1、杆状病毒表达系统(昆虫细胞的培养及杆状病毒滴度测定)2杆杆状状病病毒毒表表达达系系统统昆虫细胞的培养重组pFastBac质粒的构建重组Bacmid的产生与鉴定获得重组杆状病毒蛋白表达&病毒扩大3OverviewBac-to-Bac Baculovirus Expression System能快速并有能快速并有效的获得重组杆状病毒，其重组是基于供体质粒表达盒效的获得重组杆状病毒，其重组是基于供体质粒表达盒与杆状病毒穿梭载体与杆状病毒穿梭载体Bacmid间发生位点特异性转座。间发生位点特异性转座。供体质粒供体质粒pFastBacpFastBac：靶基因位于杆状病毒特异启动子下游：靶基因位于杆状病毒
2、特异启动子下游DH10BacDH10Bac：杆状病毒穿梭载体：杆状病毒穿梭载体Bacmid+Bacmid+辅助质粒辅助质粒4Bac-to-Bac 表达系统的组成和工作原理5Bac-to-Bac 表达系统的组成和工作原理6Expermiantal outline7Insect Cell Lines：Sf9 or Sf21 cells主要用于转染，空斑实验和滴度测定主要用于转染，空斑实验和滴度测定High Five cells or Mimic Sf9 cells转染效率低，主要用于蛋白表达转染效率低，主要用于蛋白表达 Graces Insect Medium with L-glutamine a
3、nd supplemented with（pH 6.5）：）：3330 mg/L lactalbumin hydrolysate3330 mg/L yeastolate350 mg/L NaHCO310%heat-inactivated fetal bovine serum昆虫细胞的培养昆虫细胞的培养8Atmosphere：air,100%pipetting across the monolayer scraping cell scrapers hitting the flask against the palm of your handTemperature：27.028.0 Subcult
4、uring：Preservation：90%serum,10%DMSO严格程序降温，严格程序降温，-80 过夜后转移液氮保存。过夜后转移液氮保存。昆虫细胞的培养910重组pFastBac质粒的构建选择合适的载体选择合适的载体 11重组Bacmid的产生12重组Bacmid的鉴定PCR法法:pUC/M13 Forward and Reverse primer 或者或者pUC/M13 Forward or Reverse primer and a primer that hybridizes within your insertBacmid DNA 135kb13获得重组杆状病毒转染Sf9 cel
5、ls1.小提好的小提好的Bacmid DNA，置置4 不超过不超过1周周2.转染试剂：转染试剂：Cellfectin Reagent3.转染后细胞的形态变化转染后细胞的形态变化细胞细胞变大变大增殖明显变慢增殖明显变慢或不增殖或不增殖裂解裂解脱落脱落融合融合(VSV/G)或或4.收毒，短期内收毒，短期内4 避光保存，长期保存分装后置避光保存，长期保存分装后置-80 14病毒扩增&蛋白表达 扩增病毒：接毒量为扩增病毒：接毒量为 0.050.1 MOI一般情况下，一般情况下，P1代毒滴度大概为代毒滴度大概为1106 1107 PFU/ml，P2 代毒滴度代毒滴度11071108 PFU/ml比如：比
6、如：P1代毒滴度为代毒滴度为5106 PFU/ml，T75细胞瓶的细胞量细胞瓶的细胞量 2107cells，那么，那么蛋白表达：接毒量为蛋白表达：接毒量为 15 MOI15杆状病毒滴度测定两种病毒滴度测定方法的比较：两种病毒滴度测定方法的比较：空斑实验法测定滴度依赖于病毒在感染细胞中的复制以及感染空斑实验法测定滴度依赖于病毒在感染细胞中的复制以及感染周边细胞形成周边细胞形成局灶局灶型病变；而免疫染色法只需要病毒感染靶细型病变；而免疫染色法只需要病毒感染靶细胞并表达病毒所编码的蛋白。因此，免疫染色法胞并表达病毒所编码的蛋白。因此，免疫染色法（infectious units per ml,or
7、IFU/ml）测定病毒滴度需要的时间比空斑法测定病毒滴度需要的时间比空斑法（PFU/ml）更短。更短。16BacPAK Rapid Titer Kit 本测定方法，以针对杆状病毒囊膜蛋白本测定方法，以针对杆状病毒囊膜蛋白gp64的的单克隆抗体标记被病毒感染的细胞，然后以单克隆抗体标记被病毒感染的细胞，然后以HRP-标标记的二抗与感染细胞进行染色。通过底物显色，在记的二抗与感染细胞进行染色。通过底物显色，在光学显微镜下计数感染斑点的数量，经过稀释倍数光学显微镜下计数感染斑点的数量，经过稀释倍数的换算，即可得出病毒的滴度（的换算，即可得出病毒的滴度（IFU/ml）。）。1718注意事项注意事项：细
8、胞铺板细胞铺板5 106 cells/well，细胞计数要准，台盼蓝染，细胞计数要准，台盼蓝染 色，保证细胞活力色，保证细胞活力 95%。2.病毒稀释要准，不同浓度之间换枪头，是确保不同稀释病毒稀释要准，不同浓度之间换枪头，是确保不同稀释 度孔斑点成度孔斑点成10倍关系的关键。倍关系的关键。3.整个过程中，轻轻洗板，避免细胞脱落过多。整个过程中，轻轻洗板，避免细胞脱落过多。4.实验完毕实验完毕3 h后数斑，效果更佳。后数斑，效果更佳。5.结果判定：结果判定：19疫疫苗苗免免疫疫动动物物后后免免疫疫效效力力评评价价体液免疫检测ELISA抗体中和抗体细胞免疫检测细胞因子mRNA水平检测qPCR细胞
9、因子蛋白质水平检测ELISA淋巴增殖实验MTT法20ELISA抗体 制备良好的抗原包被制备良好的抗原包被ELISA板板纯化的蛋白或病毒纯化的蛋白或病毒3.设置空白孔（不加血清），统计结果时，所有实验组的设置空白孔（不加血清），统计结果时，所有实验组的 OD值先减掉背景值，再计算比值和滴度。值先减掉背景值，再计算比值和滴度。（1）蛋白质与酶标板的结合主要是靠疏水作用的物理吸附，而包被液）蛋白质与酶标板的结合主要是靠疏水作用的物理吸附，而包被液的的PH大于蛋白的大于蛋白的PI，有利于蛋白质疏水键的适当暴露。，有利于蛋白质疏水键的适当暴露。（2）酶标板聚苯乙烯表面暴露的主要是）酶标板聚苯乙烯表面暴露
10、的主要是CH键，包被液键，包被液PH大于蛋白大于蛋白PI，使蛋白质带上负电荷，有利于蛋白质与酶标板的牢固结合，提，使蛋白质带上负电荷，有利于蛋白质与酶标板的牢固结合，提高包被效率。高包被效率。每次包被板子条件一致，每次包被板子条件一致，4 16-18h。2.血清样品不溶血，防止干扰结果。血清样品不溶血，防止干扰结果。方阵滴度确定最佳抗原包被浓度。方阵滴度确定最佳抗原包被浓度。21微量中和实验技术中和抗体22中和实验原理23分 类固定病毒固定病毒稀释血清法稀释血清法固定血清固定血清稀释病毒法（用的很少）稀释病毒法（用的很少）用 途疾病诊断疾病诊断病毒分离株的鉴定病毒分离株的鉴定不同病毒株的抗原关
11、系研究不同病毒株的抗原关系研究疫苗免疫原性的评疫苗免疫原性的评免疫血清的质量评价免疫血清的质量评价测定实验动物血清中是否存在抗体测定实验动物血清中是否存在抗体24材 料 病毒病毒（1）冻存的病毒不能重复使用）冻存的病毒不能重复使用（2）进行中和实验前，需先进行病毒滴定（）进行中和实验前，需先进行病毒滴定（TCID50）的滴定）的滴定进行病毒定量进行病毒定量2.血清样品血清样品（1）血清样品分装冻存于）血清样品分装冻存于-20，一般不要反复冻融，一般不要反复冻融3次以上。次以上。（2）血清样品不溶血，不长期冻存，以减少对细胞的毒性。）血清样品不溶血，不长期冻存，以减少对细胞的毒性。（3）需要有阳
12、性和阴性对照血清，实验前需）需要有阳性和阴性对照血清，实验前需56灭活灭活30分钟分钟。3.细胞和细胞培养试剂细胞和细胞培养试剂（1）对数生长期细胞）对数生长期细胞（2）DMEM/血清血清/胰酶胰酶/抗生素抗生素25固定病毒固定病毒稀释血清法稀释血清法 将不同稀释度的血清与固定量的病将不同稀释度的血清与固定量的病（200TCID50、EID50或LD50）混合，适当的条件下感作一定时间以后，混合，适当的条件下感作一定时间以后，再将血清再将血清-病毒混合物接种于敏感细胞、鸡胚或实验动物，病毒混合物接种于敏感细胞、鸡胚或实验动物，测定被检血清阻止组织培养细胞、鸡胚或实验动物发生测定被检血清阻止组织
13、培养细胞、鸡胚或实验动物发生病毒感染的能力及其效价。以能保护病毒感染的能力及其效价。以能保护50%组织培养细胞、组织培养细胞、鸡胚或实验动物不发生病变、感染或死亡的血清最高稀鸡胚或实验动物不发生病变、感染或死亡的血清最高稀释倍数，作为该血清的释倍数，作为该血清的50%中和效价中和效价(PD50)。2627将将9696孔细胞培养板放入孔细胞培养板放入37 5%CO37 5%CO2 2培养箱中作用培养箱中作用45 min45 min60 min60 min。感作完成后每孔加入感作完成后每孔加入100 100 l l细胞悬液，继续置细胞悬液，继续置37 37 5%CO5%CO2 2培养箱培养，逐日观
14、察并记录结果，一般要培养箱培养，逐日观察并记录结果，一般要观察观察4-54-5天。天。结果计算，按结果计算，按Reed-MuenchReed-Muench两氏法或两氏法或KarberKarber法进行。法进行。2829距离比例距离比例=(高于高于50%的保护率的保护率-50%)/(高于高于50%的保护率的保护率-低于低于50%的保护率的保护率)=(66.7-50)/(66.7-16.7)=0.33 PD50=-1.299PD50=-1.299的反对数的反对数=0.05=1/20=0.05=1/20即即1:201:20稀释的待检血清可保护稀释的待检血清可保护50%50%的组织培养细胞不出现的组织
15、培养细胞不出现CPECPE中和效价中和效价(PD50)的计算：的计算：lgPD50=高于高于50%保护率的血清稀释度的对数保护率的血清稀释度的对数 +距离比例距离比例稀释度对数的差稀释度对数的差 =-1.2+0.33(-0.3)=-1.29930固定血清固定血清稀释病毒法稀释病毒法 在固定量的血清中，加入等量不同稀释度的病毒，用对在固定量的血清中，加入等量不同稀释度的病毒，用对照非免疫血清（对照组）和待检血清同时进行测定，计算每照非免疫血清（对照组）和待检血清同时进行测定，计算每一组的一组的TCID50、EID50或或LD50，然后计算中和指数。，然后计算中和指数。3132注意事项注意事项：待
16、检血清需待检血清需56灭活灭活30分钟。分钟。需重复测定抗体时，血清应分装后冻存，以免反复冻融。需重复测定抗体时，血清应分装后冻存，以免反复冻融。细胞应处于对数生长期，严禁细胞过度生长或老化，细细胞应处于对数生长期，严禁细胞过度生长或老化，细胞胞 活力活力 95%。4.牛血清有中和病毒感染力的作用，实验过程中切勿将细胞牛血清有中和病毒感染力的作用，实验过程中切勿将细胞 培养液与病毒稀释液混淆使用。培养液与病毒稀释液混淆使用。5.病毒与抗血清混合，常规采用病毒与抗血清混合，常规采用37作用作用1小时。但针对不小时。但针对不 同耐热性的病毒，孵育温度和时间应有所增减。同耐热性的病毒，孵育温度和时间
17、应有所增减。6.每份血清做每份血清做3个生物学重复。个生物学重复。33细胞免疫的检测首先要完成淋巴的分离和体外刺激包括脾淋巴细胞/外周血单核细胞的分离 34脾细胞的分离：2.将脾脏转入匀浆器中，加少量将脾脏转入匀浆器中，加少量不完全不完全1640，轻轻研磨。，轻轻研磨。1.处死的小鼠经消毒后，放置于泡沫板右侧卧固定，剪开左处死的小鼠经消毒后，放置于泡沫板右侧卧固定，剪开左侧背腹交界处皮肤，分三套镊子侧背腹交界处皮肤，分三套镊子/剪刀无菌取脾脏剪刀无菌取脾脏3.静置，吸上清液入静置，吸上清液入15 ml离心管中，离心管中，1000rpm10 min。4.弃上清，加入弃上清，加入5 ml的的8.3
18、g/l NH4Cl，静止，静止5 min(去除红细去除红细胞胞)，1000 rpm 10 min。5.弃上清，用不完全弃上清，用不完全RPMI-1640洗涤，洗涤，1000 rpm 10 min。6.细胞计数，台盼蓝染色，要求细胞活性应在细胞计数，台盼蓝染色，要求细胞活性应在95%以上。以上。7.调整浓度为调整浓度为4106 cells/ml。35外周血单核细胞的分离：36细胞因子的定量PCR检测：（1）于）于24孔板中加入适量的相关刺激原（孔板中加入适量的相关刺激原（based on in vitro dose-response studies），然后将浓度为），然后将浓度为4106 cel
19、ls/ml的细的细胞悬液加至各孔内，每孔胞悬液加至各孔内，每孔1 ml。（2）置）置37，5%CO2温箱中培养温箱中培养20 h，提取细胞总，提取细胞总RNA并并测定测定 RNA浓度和纯度。浓度和纯度。（3）取）取0.5 g RNA进行逆转录（进行逆转录（TOYOBO反转录试剂）。反转录试剂）。（4）定量）定量PCR：37细胞因子的ELISA检测：（1）于）于24孔板中加入适量的相关刺激原（孔板中加入适量的相关刺激原（based on in vitro dose-response studies），然后将浓度为），然后将浓度为4106 cells/ml的细的细胞悬液加至各孔内，每孔胞悬液加至各
20、孔内，每孔1 ml。（2）置）置37，5%CO2温箱中培养温箱中培养72 h后，收取细胞上清。后，收取细胞上清。（3）详细阅读说明书的实验步骤（不同牌子试剂盒稍有不）详细阅读说明书的实验步骤（不同牌子试剂盒稍有不同），严格按要求操作。同），严格按要求操作。标准曲线是判定实验的质量。标准曲线是判定实验的质量。38细胞免疫检测注意事项细胞免疫检测注意事项：分离淋巴细胞的速度要快，避免体外长时间操作导致分离淋巴细胞的速度要快，避免体外长时间操作导致 过多淋巴的活性降低和死亡。过多淋巴的活性降低和死亡。2.台盼蓝染色计数，保证实验组间有效细胞的数量相同。台盼蓝染色计数，保证实验组间有效细胞的数量相同。3.准备免疫原性较好的刺激，并通过预实验确定最佳刺准备免疫原性较好的刺激，并通过预实验确定最佳刺 激剂量。激剂量。4.RNA提取时，不丢弃提取时，不丢弃24孔板中淋巴细胞上清。孔板中淋巴细胞上清。5.严格按照细胞因子严格按照细胞因子ELISA试剂盒操作步骤实验。试剂盒操作步骤实验。
