1、选修1生物技术实践知识归纳图解(马中邹伟春)微生物的实验室培养（一）培养基的基本知识 1培养基的营养成分营养物质定义作用主要来源及所涉及的微生物碳源凡是能提供微生物所需碳元素的物质构成生物细胞、生物体及细胞代谢产物，有些能为异养生物提供能源无机化合物：C02、NaHC03等-自养生物有机化合物：糖类、脂质、花生粉饼、石油等-异养生物氮源凡是能提供微生物所需氮元素的物质合成蛋白质、核酸及含氮的代谢产物，也可为异养微生物提供能源无机化合物：N2、NH3、铵盐、硝酸盐-自养生物有机化合物：尿素、牛肉膏、蛋白胨等-异养生物水分生物体内含量最高的组成成分，分为结合水和自由水良好的溶剂、细胞生活及生化反应
2、的介质、参与物质运输及参与生化反应的反应物培养基、大气、代谢产物无机盐为微生物提供大量除C、H、0以外的各种元素细胞组成成分，生命调节物质，自养菌的能源或其他营养来源，酶的激活剂培养基、大气等环境生长因子微生物正常生长繁殖，必不可少的微量有机物可作为酶与核酸等的组成成分维生素、氨基酸、碱基等高考警示钟自养微生物与异养微生物所需的营养物质不同(1)自养微生物所需的碳源、氮源来自含碳、含氮的无机物，而异养微生物需要的碳源、氮源来自含碳、含氮的有机物，因此可根据培养基中营养物质判断微生物的代谢类型。(2)含氮无机物不但能给自养微生物提供氮源，也能作为能源物质，提供能量，如NH3既作为硝化细菌的氮源也
3、作为能源。2培养基的配制原则 (1)目的明确。要根据微生物的种类、培养目的等选择原料、配制培养基。 (2)营养要协调。各种营养物质要保证适当的浓度和比例。营养物质比例过低，不能满足微生物生长；浓度过高则会抑制微生物的正常生长。营养物质的浓度比(如C/N)还会直接影响某些微生物的代谢产物，如谷氨酸生产，C/N=41时，菌体大量繁殖，谷氨酸产量少；而C/N=31时，菌体繁殖受抑制，但谷氨酸合成量大。 (3)pH要适当。不同微生物生长所需pH不同。如细菌pH保持在6.57.5之间；放线菌保持在7.58.5之间；真菌应保持在5.06.0之间。3培养基的分类及作用：培养基种类很多，作用也不同。根据不同的
4、分类标准，可将培养基分为不同种类。划分标准培养基种类特点用途及实例物理性质液体培养基不加凝固剂工业生产半固体培养基加凝固剂，如：琼脂观察微生物的运动、分类鉴定、保藏菌种固体培养基微生物分离、鉴定、活菌计数、化学成分天然培养基含化学成分不明确的天然物质工业生产合成培养基培养基成分明确(用化学成分已知的化学物质配成)分类、鉴定用途选择培养基培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长培养、分离出特定微生物(如：培养酵母茵或霉菌，可在培养基中加入青霉素；培养以尿素为氮源的微生物用尿素固体培养基)鉴别培养基根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品鉴别不
5、同种类的微生物（如用伊红一美蓝培养基鉴别大肠杆菌，茵落呈深紫色，并有金属光泽。用酚红鉴别有脲酶的细菌，菌落周围有红色环带)说明：病毒为非细胞结构的生物体，专营活细胞寄生，目前不能利用人工培养基来培养，需接种在动植物组织中才能增殖。常用于培养病毒的是活鸡胚。加入培养基中的凝固剂(如琼脂)，一般不能被微生物利用，只起到凝固作用。选择培养基一般只生长具有特定的微生物，鉴别培养基可以存在其他微生物，而且能鉴别特定的微生物。注意：选择培养基的选择方法(1)在培养基中加入某种化学物质。例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。这里的加入是在主要营养成分完整的基础上加入
6、。(2)改变培养基中的营养成分。例如缺乏氮源时可以分离出固氮微生物；石油作为惟一碳源时，可以分离出消除石油污染的微生物。(3)改变微生物的培养条件。例如，将培养基放在高温环境下培养，可以得到耐高温的微生物。（二）灭菌技术1无菌技术的概念 在微生物培养中，获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌入侵，其主要技术是无菌操作。无菌技术是指通过一定物理、化学的手段，防止实验室培养物被外来微生物污染。无菌技术主要围绕如何避免杂菌污染展开的。2消毒、灭菌的方法 项目概念常用方法应用范围消毒使用较为温和的物理或化学方法，仅杀死物体表面或内部一部分对人体等有害的微生物(不包括孢子和芽孢)巴氏消毒法：7075水中煮3
7、0min或在80水中煮15min一些不耐高温的物体如牛奶煮沸消毒法：在100水浴中煮沸56 min一般物品化学药剂消毒法：用乙醇、氯气、漂白粉、KMnO4等药剂来杀死或抑制细菌生长或繁殖可用来对环境、双手和衣物等消毒紫外线消毒法：30W紫外灯照射30min接种室灭菌使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼烧灭菌法：酒精灯火焰接种工具如接种环、接种针等干热灭菌法：在160170加热12h如玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具高压蒸汽灭菌：压力为100 kPa，温度为12l的条件下，维持1530 min培养基及容器、无菌水等的灭菌注意：无菌操作是微生物培养过程中，防止杂茵污染的关
8、键步骤。消毒只能消灭或抑制营养体的活动，而不能达到彻底灭菌。酒精消毒用体积分数为70%的酒精效果最好，因浓度过高，会使菌体表面蛋白凝固成一层保护膜，乙醇分子不能进入其中；浓度过低，杀菌力减弱。而灭菌除杀死营养体外，还必须杀死芽孢和孢子。灭菌消毒的原理，就是通过一定理化手段，使病原茵蛋白质变性，失去生命活性。（三）微生物的纯化培养技术1常用细菌培养基蛋白胨培养基配制流程：计算称量溶化灭菌注意：据配方计算配制一定体积培养基时各成分的用量注意：倒平板时，烧杯口要通过酒精灯火焰灭菌。平板冷凝后要将平板倒置，以确保拿放方便，同时避免水分蒸发，以利微生物生长，也可防止皿盖上凝结的水滴滴入培养基，影响pH；
9、其次防止细菌透过皿底、皿盖的缝隙，落在培养基上。倒平板时，不能将培养基溅在皿底与皿盖之间，以防止杂菌滋生，污染培养基（调PH）倒平板注意：牛肉膏较粘稠，应玻棒挑取，在称量纸上称量牛肉膏蛋白胨易吸潮，动作要迅速注意：溶化琼脂时要控制火力的大小并不断搅拌，以免培养基溢出或烧焦；加热过程中部分水分蒸发，待琼脂完全溶化后应补加蒸馏水，以保持溶液的浓度注意：由于不同微生物适宜的pH不同，因此在熔化后，必须用NaOH或HCl来调节pH装瓶注意：分装至试管时培养基的高度不要超过试管高度的1/5注意：可用高压蒸汽灭菌法用干热灭菌法时温度160170(不能超过180，否则易引起报纸等燃烧)一般是培养基先灭菌再倒
10、平板，也可先倒平板,再灭菌2纯化大肠杆菌原理：在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞，使其长成单个的菌落，这个菌落就是纯化的细菌菌落。微生物接种方法： (1)平板划线法：平板划线法中细胞的分离和稀释过程发生在接种环在固体平板表面上的划线和移动过程中。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成纯种的单个菌落。(如图) (2)稀释涂布平板法：10倍系列稀释操作划线操作时注意：（1）用接种环取菌种之前、每次划线之前和划线结束都要进行灼烧灭菌，灼烧后要在酒精灯附近冷却后再操作；(第一次操作：杀死接种环上原有的微生物。每次划线之前：杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使
11、下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端。划线结束后：杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者)（2）划线时不要划破培养基，如果采用分段划线法操作从第二次操作应总在上一次划线末端开始，首尾不能相连；（3）操作始终在酒精灯火焰旁进行。涂布操作时注意：（1）配制系列梯度稀释液时，所用的试管和移液管均需灭菌，必须用无菌水配制；（2）涂布器用70%的酒精消毒，多余酒精在烧杯中滴尽，沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰引燃。不要将过热的涂布器放入盛有酒精的烧杯中，一面引燃其中的酒精；（3）配制系列梯度稀释液和转移菌液以及涂布过程等必须都在酒精灯火焰旁进行，移液管头不能接触任何物体。3菌种的保存 对
12、于频繁使用的菌种，可以采用4冰箱中临时保藏的方法。 对于需要长期保存的菌种，可以采用-20甘油管藏的方法。注意：菌种保藏的原理是：低温、干燥和隔绝空气，使微生物代谢能力和繁殖能力降低。不同菌种的保藏方法因不同菌种而异。需氧型，必须低温有氧，而厌氧型必须低温无氧；腐生微生物可提供牛肉膏蛋白胨培养基，而寄生微生物需提供活体组织等非人工培养基，如病毒需提供活鸡胚。（三）微生物的筛选与计数（以“土壤中分解尿素的细菌”为例）筛选菌株原则：人为提供有利于目的菌生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长培养基的成分：尿素作为惟一的氮源(选择培养基、固体培养基)菌落计数菌种的鉴定对照：将不接种的培养基置于相同
13、温度恒温箱培养(目的:证实培养基是否被杂菌污染)统计茵落数目的方法：(1)显微镜直接计数法原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积样品中微生物数量方法：用计数板计数。缺点：不能区分死菌与活菌。(2)间接计数法(活菌计数法)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。计算公式：每克样品中的菌株数(CV)M，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。操作：设置重复组，增强实验的说服力与准确性。同时为了保证结果准确
14、，一般选择菌落数在30300的平板进行计数。方法：检测培养基pH的变化判断原理：在细菌分解尿素时，分泌的脲酶将尿素分解为氨，氨使培养基碱性增高，pH升高，使酚红呈红色（红色环带） 果汁中的果胶和果胶酶 更多的水果成分溶解和分散在果汁中一、思路：水果果汁（出汁率高、澄清度高） （果胶） 果胶酶、果胶甲酯酶（来自黑曲霉、苹果青酶） （半乳糖醛酸）二、探究制作果汁的最佳条件(1)实验原理：果胶酶能将果胶水解成半乳糖醛酸，提高出汁率和澄清度；果胶酶活性受温度（PH）影响，处于最适温度（PH）时，活性最高；低于或高于最适温度（PH），酶活性受到抑制，即果肉的出汁率、果汁的澄清度与果胶酶的活性大小成正比；
15、果肉的出汁率、果汁的澄清度（果胶不溶于乙醇，果汁中加95%可检测澄清度即果胶水解的程度）反应了果胶酶的活性。(2)设计思路：设置一系列梯度温度（PH），从中选出酶活性最高的温度，然后再以该温度（PH）为中心，缩小温度（PH）梯度向两个方面各设置梯度温度（PH），以进一步确定最适温度（PH）范围。所选择的温度（PH）只能接近最适温度（PH），但不一定就是最适温度（PH）。(3)实验操作流程及注意事项制备水果泥注意：苹果、橙子和葡萄等水果都可以作为反应物，水果不用去皮。如用苹果为原材料，一般可按每个中等大小的苹果加水100200 mL的比例进行搅拌，获得稀的苹果泥制备果胶酶水果泥、果胶酶分别水浴保
16、温（水果泥、果胶酶混合水浴保温记录果汁量自变量：温度(应控制为唯一) 对照：相互对照无关变量：果泥量、果胶酶的浓度和用量、水浴时间和混合物的pH等所有其他条件(应控制为相同)设计实验方案确定温度（PH）梯度探讨控制温度（PH）的方法和措施确定水果的种类确定制备果汁的方法确定实验用的水果量确定果胶酶的量探讨测定果胶酶活性的方法动手实验过滤出果汁改变不同温度后重复上面实验(也可同时进行不同温度的实验)记录实验数据得出结论记录表格设计温度/ 10 20 30 40 50 60果汁量/mL原因：将果泥和果胶酶分装在不同的试管中恒温处理，可以保证底物和酶在混合时的温度是相同的，避免了果泥和果胶酶混合时影
17、响混合物的温度，从而影响果胶酶活性的问题原因：让果泥和果胶酶有充分的反应时间通过测定滤出的苹果汁的体积大小来判断果胶酶活性的高低原因：果胶酶将果胶分解为小分子物质，小分子物质可以通过滤纸，因此苹果汁的体积大小反应了果胶酶的催化分解果胶的能力。在不同的温度和pH下，果胶酶的活性越大，苹果汁的体积就越大 加酒精观察澄清度注意：每个探究实验的设计，都要遵循实验设计的一般原则，特别是单因子变量控制原则。如果随酶浓度增加，果汁体积也增大，说明酶用量不足；当酶用量达一定值时，再增加酶用量，果汁体积不变，则说明这个值就是酶的最适用量。 a-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测 一、思路：1、游离酶：在水溶液中
18、不稳定，难与产物分离。 吸附法、包埋法、共价偶联法、交联法固定于介质上 固定化酶：不溶于水而又有酶活性，稳定且能重复使用，产物纯净。 a-淀粉酶（来自枯草杆菌） -淀粉酶 糖化淀粉酶 2、淀粉 糊精 麦芽糖 葡萄糖 遇碘显蓝色 遇碘显红色 遇碘不变色 遇碘不变色二、步骤： 搅拌吸附30分钟 10倍体积蒸馏水1ml/min流速洗去未吸附的游离淀粉酶 1、a-淀粉酶的固定化：a-淀粉酶+蒸馏水+石英砂 装柱（注射器下端气门芯用夹子封住） a-淀粉酶固定化酶柱 2、固定化a-淀粉酶催化淀粉水解作用的检测： 0.3ml/min流速、PH5.5-7.5、50-75 流出5ml淀粉溶液后 滴加1-2滴KI
19、-I2溶液 用水稀释1倍 淀粉溶液 a-淀粉酶固定化酶柱 接取0.5ml流出液 溶液显红色 溶液显红色 3、检测a-淀粉酶固定化酶柱重复使用的效果： 使用过的a-淀粉酶固定化酶柱10倍体积蒸馏水洗涤4冰箱中保存几天重复上述实验溶液显红色三、结论： 酶的固定化不会影响酶的专一性和活性，能重复使用，产物易与酶分离。果酒和果醋的制作挑选葡萄冲洗榨汁酒精发酵醋酸发酵注意：要先清洗后除枝梗(避免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会，同时，防止葡萄汁流失)不能反复冲洗(避免菌种流失)注意：选择新鲜的葡萄注意：榨汁机要清洗干净，并晾干(防杂菌污染)避免将果核压破(因果核含有多种有害葡萄酒风味的物质)
20、原理：主要菌种是酵母菌。酵母菌是异养兼性厌氧微生物C6H12O6C2H5OHC02温度：20左右最适合酵母菌繁殖，一般控制在1825。果酒果醋注意：发酵装置要清洗干净，并用体积分数为70的酒精消毒发酵瓶装入葡萄汁后留有l/3的空间(目的是先让酵母菌进行需氧呼吸快速繁殖，耗尽氧气后再进行酒精发酵；其次，防止发酵过程中产生的CO2造成发酵液的溢出)如用带盖的瓶子制葡萄酒，每隔12 h左右将瓶盖拧松一次(注意不是打开瓶盖，防杂菌污染)，之后再将瓶盖拧紧(目的:排出多余的气体放炸裂)装入葡萄汁封闭充气口(无氧环境和放杂菌污染)发酵过程中，随着酒精度数的提高，葡萄酒呈现深红色(因红葡萄皮的色素也进入发酵
21、液)酒精的鉴定:与酸性重铬酸钾呈绿色对照组2mL白酒实验组2mL发酵液试管甲2mL发酵前液试管乙2mL发酵后液3mL/L的H2SO43滴混匀重铬酸钾3滴观察3mL/L的H2SO43滴混匀重铬酸钾3滴观察原理：主要菌种是醋酸杆菌(异养需氧型)当氧气糖源均充足时，糖醋酸当氧气充足、缺少糖源时，乙醇乙醛醋酸温度：3035。注意：需适时通入空气高考警示：由于醋酸菌和乳酸菌属于原核生物，所以在利用者两类微生物时，其环境中一定不能加入抗生素。酵母菌在营养和氧气充足时进行出芽生殖泡菜的腌制和亚硝酸盐的测定 一、原理： 假丝酵母（异养、兼性厌氧） 乳酸菌（异养厌氧） 1、蔬菜中的营养物质 （有机酸、醇类等）
22、乳酸、亚硝酸 消耗泡菜坛中的氧气 对氨基苯磺酸 N-1-萘基乙二胺 光电比色法定量测定2、亚硝酸盐 中间产物 紫红色产物 亚硝酸盐含量 重氮化反应 偶联反应3、氯化铵缓冲液：保持碱性环境，防止亚硝酸盐形成亚硝酸盐而挥发；乙酸：保持酸性环境有利于显色剂稳定，促进重氮化欧联反应进行。 氢氧化钠和硫酸锌溶液：蛋白质沉淀剂；显色剂：新配置的对氨基苯磺酸和N-1-萘基乙二胺的混合物二、步骤： 1、泡菜腌制原料加工（洗、切）洗坛消毒（热水）加料混匀（蔬菜、食盐、糖、调味品、白酒、泡菜汁等）密封发酵（坛口及时加水）保存食用 2、亚硝酸盐含量测定 样品处理：泡菜及泡菜汤质量m1制匀浆过滤洗涤取液体调PH至8沉
23、淀蛋白质（氢氧化钠、硫酸锌溶液、60水浴）冷却、过滤、洗涤取液体定容500ml（样品溶液）V1 样品光密度值测定：10ml样品溶液（测定用）V2加氯化铵缓冲液、乙酸、显色剂混合均匀，暗处静置测定光密度值（550nm，1cm光程） 10ml水（做对照）加氯化铵缓冲液、乙酸、显色剂混合均匀，暗处静置测定光密度值（550nm，1cm光程） 绘制标准曲线：1ml亚硝酸钠标准溶液（储夜）：浓度500ug/ml100ml亚硝酸钠标准溶液（测定用）：浓度5ug/ml各取0、0.5、1.0、3.0、5.0ml加氯化铵缓冲液、乙酸、显色剂混合均匀，暗处静置测定光密度值（550nm，1cm光程）以亚硝酸钠质量为横
24、坐标，光密度值为纵坐标绘制标准曲线将样品光密度值代入标准曲线，查出测定样品中亚硝酸钠质量m2 计算样品中亚硝酸钠的含量：X1=(m2*V1)/(m1*V2) 重复上述实验，测定X2、X3，求平均值。 菊花的组织培养 试管苗注意：培养一株完整的试管苗，必须先进行生芽培养，然后进行生根培养。制备培养基外植体消毒接种MS培养基：大量元素、微量元素和有机成分 (蔗糖，提供能源和维持渗透压)发芽培养基：MS培养基+BA（多）+NAA（少）生根培养基：MS培养基+BA（少）+NAA（多）pH：5.8左右灭菌：高压蒸汽灭菌注意：为降低工作量、减少误差，可通过配制母液，达到一次称量药品、多次使用。配制培养基时
25、，母液的应用应先摇匀，移液用的移液管或量筒需清洗两次，以免造成误差。培养愈伤组织胚状体(或不定芽)脱分化再分化移栽(炼苗)栽培材料：植物的种类、年龄、保存时间消毒原因：大部分来自田间，带有大量病毒、细菌菊花茎段消毒：所用消毒剂为体积分数为70的酒精和质量分数为5的次氯酸钠溶液，所使用的清洗液是无菌水。注意：不同植株或同一植株的不同部位，所选用的消毒剂种类及浓度可能不同；方法：始终在酒精灯火焰旁进灼烧灭菌。注意：将菊花茎段插入培养基时不要倒插温度：1822光照：不少于14.5小时每天注意：生长素和细胞分裂素的使用用量比例不同发育方向不同低：利用根的分化，抑制芽的形成细胞分裂素与生长素浓度比 高：
26、利用芽的分化，抑制根的形成适中：促进愈伤组织的生长原因：因试管苗光合作用能力低，对不良环境耐受力差，一定要在保温、保湿一段时间以增强适应力方法：流水清洗根部，移栽至消过毒的蛭石或草炭土环境培养脱分化阶段只分裂；再分化阶段既有分裂也有分化人工种子制备阶段原理：细胞的全能性(高度分化的植物细胞，仍具有发育为完整个体的潜能) (1)原因：体细胞携带有本物种全套的遗传信息 (2)实现的条件：离体状态和适宜条件(水分、无机盐、有机营养及激素、温度、pH等)(3)细胞的全能性大小与细胞种类的关系：受精卵生殖细胞体细胞；植物细胞动物细胞；分化程度低的细胞分化程度高的细胞一般的，离体的植物细胞的全能性在一定条件下可充分地体现出来。离体的动物细胞的全能性受到限制，但其细胞核的全能性借助卵细胞的细胞质可体现出来。未离体的细胞的全能性不能表达，只是在机体的调控下进行定向分化。12
