体的总总mRNA提取物提取物以这两种总以这两种总mRNA为探针，分别筛选为探针，分别筛选由细胞群体由细胞群体1构建的构建的cDNA文库文库以以细胞细胞群体群体1的的mRNA 为探针为探针以以细胞细胞群体群体2的的mRNA 为探针为探针包含目的基因包含目的基因的的菌落呈阳性反应菌落呈阳性反应不包含目的基因不包含目的基因的的菌落呈阳性反应菌落呈阳性反应差差别别杂杂交交法法的的操操作作步步骤骤对照原平板，挑选含目的基因的菌落对照原平板，挑选含目的基因的菌落差别杂交法局限性：差别杂交法局限性：1 12 23 32 2、减法杂交技术、减法杂交技术本质：本质：尽量消除两种样品共同存在的基因尽量消
16、除两种样品共同存在的基因序列，从而有效富集序列，从而有效富集目的基因目的基因序列。序列。又称又称差减杂交克隆、扣除杂交、减数杂差减杂交克隆、扣除杂交、减数杂交或消减杂交等。交或消减杂交等。减法杂交减法杂交分析两样品中分析两样品中差异表达的基因差异表达的基因克隆两样品中克隆两样品中特异性存在基因特异性存在基因用途用途对象对象基因组基因组DNAcDNAmRNA减法杂交减法杂交基因组基因组DNA 减法杂交减法杂交分类分类两组织中均表达的基两组织中均表达的基因产物将形成因产物将形成cDNA/mRNA杂交分子杂交分子特异特异mRNA反转反转录的录的cDNA仍单链仍单链差异表达序列差异表达序列基基本本原原
17、理理+过量过量杂交杂交提取提取mRNA并反并反转录为转录为cDNA提取提取mRNA组组织织1目的基因目的基因表达表达组组织织2目的基因目的基因不表达不表达（1）mRNA减法杂交减法杂交四、利用差示分析法分离目的基因克隆四、利用差示分析法分离目的基因克隆1 1、mRNAmRNA差别显示技术（差别显示反转录差别显示技术（差别显示反转录PCRPCR）(mRNA differetial display by PCR,DD-PCR)(mRNA differetial display by PCR,DD-PCR)CAP-5AAAAAAAmRNANMTTTTTTTPCRPCR扩增引物扩增引物3 3端引物：端
18、引物：T11MNT11MN或或T12MNT12MN 共共1212种种5 5端引物：端引物：1010个核苷酸的个核苷酸的随机引物随机引物(AP)(AP)共共2020种种共共240240对对M-A/C/GN-A/T/C/G优点：优点：可检测表达的可检测表达的所有基因；所有基因；同时检测基因同时检测基因的上调和下调的上调和下调表达、展现所表达、展现所有差异、比较有差异、比较多种细胞类型；多种细胞类型；缺点：缺点：检测全部检测全部mRNAmRNA的的PCRPCR工作工作量很大；量很大；PAGEPAGE分离的分离的cDNAcDNA大于大于500bp500bp时会漏检，凝胶分析时会漏检，凝胶分析最多为最多
19、为50-10050-100条；条；差别条带成簇时造成假阳差别条带成簇时造成假阳性；性；NorthernNorthern印迹繁杂费时；印迹繁杂费时；本底较高。本底较高。五、功能结合法筛选目的基因五、功能结合法筛选目的基因原理：原理：根据目的基因根据目的基因表达产物表达产物的其他结合的其他结合功能，如受体与配体结合、酶与底物结合功能，如受体与配体结合、酶与底物结合等完成目的基因的分离筛选。等完成目的基因的分离筛选。真核生物的位点特异转录激活因子：真核生物的位点特异转录激活因子：BD ADBD AD图图六、根据生物大分子间的相互作用分离六、根据生物大分子间的相互作用分离目的目的cDNAcDNA克隆克
20、隆酵母双杂合系统酵母双杂合系统p254p254将一将一cDNA文库或基因片段与编码文库或基因片段与编码AD的基因融合，的基因融合，将其转化入可表达将其转化入可表达BD融合蛋白的酵母体内。融合蛋白的酵母体内。路线路线1 1 注意问题注意问题寡核苷酸探针可特异地识别目的基因，其长度寡核苷酸探针可特异地识别目的基因，其长度应为应为17-2017-20个核苷酸，即至少需要了解蛋白质个核苷酸，即至少需要了解蛋白质肽链上肽链上6 6个连续的氨基酸顺序个连续的氨基酸顺序。由于遗传密码的由于遗传密码的简并性简并性，一种氨基酸顺序存在，一种氨基酸顺序存在多种可能的多种可能的DNA DNA 顺序。为了获得全部可能
21、的顺顺序。为了获得全部可能的顺序，通常要合成序，通常要合成一组混合的寡核苷酸探针一组混合的寡核苷酸探针，其，其中只有一种能与目的基因完全互补。易出现中只有一种能与目的基因完全互补。易出现“假阳性假阳性”（错误的探针与无关（错误的探针与无关cDNAcDNA发生杂发生杂交）。交）。可合成较长的可合成较长的“猜测体猜测体”探针。探针。路线路线2 2 注意问题注意问题构建构建cDNAcDNA表达文库（使用表达型载体）。表达文库（使用表达型载体）。以融合的形式表达目的基因（稳定、高效）。以融合的形式表达目的基因（稳定、高效）。保证保证cDNAcDNA的正确表达。的正确表达。根根据据氨氨基基酸酸序序列列合
22、合成成寡寡核核苷苷酸酸探探针针用用抗抗体体筛筛选选目目的的cDNA重重组组体体克克隆隆的的差差别别杂杂交交筛筛选选法法用用差差示示杂杂交交筛筛选选血血清清诱诱导导表表达达基基因因生生长长因因子子调调节节基基因因减减数数杂杂交交分分离离T T细细胞胞受受体体基基因因减减法法杂杂交交分分离离缺缺失失突突变变体体基基因因（3）基因组）基因组DNA 减法杂交减法杂交生物素标记生物素标记用来分离缺失用来分离缺失突变基因突变基因差差别别显显示示分分析析基基本本流流程程回收回收cDNA,制备探制备探针筛选针筛选文库，文库，以分离以分离该差异该差异片段对片段对应的全应的全长长cDNA或完整或完整基因基因红细胞生长分化因子（又称促红细胞生成素红细胞生长分化因子（又称促红细胞生成素EPO）受体受体cDNA的克隆筛选的克隆筛选酵母双杂交体系原理酵母双杂交体系原理诱饵蛋白诱饵蛋白靶蛋白靶蛋白带有一个或多个报告基因的宿主菌株带有一个或多个报告基因的宿主菌株
