1、高三生物一轮复习学案第39讲微生物的培养与应用最新考纲1.微生物的分离和培养。2.培养基对微生物的选择作用。3.某种微生物数量的测定。4.微生物在其他方面的应用。1.培养基(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。(2)营养组成：一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。此外，还需要满足微生物生长对pH、氧气以及特殊营养物质的要求。(3)种类：按照物理性质可分为液体培养基和固体培养基。2.无菌技术(1)含义：指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。(2)关键：防止外来杂菌的入侵。(3)不同对象的无菌操作方法(连线)3.大肠杆菌的纯化培养(1)制备牛肉膏蛋白胨
2、固体培养基操作步骤倒平板的方法及注意事项a.请用文字和箭头写出正确的倒平板操作流程：丙乙甲丁。b.甲、乙、丙中的灭菌方法是灼烧灭菌。c.丁中的操作需要等待平板冷却凝固才能进行。(2)纯化大肠杆菌的方法纯化培养原理：想方设法在培养基上得到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的菌落，即可获得较纯的菌种。纯化大肠杆菌的关键步骤：接种。常用的微生物接种方法有两种a.平板划线法：是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。b.稀释涂布平板法：是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。(3)菌种的保存方法对于频繁使用的
3、菌种，可以采用临时保藏的方法。对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。(1)(教材P16旁栏思考题解答)请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。培养细菌用的培养基与培养皿玻棒、试管、烧瓶和吸管实验操作者的双手提示、需要灭菌；需要消毒。(2)(教材P17“倒平板操作讨论”解答)为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？提示通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。平板冷凝后，为什么要将平板倒置？提示平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。3.下图甲、乙
4、是微生物接种常用的两种方法，请思考：(1)图甲是利用_法进行微生物接种，图乙是利用_法进行微生物接种。这两种方法所用的接种工具分别是_和_；对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是_和酒精消毒。(2)接种操作为什么一定要在火焰附近进行？_。(3)下图是采用上述接种方法接种后培养的效果图解，其接种方法是_(填“图甲”或“图乙”)。提示(1)平板划线稀释涂布平板接种环涂布器灼烧灭菌(2)火焰附近存在着无菌区域(3)图乙1.(2016全国课标卷，39)空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下
5、：配置培养基(成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O)；制作无菌平板；设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；将各组平板置于37 恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。回答下列问题：(1)该培养基中微生物所需的氮来源于_。若要完成步骤，该培养基中的成分X通常是_。(2)步骤中，实验组的操作是_。(3)若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了_现象。若将30(即366)个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法_(填“正确”或“不正确”)。解析(1)牛肉膏和蛋白胨都含有蛋白质的水解产物，都可以作
6、为氮源；平板为固体培养基，故需要加入凝固剂琼脂。(2)实验探究的是教室内“不同高度空气”中微生物的分布，其中变量为不同高度，故需在不同高度下放置开盖平板。同时，为了保证单一变量，需要保证开盖放置时间一致。为了保证实验可靠性，需要设置多个平行组。(3)在完全正确的操作情况下，空白对照组中不应出现菌落。若出现菌落，表明操作过程中存在杂菌污染，属于实验失误，所有实验数据均不应采用。答案(1)牛肉膏、蛋白胨琼脂(2)将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间(3)污染不正确2.(2016深圳六校联盟模拟)人们使用含三丁基锡、三苯基锡等有机锡化合物的油漆涂于船只、海洋建筑物等的表面，
7、有效防止了海洋生物附着生长，但近年来的研究发现油漆中的有机锡可释放入海，对多种生物造成毒害。现欲从海洋底泥中分离分解三丁基锡的微生物。回答下列问题：(1)为了获得能降解三丁基锡的微生物菌种，可在被三丁基锡污染的海洋底泥中取样，并应选用以为碳源的培养基进行选择培养。除含有碳源外，培养基还应含有_、_、_、无机盐和蒸馏水等。(2)实验过程中，玻璃器皿和金属用具可以采用干热灭菌法来灭菌，原因是_。(3)常用的微生物接种方法有两种，但只有_可用于微生物的计数，运用该方法计数的结果往往比实际数目_(填“高”或“低”)。在平板划线操作中，接种环在使用前要先灼烧，其目的是_，第二次及其后的划线都要从上一次划
8、线的末端开始，其目的是_。(4)将获得的3种待选微生物甲、乙、丙分别接种在含少量三丁基锡的相同培养液中培养(培养液中其他营养物质充裕、条件适宜)，观测从实验开始到微生物停止生长所用的时间，甲、乙、丙分别为33小时、15小时、46小时，则应选择微生物_作为菌种进行后续培养。答案(1)三丁基锡氮源琼脂 (2)玻璃器皿和金属用具能耐高温，且要保持干燥 (3)稀释涂布平板法低杀灭接种环上的微生物使微生物数目能够随着划线次数的增加而逐步减少，以达到分离的效果 (4)乙1.无菌技术条件结果常用方法应用范围消毒较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部的部分微生物煮沸消毒法日常用品巴氏消毒法不耐高温的液体
9、化学药剂消毒法用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源灭菌强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼烧灭菌法接种工具干热灭菌法玻璃器皿、金属用具高压蒸汽灭菌法培养基及容器2.两种纯化细菌的方法的比较项目优点缺点适用范围平板划线法可以观察菌落特征，对混合菌进行分离不能计数适用于好氧菌稀释涂布平板法可以计数，可以观察菌落特征吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延适用于厌氧菌和兼性厌氧菌1.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数项目详细内容实验原理(1)能合成脲酶的细菌才能分解尿素(2)配制以尿素为唯一氮源的培养基，能够生长的细菌就是能分解尿素的细菌数量统计(1)直接计数法(显微镜下用特定细
10、菌计数板或血细胞计数板)(2)间接计数法：稀释涂布平板法实验流程土壤取样配制土壤溶液和制备培养基系列稀释涂布平板与培养菌落计数2.分解纤维素的微生物的分离(1)纤维素酶组成：纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶。作用纤维素纤维二糖葡萄糖(2)纤维素分解菌的筛选原理 纤维素分解菌 红色复合物红色消失，出现透明圈筛选方法：刚果红染色法，即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。培养基：以纤维素为唯一碳源的选择培养基。实验流程土壤取样：富含纤维素的环境选择培养：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的浓度梯度稀释：制备系列稀释液涂布平板：将样品涂布到鉴别纤维素分
11、解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落(3)分离纤维素分解菌所用的两种培养基比较分离纤维素分解菌的实验中先用选择培养基，再用鉴别培养基。选择培养基为液体培养基，以纤维素作为碳源和能源的微生物可以正常生长，而其他绝大多数微生物不能正常生长。鉴别培养基含琼脂，为固体培养基，细菌可在培养基上形成肉眼可见的菌落。刚果红染色法应用的就是鉴别培养基。3.结果分析与评价内容现象结论有无杂菌污染的判断对照的培养皿中无菌落生长未被杂菌污染培养物中菌落数偏高被杂菌污染菌落形态多样，菌落数偏高培养物中混入其他氮源选择培养基的筛选作用牛肉膏培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目选择培养基具筛选作用样品的稀释操作得到2个
12、或2个以上菌落数目在30300的平板操作成功重复组的结果若选取同一种土样，统计结果应接近1.(2016四川卷，10)图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。(1)图中选择培养基应以_为唯一氮源；鉴别培养基还需添加_作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成_色。(2)在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品液0.1 mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。该过程采取的接种方法是_，每克土壤样品中的细菌数量为_108个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较
13、_。(3)现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示位置增加了70个核苷酸，使图乙序列中出现终止密码(终止密码有UAG、UGA和UAA)。突变基因转录的mRNA中，终止密码为_，突变基因表达的蛋白质含_个氨基酸。解析(1)脲酶能够催化尿素分解为氨，故图中选择培养基应以尿素作为唯一氮源。由于尿素被分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，使酚红指示剂变红色。(2)用于计数细菌菌落数的接种方法是稀释涂布平板法，统计的菌落数应介于30300之间，故选择细菌菌落数为156、178和191的平板计数，每克土壤样品中的细菌数量为(156178191)/30.11051.
14、75108。由于两个或多个细菌连接在一起时，往往统计的是一个菌落，故用此方法测得的细菌数偏少。(3)密码子由三个相邻的碱基组成，271个碱基和后面2个碱基一起共构成91个密码子，插入的70个核苷酸和后面2个碱基一起共构成24个密码子，紧随其后是UGA，应为终止密码，翻译结束，因此表达的蛋白质含115个氨基酸。答案(1)尿素酚红红(2)稀释涂布平板法1.75少(3)UGA1152.(2016河南郑州二模)某同学要分离土壤中能分解尿素的细菌，并统计每克土壤样品中活菌数目，培养基配方如下。将各种物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL，再经高温灭菌，制成固体培养基备用。KH2PO4Na2HPO4M
15、gSO47H2O蛋白胨葡萄糖尿素琼脂1.4 g2.1 g0.2 g1.0 g10.0 g1.0 g15.0 g(1)根据培养基的成分判断，该同学能否分离出土壤中分解尿素的细菌？_(填“能”或“不能”)，原因是_。(2)培养基用_方法灭菌，培养皿用_方法灭菌，待培养基冷却到_(填“20”、“30”、“40”或“50”)左右时，在_附近倒平板，等平板冷却凝固后，将平板倒过来放置，可以防止_，以免造成污染。(3)要统计每克土壤样品中活菌数目，宜采用_法接种，根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积，统计平板上的_就能大约推测出样品中活菌数。(4)培养分解尿素的细菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染
16、。对于固体培养基应采用的检测方法是_。(5)某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均值为234，那么每克样品中的菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL)_。解析(1)据表分析，表中的蛋白胨可以为微生物的生存提供氮源，所以不能分离尿素分解菌，筛选纤维素分解菌需要以纤维素为唯一的碳源的选择培养基。(2)微生物培养中的培养基常用高压蒸汽灭菌法灭菌，玻璃器皿可以使用干热灭菌。倒平板时需要培养基冷却至50 左右时在酒精灯火焰旁进行，等平板冷却凝固后，将平板倒过来放置，可以防止培养皿盖上的水珠落入培养基造成污染。(3)固体培养基上的接种方法有稀释涂布平板法和平板划线法，稀释涂布
17、平板法适用于微生物的统计计数，根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积，统计平板上的菌落数目或平均菌落数能够推测样品中的活菌数。(4)检测培养基是否被污染，需要将未接种的培养基在适宜温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生，如果有菌落说明被污染，否则没有被污染。(5)依据公式得每克样品中菌落数M1062.34109。答案(1)不能培养基含蛋白胨，尿素不是唯一氮源，不能选择出只以尿素为氮源的微生物(培养基含蛋白胨，蛋白胨中含有氮元素)(2)高压蒸汽灭菌干热灭菌50酒精灯火焰培养皿盖上的水珠落入培养基(3)(稀释)涂布平板菌落数目(4)将未接种的培养基在适宜温度下放置适宜的时间，观察培养基
18、上是否有菌落产生(5)2.341091.菌株筛选原理的比较土壤中分解尿素的细菌分解纤维素的微生物选择培养基的成分：尿素作为唯一的氮源鉴定方法：在培养基中加入酚红指示剂，若pH升高，指示剂变红，说明细菌能分解尿素选择培养基的成分：纤维素作为唯一的碳源鉴定方法：刚果红染色法，即刚果红与纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，培养基出现以纤维素分解菌为中心的透明圈2.选择培养基与鉴别培养基的比较种类制备方法原理用途举例选择培养基培养基中加入某些化学物质依据某些微生物对某些物质或环境条件的嗜好、抗性而设计从众多微生物中分离所需的微生物加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌鉴别培养基培养基中加入某种指示剂或化学
19、药品依据微生物产生的某种代谢产物与培养基中的特定试剂或化学药品反应，产生明显的特征变化而设计鉴别不同种类的微生物伊红美蓝培养基可以鉴别大肠杆菌易错防范清零易错清零易错点1误认为所有微生物培养基中均需加入“生长因子”点拨碳源、氮源、水分、无机盐、生长因子是微生物生长必需的五大营养成分，但大多数培养基中都含碳源、氮源、水分、无机盐四类物质，可能不需额外添加“生长因子(如维生素)”，这是因为许多微生物可自行合成这些生长因子，而对那些合成能力有限或不能合成生长因子的微生物(如乳酸菌)，则需在培养基中添加诸如维生素等生长因子。易错点2混淆两种“对照组”与“重复组”点拨(1)两种对照组作用比较判断培养基中
20、“是否有杂菌污染”，需将未接种的培养基同时进行培养。判断选择培养基“是否具有筛选作用”，需设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目，进行对比得出结论。(2)重复组的设置及作用为排除偶然因素对实验结果的干扰，在每一稀释度下宜设置3个平板作重复组，选择菌落数均在30300且数目相差不大的三个平板，用“平均值”代入计数公式予以计算菌落数。易错点3混淆消毒与灭菌点拨对于活体宜消毒不可说成灭菌，而对于培养基、接种工具、培养皿等必须灭菌。易错点4不明确每次划线操作中“灼烧接种环”的目的或误认为划线结束后“不必灼烧接种环”点拨平板划线法纯化大肠杆菌时不同阶段灼烧接种环的目的不同第一次操
21、作：杀死接种环上原有的微生物。每次划线之前：杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端。划线结束后：杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。易错点5不知道菌落计数比实际值“偏高”还是“偏低”点拨稀释涂布平板法统计样品中菌落的数目往往比实际数目“低”。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。而显微计数法中由于不能区分死菌与活菌，故所得数值可能“偏高”。规范答题甲醛是一种来源广泛的挥发性有机污染物，具有强烈的致癌和致畸作用，利用微生物降解甲醛来治理甲醛污染，具有高效、环保、无二次污染等优点。如图甲为采集活性污泥作为优良菌源，通过
22、筛选分离出能以甲醛为唯一碳源的高效降解菌的实验过程。请分析回答下列问题：(1)上述实验材料中，不需要进行灭菌处理的是_，培养基灭菌的常用方法为_。该实验过程所用的选择培养基只能以甲醛作为唯一碳源，其原因是_。(2)由的分离活性污泥中细菌的接种方法(如图乙)为_法，接种时，对接种环应进行_，在第二次及以后划线时，总是从上一次划线的末端开始，这样做的目的是_。(3)图乙表示在平板培养基上的第一次和第二次划线，请在图乙中画出第三次划线。(4)为研究甲醛初始浓度对菌株降解甲醛能力的影响，进行了相应实验。当甲醛的初始浓度小于1 200 mg/L时，菌株可以完全降解甲醛；当甲醛的初始浓度增高至1 600
23、mg/L时，48小时后菌株对甲醛的降解能力很弱，甚至失去降解能力，其原因可能是_。为了使该实验所得结果准确可靠，还应该设置_的对照实验，以排除甲醛自然挥发对实验结果的干扰。答卷采样原处纠错纠错依据答题不规范记忆不准确混淆“消毒”与“灭菌”混淆两种对照组随堂真题演练1.(2016全国课标卷，39)某同学用新鲜的泡菜滤液为实验材料分离纯化乳酸菌。分离纯化所用固体培养基中因含有碳酸钙而不透明，乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙。回答下列问题：(1)分离纯化乳酸菌时，首先需要用_对泡菜滤液进行梯度稀释，进行梯度稀释的理由是_。(2)推测在分离纯化所用的培养基中加入碳酸钙的作用有_和_。分离纯化时应
24、挑选出_的菌落作为候选菌。(3)乳酸菌在20长期保存时，菌液中常需要加入一定量的_(填“蒸馏水”、“甘油”或“碳酸钙”)。解析(1)分离纯化乳酸菌时，首先需要用无菌水对泡菜滤液进行梯度稀释；进行梯度稀释的理由是在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的乳酸菌将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。(2)在分离纯化所用的培养基中加入碳酸钙的作用有中和乳酸菌代谢过程中产生的乳酸和利于乳酸菌的识别和分离；分离纯化时应挑选出在平板上有透明圈的菌落作为候选菌。(3)乳酸菌在20 长期保存时应使用甘油管藏法，故菌液中常需要加入一定量的甘油。答案(1)无菌水泡菜滤液中菌的浓度高，直接培养很难分离得到
25、单菌落(2)鉴别乳酸菌中和产生的乳酸(或酸)具有透明圈(3)甘油2.(2015全国卷，39)已知微生物A可以产生油脂，微生物B可以产生脂肪酶。脂肪酶和油脂可用于生物柴油的生产。回答有关问题：(1)显微观察时，微生物A菌体中的油脂通常可用_染色。微生物A产生的油脂不易挥发，可选用_(填“萃取法”或“水蒸气蒸馏法”)从菌体中提取。(2)为了从自然界中获得能产生脂肪酶的微生物B的单菌落，可从含有油料作物种子腐烂物的土壤中取样，并应选用以_为碳源的固体培养基进行培养。(3)若要测定培养液中微生物B的菌体数，可在显微镜下用_直接计数；若要测定其活菌数量，可选用_法进行计数。(4)为了确定微生物B产生的脂
26、肪酶的最适温度，某同学测得相同时间内，在35 、40 、45 温度下降解10 g油脂所需酶量依次为4 mg、1 mg、6 mg，则上述三个温度中，_ 条件下该酶活力最小。为了进一步确定该酶的最适温度，应围绕_ 设计后续实验。解析(1)生物组织中的油脂能被苏丹(或苏丹)染成橘黄色(或红色)。(2)为了筛选出能产生脂肪酶的微生物B的单菌落，我们应选用只能让该菌落生长的选择性培养基，因此培养基中只能选用油脂作为唯一碳源的固体培养基。(3)血细胞计数板可用于直接计数培养液中的菌体数，但是不分死活，因此要计数活菌数量要通过稀释涂布平板法来计数。(4)温度影响酶的活性，在三个温度中，45 需酶量最高，说明酶活性最低；在三个温度实验中40 所需酶量最少，低于35 和45 所用酶量，说明酶的最适温度介于35 和45 之间，因此应围绕40 设计不同温度梯度，进行后续实验。答案(1)苏丹(或苏丹)萃取法(2)油脂(3)血细胞计数板稀释涂布平板(4)454015
