1、1第二章 红细胞血型检测红细胞血型检测2目录第一节第一节 输血前免疫学检查输血前免疫学检查第二节第二节 盐水介质试验技术盐水介质试验技术第三节第三节 酶处理试验技术酶处理试验技术第四节第四节 抗球蛋白试验技术抗球蛋白试验技术第五节第五节 聚凝胺介质试验技术聚凝胺介质试验技术第六节第六节 微柱凝集试验技术微柱凝集试验技术第七节第七节 吸收放散技术吸收放散技术第八节第八节 凝集试验技术凝集试验技术第九节第九节 红细胞血型分子生物学检测技术红细胞血型分子生物学检测技术3学习要求：学习要求：1.输血前主要包括哪些内容？2.受血标本接受时的注意事项有哪些？3.ABO血型和RhD血型鉴定时的注意事项有哪些
2、？4.交叉配血试验的影响因素有哪些？5.抗球蛋白试验的临床应用有哪些方面？6.红细胞血型分子生物学检测技术主要有哪些？4第一节第一节 输血前免疫学检查输血前免疫学检查目的：是输入的血液成分在受血者的体内发挥其有效作用.在正常情况下，输入的红细胞在受血者体内不溶血，输入的的血浆成分不破坏受血者的红细胞。主要程序：患者的病史和标本等的检查、核对及处理;ABO血型和RhD血型定型；红细胞同种抗体筛查和坚定；交叉配血试验；血小板输注前的抗体检查和配合试验；不规则抗体的筛选和鉴定；交叉配血结果的报告和发血等。5一、受血者标本的处理一、受血者标本的处理（一）标本的采集 输血除了需要达到预期的治疗效果外，必
3、须确保输血安全。血样由临床护士完成，因严格遵守一次只能为一位受血抽取标本，标本不得从输液管或输液侧筋脉中抽取。（二）标本的接收 输血科技师接收血样标本时，应认真核对受血者的相关信息，尽可能了解受血者有无输血史、药物史、妊娠史等情况。如果有输血史，这有必要进一步了解最后一次输血的日期，若3个月内输过血，那么供血者的红细胞没有完全代谢消失，可能依然存在于血液循环中，导致血型定型试验中出现混合凝集的结果。6（三）标本的要求1.对输血前检查的血液标本应严格要求能代表受血者当前的免疫学状况，标本还需经鉴定和标记，保证其准确无误地来自受血者和供血者，应和血液申请单上的内容一致。2.防止受血者血液标本稀释和
4、（或）溶血，若采集过程中发生溶血则不能使用。3.受血者配血试验对的血液标本必须是输血前3天采集的。4.若受血者使用右旋糖酐、PVP等治疗，应注意洗涤被检红细胞。5.每次输血后，受血者和供血者的标本必须保存于28至少7天。7二、受血者和供血者二、受血者和供血者ABOABO和和RhRh定型定型 （一）、原理 根据红细胞膜表面上有无A 抗原或B抗原，将血型分为 A型、B型、AB型、O型4种。A型人血清中含有抗-B抗体，B型人血清中含有抗-A抗体，O型人血清中含有抗-A抗体和抗-B抗体，AB型人血清中不含ABO抗体。正定型：用抗-A及抗-B试剂与被检红细胞反应，检测红细胞 表面是否存在A抗原或B抗原。
5、反定型：用标准A细胞及B细胞与被检血清反应，检测血清中是否存在抗体。由于ABO血型系统抗体多数为IgM类，在室温盐水介质中就能出现明显的凝集反应。8二、受血者和供血者二、受血者和供血者ABOABO和和RhRh定型定型9二、受血者和供血者二、受血者和供血者ABOABO和和RhRh定型定型 1.ABO定型 最适的反应温度为4，但在室温反应良好，所以常规的ABO定型试验仅在室温进行。(1)定型方法：正、反定型的试管离心方法目前仍被认为是最可信赖的ABO定型方法。1)定型试剂：有些ABO血型诊断试剂是以人的血清汇聚而制成的，但必须具备以下条件：第一，高效价(1：128)的IgM抗A或抗B。第二，具较好
6、的亲和性并不含冷凝集素。第三，必需具有检测A2，A2B血型的能力。第四，血清必须通过HIV，HCV，HBV等检查或经病毒灭活。另外一些ABO定型试剂是由来自培养细胞株的单克隆抗体所制成。10二、受血者和供血者二、受血者和供血者ABOABO和和RhRh定型定型2)ABO亚型的鉴定：ABO亚型的鉴定通常使用下列试剂：抗A、抗B、抗A1、抗H、抗AIA1红细胞、A2红细胞、B型红细胞和O型红细胞。有些工作者在定型试验中，常规地选择应用抗AB抗血清，以避免错误地把弱反应性A或B型红细胞分类为O型。一般抗AB试剂对Ax型红细胞可增加凝集反应的强度。11二、受血者和供血者二、受血者和供血者ABOABO和和
7、RhRh定型定型(一)ABO定型试验中的常见问题：造成这种正反定型不一致的原因主要有：1)技术和管理错误：这是ABO定型中产生异常结果的主要原因，包括：标本或试剂搞错；器材不洁；试剂污染或失效；离心过度或不足；阳性反应产生溶血现象未能识别；漏加试剂；结果记录或判断错误；细胞与血清间比例不适当。2)血清异常：血清蛋白引起缗钱状形成，影响反定型结果。3)红细胞致敏：受免疫球蛋白致敏的红细胞，在含高蛋白介质的试剂中，可发生凝集。4)异常基因型：ABO亚型的检查中，A、B抗原可能为弱抗原，难以检出。12二、受血者和供血者二、受血者和供血者ABOABO和和RhRh定型定型5)近期输血：试验前曾输入过其它
8、ABO血型不一致的血液，使血液标本成为混合血型的红细胞悬液，定型时显示“混合外观凝集”现象。6)嵌合体血型：这种血型者体内有两类血型红细胞群体，定型时可以出现“混合外观凝集”现象。7)疾病因素导致抗原减弱：某些白血病患者和难治性贫血患者中，ABO血型系统的抗原性可受到抑制，检出困难。8)红细胞多凝集现象：红细胞因遗传或获得性的表面异常，发生多凝集现象。9)获得性B：由于革兰阴性杆菌的作用，红细胞可获得“类B”的活性。13二、受血者和供血者二、受血者和供血者ABOABO和和RhRh定型定型10)血型特异性物质过高：一些卵巢囊肿病例，血型物质的浓度很高，可中和抗A和抗B定型试剂，要得到正确的正定型
9、结果，必须洗涤红细胞多次。11)近期内进行大量的血浆置换治疗：由于使用大量的非同型的血浆作置换治疗，标本血清中含有所输供体提供的抗A或抗B抗体，造成反定型错误。12)异常的血浆蛋白：受检者血浆中异常的白蛋白、球蛋白比例和高浓度的纤维蛋白原等导致缗钱状形成，造成假凝集现象。13)不规则抗体的存在：受检者血浆中，含有ABO血型抗体以外的不规则抗体，与试剂红细胞上其他血型抗原系统的抗原起反应。14二、受血者和供血者二、受血者和供血者ABOABO和和RhRh定型定型 14)低丙种球蛋白血症：低丙种球蛋白血症(丙种球蛋白量减低)病例，可能会因免疫球蛋白水平下降而使血清定型时不凝集或弱凝集反应。15)药物
10、等因素：药物、右旋糖醉及静脉注射某些造影剂可引起红细胞凝集或类似凝集。16)年龄因素：免疫系统尚未健全的婴儿、由母亲被动获得抗体的婴儿，或抗体水平下降的老人，试验时可出现异常的结果。17)防腐剂因素：患者体内可能含有对防腐剂中的成分或对混悬介质的抗体，导致ABO定型差错。15二、受血者和供血者二、受血者和供血者ABOABO和和RhRh定型定型（二）Rh(D)定型和定型试验中应注意的问题：Rh定型主要鉴定D抗原（IgG抗D和IgM抗D）。Rh系统是最为复杂得多一个系统，涉及临床的主要有D、C、c、E、e五个抗原，其中D抗原的免疫原性最强，仅次于A或B抗原。Rh血型鉴定方法有：玻片法、试管法、微量
11、板法、微柱凝胶法等，试管法最为经典。目前大部分医院都使用微柱凝胶卡式血型鉴定，方法简便快捷，准确度较高。16二、受血者和供血者二、受血者和供血者ABOABO和和RhRh定型定型17二、受血者和供血者二、受血者和供血者ABOABO和和RhRh定型定型(1)导致Rh血型鉴定可能出现假阳性的原因：1)受检细胞已被免疫球蛋白致敏，或标本血清中含有引起红细胞凝集的因子。2)受检细胞与抗血清孵育的时间过长，含高蛋白的定型试剂会引起缗钱状形成。3)标本抗凝不当，受检过程中出现凝血或小的纤维蛋白凝块，误判为阳性。4)定型血清中含有事先未被检测的其它特异性抗体，造成假阳性定型结果。5)多凝集细胞造成定型的假阳性
12、。6)鉴定用器材或抗血清被污染，造成假阳性。18二、受血者和供血者二、受血者和供血者ABOABO和和RhRh定型定型(2)可能出现假阴性的原因 1)受检细胞悬液浓度太高，与抗血清比例失调。2)漏加或错加定型血清。3)定型血清的使用方法错误，没有按说明书进行。4)离心后重悬细胞扣时，摇动用力过度，摇散微弱的凝集。5)抗血清保存不当，导致失效。19二、受血者和供血者二、受血者和供血者ABOABO和和RhRh定型定型(三)弱D型(Du型)血型及其鉴定：Du型抗原是RhO(D)的弱抗原，这种抗原通常与大部分盐水抗D试剂不产生直接凝集反应，而与部分的IgG抗D血型用间接抗球蛋白试验反应阳性。因此当我们初
13、次得到Rh阴性结果时，必须进行作Rh阴性确认试验，即用三种不同批号的IgG抗D定型，如果全部阴性方可认为该被检者为Rh阴性，否则，只要有一批为阳性，则可认为是Du型。若D人群作为献血者按照RhD阳性对待，其血液只能给Rh阳性受血者输注；作为受血者按照RhD阴性对待，只能接受RhD阴性血液。20三、不规则抗体筛选和鉴定三、不规则抗体筛选和鉴定一、概念：不规则抗体是指血清中抗-A、抗-B以外的其他血型抗体，也称意外抗体。不规则抗体包括同种抗体和自身抗体。自身抗体：受血者体内产生的抗体，针对自己本身的红细 胞抗原。同种抗体：不只针对自身抗原，也会同种异型抗原发生反 应。21三、不规则抗体筛选和鉴定三
14、、不规则抗体筛选和鉴定二、不规则抗体的筛查方法二、不规则抗体的筛查方法 抗体筛选试验的原则是让受检的血清与已知血型的试剂红 细胞即筛选红细胞起反应，以发现在37中有反应的抗体1.盐水介质法：主要用于IgM类抗体的筛查。优点是：方法简单、操作简单、成本低廉。缺点是：灵敏度低2.聚凝胺法 优点：与水盐介质法比灵敏度有所提高。3.抗球蛋白试验：缺点：操作繁琐、工作量大、耗时等。4.酶法：能暴露隐蔽抗原，增强一些稀有抗原检测。但可能 会破坏有些抗原，影响检测。目前临床是已不用。22三、不规则抗体筛选和鉴定三、不规则抗体筛选和鉴定5.微柱凝胶卡式检测法三、不规则抗体的鉴定三、不规则抗体的鉴定 抗体筛选试
15、验用的试剂筛选红细胞，通常是2或3个人份的O型红细胞成为一套试剂，每套试剂筛选红细胞中至少有以下常见的抗原：D、C、E、c、e、M、N，条件不足的实验室不一定具备Lua、V、Cw、Kpa、Jsa 类的抗原。一旦抗体被检出，应作抗体鉴定试验，以确定其特异性。抗体鉴定实验包含以下主要内容：(1)自身细胞检查：观察患者(受者)的血清与患者(受者)自身细胞的反应情况，确定血清内是否有自身抗体或自身抗体和同种抗体二者同时存在。(2)普红细胞：使用试剂细胞中的谱细胞，应用各种抗体检查技术，检测患者的血清，确定其抗体的特异性。23三、不规则抗体筛选和鉴定三、不规则抗体筛选和鉴定抗体鉴定试验结果的解释及处理：
16、1.与谱细胞反应明显，确定为单一抗体或无法确定为单一抗体，应加以鉴别。2.与谱细胞呈弱反应，结果不明确（1）分析结果：是否符合剂量效应 谱细胞是否新鲜（2）改变试验方法：使用高灵敏度的方法重复试验 添加试剂后重复实验 带抗体增强后重复试验 24三、不规则抗体筛选和鉴定三、不规则抗体筛选和鉴定3.与所有谱细胞反应，自身细胞阴性（1）强度不一致：可能存在混合抗体（2）强度一致：抗体可能为专于O细胞反应的抗体 （如：抗-I、抗-H、抗-HI）可能针对高频抗原的抗体 可能针对谱细胞的抗体4.与所有谱细胞反应，自身细胞阳性（1）存在自身抗体（2）同种和自身抗体同时存在（3）冷凝集：在冷凝集素的作用下存在
17、凝集红细胞25三、不规则抗体筛选和鉴定三、不规则抗体筛选和鉴定（4）假凝剂：在干扰因子的作用下一可造成红细胞假凝集（5）酶引起的多凝集（6）补体的影响6.与谱细胞不反应，自身细胞阳性 可能是自身抗体或C 阳性26三、不规则抗体筛选和鉴定三、不规则抗体筛选和鉴定四、抗体筛查和鉴定的影响因素四、抗体筛查和鉴定的影响因素1.抗体筛查和鉴定细胞的质量 筛查细胞不包括低频率抗原，不能检出低频率抗原。谱细胞：用于抗体鉴定的试剂红细胞。在选择不规则抗体筛查或鉴定细胞时，应符合本地 区不规则抗体分布的特点。2.试验方法法 IgM抗体在4，凝集强度明显大于室温，37会有减弱3.抗体的特异性 抗体筛查试验为阴性，
18、并不意味着被检血清中一定没有抗体筛查细胞漏检ABO亚型抗体（如抗-A）27三、不规则抗体筛选和鉴定三、不规则抗体筛选和鉴定五五 不规则抗体鉴定时遇见的的问题不规则抗体鉴定时遇见的的问题1.不规则抗体筛查阴性，输血后发现溶血（1）交叉配血假阴性（2）抗球蛋白试验不规则抗体筛查假阴性 试剂保存不当 洗涤不充分 实验操作 红细胞浓度过高造成凝集减弱或红 细胞浓度过低造成凝集不易被观察到2.不规则抗体筛查阳性，抗体特异性难以鉴定（1）抗体筛查假阳性：离心不当试管污染 硅胶管引起的凝集（2）谱细胞单一：应采用3个以上不同供应商的谱细胞系，排查抗体的特异性。28四、交叉配血试验四、交叉配血试验 （一）要求
19、和内容（一）要求和内容 交叉配血的要求：交叉配血的要求：29四、交叉配血试验四、交叉配血试验 交叉配血试验的内容交叉配血试验的内容30四、交叉配血试验四、交叉配血试验 交叉配血的目的交叉配血的目的31四、交叉配血试验四、交叉配血试验（二）结果的解释及处理1.抗体筛查阴性，交叉配血相容：绝大部分标本抗体筛查阴性，交叉配血也是相容的。2.抗体筛查阴性，主侧交叉配合试验阳性（1）复查血型（2）主侧凝集类B抗原（3）血清中可能含有一种ABO抗体，必要时可以做ABO亚型鉴定32四、交叉配血试验四、交叉配血试验3.抗体筛查试验阳性，主侧交叉配合试验阳性（1）自身对照试验阴性：受血者体内有同种不规则抗体。（
20、2）自身对照试验阳性：受血者血清内可能有自身抗体或 同时存在不规则抗体。（三）影响因素 离子干扰 温度 操作不规范 离心不当 33第二节第二节 盐水介质实验技术盐水介质实验技术 盐水介质试验技术常用于血型鉴定、血清中IgM类抗体的筛查和鉴定、盐水介质的交叉配血等。基本方法基本方法1.平板法 用于ABO血型和RhD抗原的定型 特点：简单、快速，但易污染环境。2.试管法 为定型试验方法，也可于半定量试验。是输血 前检验最常用的试验方法。特点：简单、快速、易学，结果准确、可靠。3.微孔板法 为定性试验方法。34第二节第二节 盐水介质实验技术盐水介质实验技术 盐水介质配血方法盐水介质配血方法患患者者献
21、献血血者者主主侧侧次次侧侧35第二节第二节 盐水介质实验技术盐水介质实验技术36第三节第三节 酶处理实验技术酶处理实验技术 原理：在酶的作用下切断带有负电荷的羧基基团的唾液酸，降低Zeta电位，缩短红细胞之间的距离。增强IgG抗体对红细胞的凝集。常用对的酶：菠萝酶，无花果酶，木瓜酶37第三节第三节 酶处理实验技术酶处理实验技术 酶介质配血方法酶介质配血方法38第三节第三节 酶处理实验技术酶处理实验技术39第三节第三节 酶处理实验技术酶处理实验技术结果的判断结果的判断（1）阳性对照管凝集，阴性对照管凝集，被检管凝集为阳 性，不出现凝集判定为阴性。（2）阳性对照管不凝集和（或）阴性对照管凝集，实验
22、失 败分析原因，重新实验。40第四节抗球蛋白实验技术第四节抗球蛋白实验技术一、基本原理一、基本原理 抗球蛋白试验（Coombs实验）主要用于检测血清中的不完全抗体如：IgG、IgA和（或）补体如：C3、C4。在盐水介质中，不完全抗体只能致敏红细胞，而不能使红细胞出现可见的凝集反应，加入抗球蛋白试剂后，抗球蛋白分子的Fab片段与红细胞表面的受体结合，而产生红细胞凝集，因此采用此方法可以检测出血清中是否存在不完全抗体。41第四节抗球蛋白实验技术第四节抗球蛋白实验技术抗球蛋白试验原理图抗球蛋白试验原理图42第四节抗球蛋白实验技术第四节抗球蛋白实验技术 二、分类及应用二、分类及应用 抗球蛋白试验抗球蛋
23、白试验直接直接间接间接致敏红细胞的不完全抗体、补体致敏红细胞的不完全抗体、补体血清中的不完全抗体血清中的不完全抗体应用应用HDN的诊断、的诊断、AIHADE的诊断、药物诱发型溶血病的诊断的诊断、药物诱发型溶血病的诊断交叉配血及血型鉴定、器官移植、等交叉配血及血型鉴定、器官移植、等43第四节抗球蛋白实验技术第四节抗球蛋白实验技术 抗球蛋白配血方法抗球蛋白配血方法44第四节抗球蛋白实验技术第四节抗球蛋白实验技术 抗球蛋白方法配血方法抗球蛋白方法配血方法45第四节抗球蛋白实验技术第四节抗球蛋白实验技术 三、结果的判断结果的判断直接抗球蛋白试验：直接抗球蛋白试验：（1）阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集
24、，被检管凝集，）阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集，被检管凝集，判定为阳性。判定为阳性。（2）阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集，被检管不凝）阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集，被检管不凝 集，须做阴性确认后判定结果。集，须做阴性确认后判定结果。（3）阳性对照管不凝集和（或）阴性对照管凝集，结果不）阳性对照管不凝集和（或）阴性对照管凝集，结果不 可信不能发出报告，分析原因后重做试验。可信不能发出报告，分析原因后重做试验。46第四节抗球蛋白实验技术第四节抗球蛋白实验技术间接抗球蛋白试验：间接抗球蛋白试验：（1）阳性对照管呈现凝集反应，阴性对）阳性对照管呈现凝集反应，阴性对照管不呈现凝集反应，被检管呈现
25、凝集照管不呈现凝集反应，被检管呈现凝集反应为阳性结果，表示被检者血反应为阳性结果，表示被检者血 清中含有抗体。清中含有抗体。（2）阳性对照管不凝集和（或）阴性对）阳性对照管不凝集和（或）阴性对照管出现凝集，实验失败，分析原因重照管出现凝集，实验失败，分析原因重做试验。做试验。47第四节抗球蛋白实验技术第四节抗球蛋白实验技术 四、注意事项注意事项（一）直接抗球蛋白试验1.抗球蛋白血清应按说明书使用最适稀释度，避免出现前带现象而误判为阴性。2.结果判读时应转动拖拉，细胞扣摇散后，如肉眼未见凝集，应将反应物涂于玻片上，在在显微镜下观察确认阴性。3.被检标本需用EDTA抗凝，避免出现假阳性；标本不宜久
26、置，防止红细胞上已致敏的抗体游离到血浆中，造成假阴性或阳性程度降低。4.红细胞表面存在蛋白质就会与抗球蛋白结合。因此受检红细胞一定要充分洗涤，除去血清蛋白，避免假阴性的产生。5.如需进一步分析体内致敏红细胞的免疫球蛋白的类型，可以分别以抗IgG、抗C3单价抗球蛋白血清进行试验。48第四节抗球蛋白实验技术第四节抗球蛋白实验技术（二）间接抗球蛋白试验1.红细胞洗涤过程中不宜中途停止，每次加生理盐水前要是红细胞完全悬浮；洗涤过程中防止交叉污染；应充分洗涤，避免残留抗体部分中和抗球蛋白试剂而产生假阴性。2.振摇试管不宜用力过大，避免将松散红细胞凝块摇散，使强阳性结果误判为弱阳性结果，弱阳性结果误判为阴
27、性，对于弱阳性结果观察细胞扣是否出现缺口来判读。3.离心后应立即看结果，不宜久置。4.致敏时间：30-60分钟，不超过90分钟 49第四节抗球蛋白实验技术第四节抗球蛋白实验技术 三、抗球蛋白实验的影响因素三、抗球蛋白实验的影响因素一、亲和力一、亲和力 亲和力常数越高，抗原抗体反应致敏阶段的抗体水平越高亲和力常数越高，抗原抗体反应致敏阶段的抗体水平越高二、孵育时间和温度二、孵育时间和温度 37孵育孵育30-60分钟分钟三、离子强度三、离子强度 在单纯的离子强度溶液中，可增强抗体的结合作用，孵育在单纯的离子强度溶液中，可增强抗体的结合作用，孵育 时间将缩短到时间将缩短到1530分钟分钟四、抗原、抗
28、体的比例四、抗原、抗体的比例 2滴血清对滴血清对1滴滴25的红细胞悬液的红细胞悬液五、洗涤五、洗涤 应尽量去除上清液，降低未结合的免球蛋白。应尽量去除上清液，降低未结合的免球蛋白。六、体外补体致敏六、体外补体致敏七、红细胞自身凝集七、红细胞自身凝集50第五节第五节 聚凝胺介质实验技术聚凝胺介质实验技术 聚凝胺实验技术是一种快速、简便检测红细胞不完全抗体的方法，可用来检测IgG抗体，但IgG抗体的抗-K抗体除外。一、实验原理 凝聚胺（凝聚胺（polymatchingpolymatching）法首先利用低离子介质降低溶液）法首先利用低离子介质降低溶液的离子强度，减少红细胞周围的阳离子云，促进血清（
29、浆）的离子强度，减少红细胞周围的阳离子云，促进血清（浆）中的抗体与红细胞相应抗原结合，再加入带亚电荷的高价中的抗体与红细胞相应抗原结合，再加入带亚电荷的高价阳离子多聚物阳离子多聚物-凝聚胺溶液，中和红细胞表面的负电荷，凝聚胺溶液，中和红细胞表面的负电荷，缩短细胞间距，形成可逆的非特异性聚集，并使缩短细胞间距，形成可逆的非特异性聚集，并使IgGIgG型抗型抗体直接凝集红细胞。加入中和液后，仅由凝聚胺引起的非体直接凝集红细胞。加入中和液后，仅由凝聚胺引起的非特异性聚集，会因电荷中和而分散，而由抗体介导的特异特异性聚集，会因电荷中和而分散，而由抗体介导的特异性凝集则不会分散性凝集则不会分散51第五节
30、第五节 聚凝胺介质实验技术聚凝胺介质实验技术 聚凝胺聚凝胺(PolybrenePolybrene)配血方法配血方法52第五节第五节 聚凝胺介质实验技术聚凝胺介质实验技术 聚凝胺聚凝胺(PolybrenePolybrene)配血方法配血方法53第五节第五节 聚凝胺介质实验技术聚凝胺介质实验技术二、应用范围 血型鉴定、抗体筛查及交叉配血试验三、特点 灵敏、速度快、准确、操作要求高。四、注意事项1.不能用含有枸橼酸钠和肝素抗凝标本2.用聚凝胺试验技术交叉配血，出现不配合时，要用抗球蛋白试验重做，结果不一致时，以抗球蛋白试验为主。3.聚凝胺只能是正常红细胞发生凝集，对缺乏唾液酸的细胞 （如：T细胞及B
31、细胞）无作用。54第六节第六节 微柱凝集试验技术微柱凝集试验技术一、实验原理 凝胶具有分子筛效应和亲和效应，在微柱凝凝胶具有分子筛效应和亲和效应，在微柱凝胶介质中红细胞抗原与相应的抗体结合，利用凝胶介质中红细胞抗原与相应的抗体结合，利用凝胶的空间位阻经低速离心，凝集的红细胞悬浮在胶的空间位阻经低速离心，凝集的红细胞悬浮在凝胶的上层，而未和抗体结合的红细胞则沉于凝凝胶的上层，而未和抗体结合的红细胞则沉于凝胶的底部（管底尖部）。胶的底部（管底尖部）。55第六节第六节 微柱凝集试验技术微柱凝集试验技术一、微柱凝胶试验原理一、微柱凝胶试验原理 操作及结果的判定操作及结果的判定56第六节第六节 微柱凝集
32、试验技术微柱凝集试验技术二、应用1.抗球蛋白试验 直接抗球蛋白试验和 间接抗球蛋白试验。2.ABO血型鉴定 可做单纯正定型，也可同时做正反定型。3.其他血型系统检测 如Rh其他抗原（CcEe）定型三、特征及优点 1.简便 2.准确 结果清晰明确，可重复性强。3.敏感 4.结果保存时间长 5.标本用量少 6.标准化 7.安全57第六节第六节 微柱凝集试验技术微柱凝集试验技术四、微柱凝集试验中可能存在的问题四、微柱凝集试验中可能存在的问题1.抗凝剂不足或不含抗凝剂的血浆标本常出现假阳性。2.实验室温度较低时，易出现假阳性结果。3.抗原、抗体过少、过弱；抗原、抗体比例不当时易出现假阴性。4.离心力过
33、大时，容易使弱阳性成为阴性格局。5.溶血反应：反应液是低渗溶液 温度过冷或过热 红细胞或抗体被污染 其他可使红细胞破坏的理化因素58第六节第六节 微柱凝集试验技术微柱凝集试验技术五、局限性与发展前景 微柱凝集抗人球蛋白试验及微柱胶免疫检测技术的本质是血凝试验，这理论上位制备抗原抗体包被的红细胞为指示红细胞，以间接血凝试验来检测红细胞抗原抗体以外的其他血液红细胞、中路标志、病原微生物，以及人体中其他可溶性抗体，如对药物抗体、自身抗体的检测等提供了比传统血凝检验更为敏感、准确、简单易行的方法。微柱凝集试验技术奖在临床各个领域有更为广阔的发展。59第七节第七节 吸收放射试验吸收放射试验一、概念1.吸
34、收试验:抗原与抗体的结合是特异性的，因此具有抗体活性的血清加入相应抗原后，抗体的活性下降或消失，这种作用称为吸收试验。2.放散试验是抗原与抗体的结合是可逆的，在物理条件改变时，抗体又会从抗原抗体复合物上分离下来，将抗体由抗原抗体复合物上分离下来的试验称为放散试验60第七节第七节 吸收放射试验吸收放射试验（一）相关的概念（一）相关的概念 抗体可与相应的抗原在适当条件下可发生凝集或致敏，这种结合抗体可与相应的抗原在适当条件下可发生凝集或致敏，这种结合是可逆的，如改变某些实验条件，抗体可从红细胞解离下来，然后检是可逆的，如改变某些实验条件，抗体可从红细胞解离下来，然后检测解离下来的抗体。这种实验称为
35、吸收放散实验。测解离下来的抗体。这种实验称为吸收放散实验。冷自身抗体冷自身抗体：理论上讲凡是37与自身红细胞不反应，而只有在低于37环境下才能和自身红细胞反应的抗体均可称为冷自身抗体。实际上，冷自身抗体大多数只能在很低的温度下(例如4)与自身细胞反应。温自身抗体温自身抗体：温自身抗体是指在37条件下能和自身红细胞反应的抗体。当患者血清中含有温自身抗体时，患者一般均有些贫血或溶血症状。温自身抗体可分为两类:大多数情况下为lgG类温自身抗体，极少数情况下也会存在IgM性质的温自身抗体。61第七节第七节 吸收放射试验吸收放射试验（二）吸收实验 冷抗体在4反应最强，通常用冷吸收技术（自身抗体用自身红细
36、胞吸收；同种抗体用对应红细胞吸收）。IgM抗体通常在4条件下比22或37更容易吸收，且容易完全吸收。IgG抗体通常在37 的吸收效果最好，但难以完全吸收。1.冷抗体吸收实验 应用范围：自身冷抗体的吸收其他冷抗体的吸收2.温抗体吸收实验 应用范围：自身冷抗体的吸收其他冷抗体的吸收62第七节第七节 吸收放射试验吸收放射试验（三）放散实验 放散实验是把结合到红细胞膜上的抗体解离下来，用于其他目的。通过放散实验得到的含有或不含有抗体的溶液称为放散液。放散的目的：得到红细胞上致敏的抗体或没有抗体吸附的得到红细胞上致敏的抗体或没有抗体吸附的红细胞，前者得到的是自身抗体，用于自身吸收；后者得红细胞，前者得到
37、的是自身抗体，用于自身吸收；后者得到的是红细胞，用于血型鉴定和交叉配血到的是红细胞，用于血型鉴定和交叉配血。放散的方法：热放散技术、乙醚放散技术、磷酸氯喹放散热放散技术、乙醚放散技术、磷酸氯喹放散技术、冻融放散技术、柠檬酸放散技术、二甲苯放散技术技术、冻融放散技术、柠檬酸放散技术、二甲苯放散技术等。等。63第七节第七节 吸收放射试验吸收放射试验1.热放散技术应用范围 ABO抗体的放散（新生儿溶血病实验）注意事项 温度过高，抗体可能变性；温度过低，容易使 抗体从红细胞上解离不完全2.乙醚放散技术乙醚为有机溶剂，可以破坏红细胞膜，解离IgG抗体，该方法制备的放散液，抗体回收率高。适用范围 主要用于
38、红细胞上的各种IgG抗体的扩散。3.磷酸氯喹放散技术主要用于得到没有任何抗体附着的红细胞。此方法不能将补体从红细 胞膜上解离下来。64第七节第七节 吸收放射试验吸收放射试验4.冻融放散技术适用范围 ABO抗体的放散，如新生儿溶血病的相关检测实验。5.柠檬酸放散技术适用范围 用于解离红细胞膜上致敏的IgG抗体对红细胞进行抗原 的鉴定，但Kell系统的鉴定除外。注意事项 该方法可破坏Kell系统抗原，特别是K抗原，因此本方法 放散后的细胞不能进行Kll系统定型试验。65第七节第七节 吸收放射试验吸收放射试验（四）吸收放散试验的应用 证实存在于红细胞上的若抗原证实存在于红细胞上的若抗原分离、鉴定混合
39、液体分离、鉴定混合液体除去血清中不需要的抗体除去血清中不需要的抗体浓缩低效价抗体浓缩低效价抗体核实抗体特异性核实抗体特异性利用吸收放散技术鉴定引起新生溶血病和免疫性输血反应利用吸收放散技术鉴定引起新生溶血病和免疫性输血反应的抗体的抗体研究鉴别免疫性溶血性贫血的抗体研究鉴别免疫性溶血性贫血的抗体66第八节第八节 凝集抑制试验凝集抑制试验 一、概述：抗体能与有相应抗原的红细胞发生特异性凝抗体能与有相应抗原的红细胞发生特异性凝集，体液中的可溶性抗原物质能与该抗体发生特集，体液中的可溶性抗原物质能与该抗体发生特异的中和，抑制了抗体凝集红细胞的作用。用这异的中和，抑制了抗体凝集红细胞的作用。用这种可溶性
40、物质来抑制抗体与红细胞凝集的试验，种可溶性物质来抑制抗体与红细胞凝集的试验，称为凝集抑制试验。常用于称为凝集抑制试验。常用于ABHABH或或LewisLewis分泌状态分泌状态的检查，帮助的检查，帮助ABOABO亚型的确认以及特殊情况下（红亚型的确认以及特殊情况下（红细胞标本完全溶血）细胞标本完全溶血）ABOABO血型的鉴定。血型的鉴定。67第八节第八节 凝集抑制试验凝集抑制试验二、抑制物处理及抗体标化收集液体收集液体 唾液标本作为抑制物，煮沸使酶失活。唾液标本作为抑制物，煮沸使酶失活。标化人源抗血清标化人源抗血清 抗体需通过倍比稀释，找出可也凝集红细胞至抗体需通过倍比稀释，找出可也凝集红细胞
41、至“”的最高稀释度，并按照该稀释度进行稀释。的最高稀释度，并按照该稀释度进行稀释。68第八节第八节 凝集抑制试验凝集抑制试验三、唾液中可溶性ABH血型物质的检测（一）结果分析 阴性对照管的凝集强度一般为阴性对照管的凝集强度一般为，阳性阳性 对照管的凝集强度应为对照管的凝集强度应为，盐水对照管凝集强度硬度，盐水对照管凝集强度硬度 与相应的唾液测定管。与相应的唾液测定管。在在3 3排试管中任何一管红细胞不凝集，均表明检测出唾排试管中任何一管红细胞不凝集，均表明检测出唾 液中存在相应的血型物质。液中存在相应的血型物质。稀释后的效价管可导致红细胞凝集，最高稀释倍数的倒稀释后的效价管可导致红细胞凝集，最
42、高稀释倍数的倒 数即为唾液中血型物质的效价。数即为唾液中血型物质的效价。69第八节第八节 凝集抑制试验凝集抑制试验四、血型物质的应用（一）IgM抗体的中和适用范围 尝试用于IgG抗-A和（或）抗-B效价的测定 ABO血型抗体的辅助鉴定（二）特异性抗体的确定适用范围 用已知的血型物质来检测未知抗体的特异性70第九节第九节 红细胞血型分子生物学检测红细胞血型分子生物学检测 一、红细胞血型分子生物学检测技术红细胞血型分子生物学检测技术 随着分子生物学技术的发展，检测基因结构和突变的方法不断涌新。尤其是PCR技术问世后，各种与PCR相结合的检测技术进一步推动了基因研究的发展。分子生物学技术应用与红细胞
43、血型的检测，使红细胞血型分析的技术飞越了一个崭新的阶段。红细胞血型分子生物学检测的的方法有红细胞血型分子生物学检测的的方法有：PCR-SSP技术、PCR-SSOP技术、PCR-RFLP技术、PCR-RDB技术、PCR-DNA测序、基因芯片、PCR指纹图等。71第九节第九节 红细胞血型分子生物学检测红细胞血型分子生物学检测 PCR-SSP即序列特异性引物引导的PCR反应 PCR-SSOP即序列特异性寡核苷酸探针 PCR-SSCP即单链构象多态性 PCR-RFLP即限制性片段长度多态性 PCR-RBD即反向点杂交 PCR-DNA测序液相芯片法 又称悬浮点阵技术、xMAP（即灵活的多元分析平台）、多
44、元流式荧光微球检测技术。72第九节第九节 红细胞血型分子生物学检测红细胞血型分子生物学检测二、应用二、应用 ABO疑难血型的鉴定 发现ABO血型新等位基因 对于ABO基因突变的研究 新生儿溶血病（HDN）的辅助诊断 某些疾病的病理研究 法医个体识别73第九节第九节 红细胞血型分子生物学检测红细胞血型分子生物学检测 分子生物学检测血型技术的应用，使血型分分子生物学检测血型技术的应用，使血型分析达到了更精细的水平，并因此发现了更多的血析达到了更精细的水平，并因此发现了更多的血型的多的血型的多态性。分子生物学检测血型技型的多的血型的多态性。分子生物学检测血型技术与传统的血清学技术比较，优点是试剂由化学术与传统的血清学技术比较，优点是试剂由化学合成，易于获得和标准化，取材容易，无需新鲜合成，易于获得和标准化，取材容易，无需新鲜血样而仅需微量样品等，现已成为血清学方法的血样而仅需微量样品等，现已成为血清学方法的获得者和竞争者。获得者和竞争者。对小量含对小量含DNADNA的任何组织样品，用分子生物的任何组织样品，用分子生物学分型技术对红细胞抗原学分型技术对红细胞抗原denden基因型做鉴定，不受基因型做鉴定，不受血清中自身抗体、不规则抗体以及疾病和假、弱血清中自身抗体、不规则抗体以及疾病和假、弱凝集的影响，对保证安全输血有着重要意义。凝集的影响，对保证安全输血有着重要意义。74
