1、选修1知识点总结1.1 果酒和果醋的制作一、实验原理酶1酒精发酵的原理：酶 酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖，表达式为：C6H12O6+O2CO2+H2O+能量 酵母菌进行无氧呼吸产生酒精和二氧化碳，表达式为：C6H12O6C2H5OH+CO2+能量 酵母菌的营养代谢类型为异养兼性厌氧型。在有氧时，酵母菌大量繁殖，但是不起到发酵效果；在无氧时，繁殖速度减慢，但是此时可以进行发酵。在利用酵母菌发酵时最好是先通入足够的无菌空气在有氧环境下一段时间使其繁殖，再隔绝氧气进行发酵。20左右最适合酵母菌繁殖，酒精发酵的最佳温度是在1825，pH最好是弱酸性。酶2醋酸发酵的原理： 醋酸菌是好氧型细菌，当缺少糖源时
2、和有氧条件下，可将乙醇（酒精）氧化成醋酸。表达式为：C2H5OH+O2CH3COOH+H2O；当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸。醋酸菌生长的最佳温度是在3035二、实验步骤1. 对发酵瓶、纱布、榨汁机、盛葡萄汁的器皿等实验用具进行清洗并消毒。先用温水反复冲洗几次,再用体积分数为75%的酒精擦拭消毒，晾干待用。2. 取葡萄500 g，去除枝梗和腐烂的子粒。3. 用清水冲洗葡萄12遍除去污物，注意不要反复多次冲洗。4. 用榨汁机榨取葡萄汁后，将其装入发酵瓶中或将葡萄打成浆后，用洁净的纱布过滤至发酵瓶中，盖好瓶盖。如果没有合适的发酵装置，可以用500 mL的塑料瓶替代，但注入的果
3、汁量不要超过塑料瓶总体积的2/3。5. 将发酵瓶置于适宜的温度下发酵。6. 由于发酵旺盛期CO2的产量非常大，因此需要及时排气，防止发酵瓶爆裂。如果使用简易的发酵装置，如瓶子（最好选用塑料瓶），每天要拧松瓶盖24次，进行排气。7. 10 d以后，可以开始进行取样检验工作。例如，可以检验酒味、酒精的含量、进行酵母菌的镜检等工作。8. 当果酒制成以后，可以在发酵液中加入醋酸菌或醋曲，然后将装置转移至3035 的条件下发酵，适时向发酵液中充气。如果找不到醋酸菌菌种或醋曲，可尝试自然接种，但效果不是很好。如果没有充气装置，可以将瓶盖打开，在瓶口盖上纱布，以减少空气中尘土等的污染。三、注意事项请分析此装
4、置中的充气口、排气口和出料口分别有哪些作用。为什么排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接？结合果酒、果醋的制作原理，你认为应该如何使用这个发酵装置？充气口 排气口出料口答：充气口是在醋酸发酵时连接充气泵进行充气用的；排气口是在酒精发酵时用来排出CO2的；出料口是用来取样的。排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接，其目的是防止空气中微生物的污染。使用该装置制酒时，应该关闭充气口；制醋时，应将充气口连接气泵，输入氧气。1.2 腐乳的制作一、 实验原理1参与豆腐发酵的微生物有青霉、酵母、曲霉、毛霉等多种，其中起主要作用的是毛霉。2毛霉是一种丝状真菌，营养代谢类型为异养需氧型，最适生长温度为15-
5、18，常见于土壤、水果、蔬菜、谷物上，具有发达的白色菌丝。3.毛酶等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可将脂肪分解成甘油和脂肪酸。二、实验步骤1.将豆腐切成3cm3cm1cm的若干块。所用豆腐的含水量为70左右，水分过多则腐乳不易成形。2.将豆腐块平放在铺有干粽叶的盘内，粽叶可以提供菌种，并能起到保温的作用。每块豆腐等距离排放，周围留有一定的空隙。豆腐上面再铺上干净的粽叶。气候干燥时，将平盘用保鲜膜包裹，但不要封严，以免湿度太高，不利于毛霉的生长。 3.将平盘放入温度保持在1518的地方。毛霉逐渐生长，大约5d后豆腐表面丛生着直立菌丝。 4.当毛霉生长旺盛，并
6、呈淡黄色时，去除包裹平盘的保鲜膜以及铺在上面的粽叶，使豆腐块的热量和水分能够迅速散失，同时散去霉味。这一过程一般持续36h以上。 5.当豆腐凉透后，将豆腐间连接在一起的菌丝拉断，并整齐排列在容器内，准备腌制。 6.长满毛霉的豆腐块（以下称毛坯）与盐的质量分数比为51。将培养毛坯时靠近平盘没长直立菌丝的一面统一朝向玻璃瓶边，将毛坯分层盘立摆放在容器中。分层加盐，并随层加高而增加盐量，在瓶口表面铺盐厚些，以防止杂菌从瓶口进入。约腌制8d。 注：加盐可以析出豆腐中的水分，有利于腐乳成型；盐能够抑制微生物的生长，并且可以调味。用盐腌制时，注意盐都用量。盐的浓度过低，不足以抑制微生物生长，可能导致豆腐腐
7、败变质；盐的浓度过高，会影响腐乳的口味。7.将黄酒、米酒和糖，按口味不同而配以各种香辛料（如胡椒、花椒、八角茴香、桂皮、姜、辣椒等）混合制成卤汤。卤汤酒精含量控制在12左右为宜。 注：酒精含量的高低与腐乳后期发酵时间的长短有很大关系。酒精含量越高，对蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延长；酒精含量过低，蛋白酶的活性高，加快蛋白质的水解，杂菌繁殖快，豆腐易腐败，难以成块。 8.将广口玻璃瓶刷干净后，用高压锅在100蒸汽灭菌30min。将腐乳咸坯摆入瓶中，加入卤汤和辅料后，将瓶口用酒精灯加热灭菌，用胶条密封。在常温情况下，一般六个月可以成熟。三、注意事项1.酿造腐乳的主要生产工序是将豆腐进行前期
8、发酵和后期发酵。前期发酵所发生的主要变化是毛霉在豆腐（白坯）上的生长。发酵的温度为1518，此温度不适于细菌、酵母菌和曲霉的生长，而适于毛霉慢慢生长。毛霉生长大约5d后使白坯变成毛坯。前期发酵的作用，一是使豆腐表面有一层菌膜包住，形成腐乳的“体”；二是毛霉分泌以蛋白酶为主的各种酶，有利于豆腐所含有的蛋白质水解为各种氨基酸。后期发酵主要是酶与微生物协同参与生化反应的过程。通过腌制并配入各种辅料（红曲、面曲、酒酿），使蛋白酶作用缓慢，促进其他生化反应，生成腐乳的香气。课题1.3 制作泡菜并检测亚硝酸盐含量一、实验原理1. 制作泡菜所用微生物是乳酸杆菌其代谢类型是异养厌氧型。在无氧条件下，将糖分解为
9、乳酸，分裂方式是二分裂。反应式为：C6H12O62C3H6O3+能量含抗生素牛奶不能生产酸奶的原因是抗生素能杀死细菌和放线菌。常见的乳酸菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌。乳酸杆菌常用于生产酸奶。2. 亚硝酸盐为白色粉末，易溶于水，在食品生产中用作食品添加剂。亚硝酸盐含量膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康，国家规定肉制品中不超过30mg/kg，酱腌菜中不超过20mg/kg，婴儿奶粉中不超过2mg/kg。亚硝酸盐被吸收后随尿液排出体外，但在适宜pH 、温度和一定微生物作用下形成致癌物质亚硝胺。3. 一般在腌制 10 天后亚硝酸盐含量开始降低，故在10天之后食用最好发酵时间（d）4. 测定亚硝酸盐含量的原
10、理是在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与 N-1-萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料，与已知浓度的标准显色液目测比较，估算泡菜中亚硝酸盐含量。2.1 微生物的实验室培养一、基础知识1. 培养基：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，是进行微生物培养的物质基础。（1）培养基的分类：培养基按照物理性质可分为液体培养基、半固体培养基和固体培养基。在液体培养基中加入凝固剂琼脂（是从红藻中提取的一种多糖，在配制培养基中用作凝固剂）后，制成琼脂固体培养基。微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落。根据菌落的特征可以判断是哪一种菌。液体培养基应
11、用于工业或生活生产，固体培养基应用于微生物的分离和鉴定，半固体培养基则常用于观察微生物的运动及菌种保藏等。按照成分培养基可分为人工合成培养基和天然培养基。合成培养基是用成分已知的化学物质配制而成，其中成分的种类比例明确，常用于微生物的分离鉴定。天然培养基是用化学成分不明的天然物质配制而成，常用于实际工业生产。按照培养基的用途，可将培养基分为选择培养基和鉴定培养基。选择培养基是指在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物的生长。鉴别培养基是根据微生物的特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同类别的微生物。（2）培养基的成分：培养基的化学成分包
12、括水、无机盐、碳源、氮源、生长因子等。碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如CO2、NaHCO3等无机碳源；糖类、石油、花生粉饼等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如N2、NH3、NO3-、NH4+（无机氮源）蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有机氮源）等。只有固氮微生物才能利用N2。培养基还要满足微生物生长对PH、特殊营养物质以及氧气的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时须将培养基的pH调至酸性，培养细菌是需要将pH调至中性或微碱性，培养厌氧型微生物是则需要提供无氧的条件2. 无菌技术a. 获得
13、纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，要注意以下几个方面： 对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。 将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。 为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。 实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。b. 无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。c. 消毒与灭菌的区别 消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。消毒方法常用煮沸消毒法，巴氏消毒法（对于一些不耐高温的液
14、体）还有化学药剂（如酒精、氯气、石炭酸等）消毒、紫外线消毒。 灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。d 常用器具的灭菌方法： 接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法； 玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱； 培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅。 表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯。比较项理化因素的作用强度消灭微生物的数量芽孢和孢子能否被消灭消毒较为温和部分生活状态的微生物不能灭菌强烈全部微生物能3实验操作（1）制作牛肉膏蛋白胨固体培养基 方法步骤：计算、
15、称量、溶化、灭菌、倒平板。 倒平板操作：a. 将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。b. 右手拿锥形瓶，将瓶口迅速通过火焰。c. 用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约1020mL）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。d. 等待平板冷却凝固，大约需510min。然后，将平板倒过来放置，使培养皿盖在下、皿底在上。倒平板操作的讨论 培养基灭菌后，需要冷却到50左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？提示：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。 为什么需要
16、使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。 平板冷凝后，为什么要将平板倒置？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。（2）纯化大肠杆菌 微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。 平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。将聚集的菌种
17、逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。 稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。 用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。（3）平板划线法操作步骤：将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞。将试管口通过火焰。将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。将试管通过火焰，并塞上棉塞。左手将皿盖打开一条缝隙，右手将
18、沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养皿。灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。将平板倒置放入培养箱中培养。平板划线操作的讨论1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线
19、时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。（4）涂布平板操作的步骤：将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。取少量菌液，滴加到培养基表面。将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却810s。用涂布器将菌液均
20、匀地涂布在培养基表面。涂布平板操作的讨论1. 涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第二步应如何进行无菌操作？提示：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。（4）菌种的保存（1）对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。临时保藏方法将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，在合适的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入4的冰箱中保藏。以后每36个月，都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上。缺点：这种方法保存的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。（2）对于需要长期
21、保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。在3mL的甘油瓶中，装入1mL甘油后灭菌。将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在20的冷冻箱中保存。（5）疑难解答 生物的营养营养是指生物摄取、利用营养物质的过程。营养物质是指维持机体生命活动，保证发育、生殖所需的外源物质。人及动物的营养物质：水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类。植物的营养物质：矿质元素、水、二氧化碳等三类。微生物的营养物质：水、无机盐、碳源、氮源及特殊营养物质五类。 确定培养基制作是否合格的方法将未接种的培养基在恒温箱中保温12天，无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。2.2 土壤中分解尿素的细菌
22、的分离与计数尿素：是一种重要的农业氮肥，尿素并不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后，才能被植物利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为他们能合成脲酶。尿素最初是从人的尿液中发现的一、筛选菌株：（1）实验室中微生物的筛选应用的原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。（2）选择性培养基在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。（3）配制选择培养基的依据根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基中不加入有机物可以选择培养自养微生物；
23、培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物；加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。二、统计菌落数目（1）测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。（2）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果准确，一般设置35个平板，选择菌落数在30300的平板进行计数，并取平均值。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。三、设置对照设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响
24、，提高实验结果的可信度。对照实验是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照试验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。四、实验设计实验设计包括实验方案，所需仪器、材料、用具和药品，具体的实施步骤以及时间安排等的综合考虑和安排。（1）土壤取样：同其他生物环境相比，土壤中的微生物，数量最大，种类最多。在富含有机质的土壤表层，有更多的微生物生长。从富含有机物、潮湿、pH7的土壤中取样。铲去表层土，在距地表约38cm的土壤层取样。（2）样品的稀释：样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得
25、菌落数在30300之间、适于计数的平板。测定土壤中细菌的数量，一般选用104、105、106测定放线菌的数量，一般选用103、104、105测定真菌的数量，一般选用102、103、104（3）微生物的培养与观察不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌3037 12天放线菌2528 57天霉菌2528 34天每隔24小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致一楼菌落的数目。一般来说，在一定的培养条件下（相同的培养基、唯独及培养时间），同种微生物表现出稳定的菌落特征。形状、大小、隆起程度、颜色五、疑难解答（1）如何从平板上的菌落数推测出
26、每克样品中的菌落数？统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个以上平板，计算出平板菌落数的平均值每克样品中的菌落数=（C/V）*M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（ml），M代表稀释倍数2.3 分解纤维素的微生物的分离一、纤维素与纤维素酶纤维素：一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。（1）棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，木材、作物秸秆等也富含纤维素。（2）纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤
27、维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养。二、纤维素分解菌的筛选（1）筛选方法：刚果红染色法。能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选。（2）刚果红染色法筛选纤维素分解菌的原理刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。三、分离分解纤维素的微生物的实验流程土壤取样选择培养（此步是否需要，应根
28、据样品中目的菌株数量的多少来确定）梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落（1）土壤采集：选择富含纤维素的环境。（2）刚果红染色法分离纤维素分解菌的步骤：倒平板操作、制备菌悬液、涂布平板（3）刚果红染色法种类：一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红。四、课题延伸对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选后，只是分离纯化的第一步，为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。纤维素酶的测定方法，一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。五、疑难解答（1）为什么
29、要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。（2）将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将纸埋于深约10cm左右腐殖土壤中。（3）两种刚果红染色法的比较方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有
30、淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。方法二的另一缺点是：有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。（4）为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。3.1 菊花的组织培养一、植物细胞工程具有某种生物全套遗传信息的任何一个活细胞，都具有发育成完整个体的能力，即
31、每个生物细胞都具有全能性。但在生物体的生长发育过程中并不表现出来，这是因为在特定的时间和空间条件下，通过基因的选择性表达，构成不同组织和器官。植物组织培养技术的应用：实现优良品种的快速繁殖；培育脱毒作物；制作人工种子；培育作物新品种以及细胞产物的工厂化生产等。二、植物组织培养的基本过程细胞分化：在生物个体发育过程中，细胞在形态、结构和生理功能上出现稳定性差异的过程。愈伤组织：离体的植物组织或细胞，在培养了一段时间以后，会通过细胞分裂，形成愈伤组织，愈伤组织的细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。脱分化：由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化
32、，或者叫做去分化。再分化：脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫做再分化。细胞分化是一种持久性的变化，它有什么生理意义？答：使多细胞生物体中细胞结构和功能趋向专门化，有利于提高各种生理功能的效率。比较根尖分生组织和愈伤组织的异同组织类型细胞来源细胞形态细胞结构细胞排列细胞去向根尖分生组织受精卵正方形无液泡紧密分化成多种细胞组织愈伤组织高度分化细胞无定形高度液泡化疏松再分化成新个体相同点都通过有丝分裂进行细胞增殖三、影响植物组织培养的条件（1）材料：不同的植物组织，培养的难易程度差别很大。植物材料的选择直接关系到试验的成败。植物的种类、材料的年龄和保存时间的长
33、短等都会影响实验结果。菊花组织培养一般选择未开花植物的茎上部新萌生的侧枝作材料。一般来说，容易进行无性繁殖的植物容易进行组织培养。选取生长旺盛嫩枝进行组培的是嫩枝生理状态好，容易诱导脱分化和再分化。（2）营养：离体的植物组织和细胞，对营养、环境等条件的要求相对特殊，需要配制适宜的培养基。常用的培养基是MS培养基，其中含有的大量元素是N、P、S、K、Ca、Mg，微量元素是Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、I、Co，有机物有甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等。（3）激素：植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强趋势。在培
34、养基中需要添加生长素和细胞分裂素等植物激素，其浓度、使用的先后顺序、用量的比例等都影响结果。使用顺序实验结果先生长素，后细胞分裂素有利于分裂但不分化先细胞分裂素，后生长素细胞既分裂也分化同时使用分化频率提高生长素 细胞分裂素比值与结果比值高时促根分化，抑芽形成比值低时促芽分化，抑根形成比值适中促进愈伤组织生长（4）环境条件：PH、温度、光等环境条件。 不同的植物对各种条件的要求往往不同。进行菊花的组织培养，一般将pH控制在5.8左右，温度控制在1822，并且每日用日光灯照射12h. 四、操作流程（1）配制MS固体培养基：配制各种母液：将各种成分按配方比例配制成的浓缩液（培养基母液）。使用时根据
35、母液的浓缩倍数，计算用量，并加蒸馏水稀释。配制培养基：应加入的物质有琼脂、蔗糖、大量元素、微量元素、有机物和植物激素的母液，并用蒸馏水定容到1000毫升。在菊花组织培养中，可以不添加植物激素原因是菊花茎段组织培养比较容易。灭菌：采取的灭菌方法是高压蒸汽灭菌。MS培养基中各种营养物质的作用是什么？与肉汤培养基相比，MS培养基有哪些特点？大量元素和微量元素提供植物细胞所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，维持细胞渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。微生物培养基以有机营养为主，MS培养基则需提供大量无机营养。（2）外植体的消毒外植体：用于离
36、体培养的植物器官或组织片段。选取菊花茎段时，要取生长旺盛的嫩枝。菊花茎段用流水冲洗后可加少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min左右。用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为70%的酒精中摇动23次，持续67s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗。取出后仍用无菌吸水纸吸干外植体表面水分，放入质量分数为0.1%的氯化汞溶液中12min。取出后，在无菌水中至少清洗3次，漂洗消毒液。注意：对外植体进行表面消毒时，就要考虑药剂的消毒效果，又要考虑植物的耐受能力。（3）接种：接种过程中插入外植体时形态学上端朝上，每个锥形瓶接种78个外植体。外植体接种与细菌接种相似，操作步骤相同，而
37、且都要求无菌操作。（4）培养：应该放在无菌箱中进行，并定期进行消毒，保持适宜的温度（1822）和光照（12h）（5）移栽：栽前应先打开培养瓶的封口膜，让其在培养间生长几日，然后用流水清洗根部培养基。然后将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中生活一段时间，进行壮苗。最后进行露天栽培。（6）栽培 ：外植体在培养过程中可能会被污染，原因有外植体消毒不彻底；培养基灭菌不彻底；接种中被杂菌污染；锥形瓶密封性差等。3.2 月季的花药培养一、基础知识（1）被子植物的花粉发育被子植物的雄蕊通常包含花丝、花药两部分。花药为囊状结构，内部含有许多花粉。花粉是由花粉母细胞经过减数分裂而形成的，因此，花粉是单倍体的
38、生殖细胞。（2）被子植物花粉的发育要经历小孢子四分体时期、单核期和双核期等阶段。四分体时期：4个由小孢子母细胞经减数分裂得到的单倍体细胞连在一起。单核期：四分体的4个单倍体细胞彼此分离，形成4个具有单细胞核的花粉粒。这时的细胞含浓厚的原生质，核位于细胞的中央（单核居中期）。随着细胞不断长大，细胞核由中央移向细胞一侧（单核靠边期）。双核期：小孢子分裂成1个生殖细胞核和1个花粉管细胞核，进而形成两个细胞，一个是生殖细胞，一个是营养细胞，这个过程是有丝分裂，形成的是两细胞型花粉粒。生殖细胞将再进行一次有丝分裂，形成两个精子，形成三细胞型花粉粒。一个营养细胞和两个生殖细胞具有相同的染色体数目和基因型，
39、都是单倍体。注意： 成熟的花粉粒有两类，一类是二核花粉粒，其花粉粒中只含花粉管细胞核和生殖细胞核，二核花粉粒的精子是在花粉管中形成的；另一类是三核花粉粒，花粉在成熟前，生殖细胞就进行一次有丝分裂，形成两个精子，此花粉粒中含有两个精子核和一个花粉管核（营养核） 花粉发育过程中的四分体和动物细胞减数分裂的四分体不同。花粉发育过程中的四分体是花粉母细胞经减数分裂形成的4个连在一起的单倍体细胞；而动物细胞减数分裂过程中的四分体是联会配对后的一对同源染色体，由于含有四条染色单体而称为四分体。 同一生殖细胞形成的两个精子，其基因组成完全相同。（3）产生花粉植株的两种途径通过花药培养产生花粉植株（即单倍体植
40、株）一般有两种途径，一种是花粉通过胚状体阶段发育为植物，另一种是花粉在诱导培养基上先形成愈伤组织，再将其诱导分化成植株。这两种途径之间并没有绝对的界限，主要取决于培养基中激素的种类及其浓度配比。注意： 无论哪种产生方式，都要先诱导生芽，再诱导生根 胚状体：植物体细胞组织培养过程中，诱导产生的形态与受精卵发育成的胚非常类似的结构，其发育也与受精卵发育成的胚类似，有胚芽、胚根、胚轴等完整结构，就像一粒种子，又称为细胞胚。（3）影响花药培养的因素诱导花粉能否成功及诱导成功率的高低，受多种因素影响，其中材料的选择与培养基的组成是主要的影响因素亲本的生理状况：花粉早期是的花药比后期的更容易产生花粉植株，
41、选择月季的初花期。合适的花粉发育时期：一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养成功率最高花蕾：选择完全未开放的花蕾亲本植株的生长条件、材料的低温预处理以及接种密度等对诱导成功率都有一定影响二、实验操作（1）材料的选取：选择花药时，一般要通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期。确定花粉发育时期的最常用的方法是醋酸洋红法。但是，某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙花青-铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色（2）材料的消毒（3）接种和培养：灭菌后的花蕾，要在无菌条件下除去萼片和花瓣，并立即将花药接种到培养基上。在剥离花药时，要尽量不损伤花药（否则接种后容易从受伤部位长
42、生愈伤组织），同时还要彻底去除花丝，因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成，通常每瓶接种花药710个,培养温度控制在25左右,不需要光照.幼小植株形成后才需要光照。一般经过2030天培养后,会发现花药开裂,长出愈伤组织或形成胚状体。将愈伤组织及时转移到分化培养基上，以便进一步分化出再生植株。如果花药开裂释放出胚状体，则一个花药内就会产生大量幼小植株，必须在花药开裂后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培养基上，否则这些植株将很难分开。还需要对培养出来的植株做进一步的鉴定和筛选。三、植物组织培养技术与花药培养技术的相同之处是：培养基配制方法、无菌技术及接种操作等基本相同。两者的不同之处在
43、于：花药培养的选材非常重要，需事先摸索时期适宜的花蕾；花药裂开后释放出的愈伤组织或胚状体也要及时更换培养基；花药培养对培养基配方的要求更为严格。这些都使花药培养的难度大为增加。6.1 植物芳香油的提取一、基础知识1天然香料的来源：植物、动物不同植物的根、茎、叶、花、果实、种子都可以提取芳香油。2. 芳香油的性质：挥发性强，成分复杂，以萜类化合物及其衍生物为主。3. 芳香油的提取方法：蒸馏、压榨、萃取等。（1）水蒸气蒸馏法： 原理：水蒸汽可将挥发性较强的芳香油携带出来形成油水混合物，冷却后水油分层。 方法：水中蒸馏：原料放在沸水中加热蒸馏。水上蒸馏：原料隔放在沸水上加热蒸馏。水汽蒸馏：利用外来高
44、温水蒸气加热蒸馏。不足：有些原料不适宜于水中蒸馏，如柑橘、柠檬等易焦糊，有效成分容易水解。（2）压榨法：通过机械压缩力将液相物从液固两相混合物中分离出来的一种简单操作。（3）萃取法：原理：芳香油易溶于有机溶剂，溶剂挥发后得到芳香油。如石油醚、酒精、乙醚等。方法：原料浸泡在溶剂中得到浸泡液有机溶剂挥发芳香油。不足：有机溶剂中的杂质影响芳香油的品质4. 实验装置（1）蒸馏装置包括：铁架台两个、酒精灯、石棉网、蒸馏瓶、橡胶塞、蒸馏头、温度计、直型冷凝管、接液管、锥形瓶，以及连接进水口和出水口的橡皮管。所有仪器必须事先干燥，保证无水。整套蒸馏装置可分为左、中、右三部分，其中左边的部分通过加热进行蒸馏，
45、中部将蒸馏物冷凝，右边的部分用来接收。安装仪器一般都按照自下而上、从左到右的顺序。拆卸仪器的顺序与安装时相反。具体安装顺序和方法如下。 固定热源酒精灯。 固定蒸馏瓶，使其离热源的距离（如图所示），并且保持蒸馏瓶轴心与铁架台的水平面垂直。 安装蒸馏头，使蒸馏头的横截面与铁架台平行。 连接冷凝管。保证上端出水口向上，通过橡皮管与水池相连；下端进水口向下，通过橡皮管与水龙头相连。 连接接液管（或称尾接管）。 将接收瓶瓶口对准尾接管的出口。常压蒸馏一般用锥形瓶而不用烧杯作接受器，接收瓶应在实验前称重，并做好记录。 将温度计固定在蒸馏头上，使温度计水银球的上限与蒸馏头侧管的下限处在同一水平线上。 蒸馏装
46、置安装完毕后，可以在蒸馏瓶中加几粒沸石，防止液体过度沸腾。打开水龙头，缓缓通入冷水，然后开始加热。加热时可以观察到，蒸馏瓶中的液体逐渐沸腾，蒸气逐渐上升，温度计读数也略有上升。当蒸气的顶端达到温度计水银球部位时，温度计读数急剧上升。在整个蒸馏过程中，应保证温度计的水银球上常有因冷凝作用而形成的液滴。控制蒸馏的时间和速度，通常以每秒12滴为宜。 蒸馏完毕，应先撤出热源，然后停止通水，最后拆卸蒸馏装置，拆卸的顺序与安装时相反。（2）分液漏斗的使用方法： 首先把活塞擦干，为活塞均匀涂上一层润滑脂，注意切勿将润滑脂涂得太厚或使润滑脂进入活塞孔中，以免污染萃取液。 塞好活塞后，把活塞旋转几圈，使润滑脂分布均匀。并用水检查分液漏斗的顶塞与活塞处是否渗漏，确认不漏水后再使用。1、焚烧处理垃圾的优缺点是什么？ 将分液漏斗放置在大小合适的、并已固定在铁架台上的铁圈中，关好活塞。将待分离的液体从上部开口处倒入漏斗中，塞紧顶塞，注意顶塞不能涂润滑脂。7、硫酸铜溶液与铁钉的反应属于化学反应。硫酸铜溶液的颜色是蓝色，将铁钉浸入硫酸铜溶液中，我们发现铁钉变红了。 取下分液漏斗，用右手手掌顶住漏斗顶塞并握住漏斗颈，左手握住漏斗活塞处，大拇指压紧活塞，将分液漏斗略倾斜，前后振荡（开
