1、凯氏定氮法凯氏定氮法测定食品中蛋白质测定食品中蛋白质一、概述一、概述 蛋白质是以氨基酸为最小构成单元的大分子蛋白质是以氨基酸为最小构成单元的大分子的含氮化合物，它是由的含氮化合物，它是由20种氨基酸通过种氨基酸通过酰氨键酰氨键以一定方式结合，并具有一定的空间结构。以一定方式结合，并具有一定的空间结构。生命的物质基生命的物质基础础遗传信息的表遗传信息的表达方式达方式人及动物需要从人及动物需要从食品得到蛋白质食品得到蛋白质及其分解产物，及其分解产物，来构成自身的蛋来构成自身的蛋白质白质维持酸碱平衡、维持酸碱平衡、水平衡水平衡维持物质的代维持物质的代谢及运转谢及运转营养指标、营养指标、食品生产工艺食
2、品生产工艺指标。指标。生理功能及在食品中的作用生理功能及在食品中的作用常见食物中蛋白质的含量常见食物中蛋白质的含量牛肉牛肉螺旋藻螺旋藻常见食物氮系数常见食物氮系数氮系数：蛋白质含氮量的倒数，常用氮系数：蛋白质含氮量的倒数，常用6.25表示。表示。蛋白质测定方法蛋白质测定方法二、凯氏定氮法测定蛋白质（二、凯氏定氮法测定蛋白质（粗蛋白粗蛋白）l 凯氏定氮法凯氏定氮法是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量的蛋白质系数而求出蛋白质的含量。1.1.原理原理样品与浓硫酸和催样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其使
3、蛋白质分解，其中中碳和氢被氧化为碳和氢被氧化为二氧化碳和水二氧化碳和水逸逸出出样品中的样品中的有机氮有机氮转化为氨转化为氨与硫酸与硫酸结合成硫酸铵结合成硫酸铵加碱蒸馏，使氨加碱蒸馏，使氨蒸出，用蒸出，用硼酸吸硼酸吸收收后再以标准后再以标准盐盐酸溶液滴定酸溶液滴定消化消化蒸馏蒸馏吸收、滴定吸收、滴定计算计算2.2.实验步骤实验步骤第一步：样品第一步：样品消化消化 样品与浓硫酸加热消化，硫酸使有机物脱水样品与浓硫酸加热消化，硫酸使有机物脱水并破坏有机物，并破坏有机物，C、H氧化为二氧化碳、水逸出，蛋氧化为二氧化碳、水逸出，蛋白质分解为氨、与硫酸结合生成硫酸铵、留在溶液白质分解为氨、与硫酸结合生成硫
4、酸铵、留在溶液中中 对原子的前处理，使被测物质进入对原子的前处理，使被测物质进入溶液中，使不溶变为可溶、有机物分解溶液中，使不溶变为可溶、有机物分解为可溶性无机物为可溶性无机物消化消化（1 1）消化）消化总反应式：总反应式：2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O一定要用浓硫酸（一定要用浓硫酸（98%）消化装置消化装置“自动回流消化仪自动回流消化仪”定氮消化的不同状态RCHRCH2(NH2)COOH+H2SO4CO2+H2O+SO2+(NH4）2SO4澄清澄清消泡消泡碳化碳化消化过程中试剂作用消化过程中试剂作用l硫酸钾硫酸钾：提高溶液沸
5、点、加快反应进程；：提高溶液沸点、加快反应进程；l硫酸铜（蓝绿色）硫酸铜（蓝绿色）：催化作用：催化作用442422KHSOSOHSOK22442422242422424022222SOHCuSOSOHSOCuCOSOSOCuCuSOCOSOSOCuCuSO(NH(NH4)2SO4+2NaOHNH3+Na2SO4+2H2O第二步第二步蒸馏蒸馏01氢氧化钠需过量、若不够，会生成H2S,H2S是强酸，会使溶液颜色变红02防止样液中氨气逸出。注意事项：(3(3）吸收与滴定）吸收与滴定 吸收：加热蒸馏所放出的氨，吸收：加热蒸馏所放出的氨，硼酸硼酸溶液溶液 滴定：盐酸标准溶液，滴定：盐酸标准溶液，硼酸呈微
6、弱酸性（硼酸呈微弱酸性（KaKa1 1=5.8=5.81010-10-10），用酸滴定不影响），用酸滴定不影响指示剂的变色反应，它有吸收氨的作用指示剂的变色反应，它有吸收氨的作用 硫酸、盐酸溶液也可用作吸收剂硫酸、盐酸溶液也可用作吸收剂。33427424274243334225)(5)(42BOHClNHHClOHOBNHOHOBNHBOHNH各步骤操作细节图解：各步骤操作细节图解：样品消化样品消化蒸馏蒸馏滴定滴定（1）样品消化）样品消化样品+0.4g硫酸铜+6g硫酸钾+20ml浓硫酸+玻珠数粒先小火炭化，无泡沫后，加大火力，液体变蓝绿透明，继续加热微沸30分钟45度角消化终点瓶口不能对着人盖
7、上小漏斗（2 2）蒸馏）蒸馏将消化液全部转移到100ml容量瓶中加10ml硼酸溶液和混合指示剂23d加入NaOH溶液后颜色为深蓝色或褐色通入蒸汽开始蒸馏冷凝管下口浸入硼酸溶液中取10ml消化稀释液沿小玻璃杯移入反应室，少量蒸馏水冲洗，塞紧棒状玻璃塞，向小玻璃杯内加入10ml40%NaOH,提起玻璃塞，使NaOH缓慢流入反应室，立即塞紧玻璃塞，并在小玻璃杯中加水使之密封。吸收液变蓝色后继续蒸馏5分钟，将冷凝管尖端提离液面再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管尖端，取下接收瓶，关闭电源（3 3）滴定）滴定 取下接收瓶，用取下接收瓶，用0.1000mol/L0.1000mol/L的盐酸或硫酸的盐酸或硫酸
8、标准溶液滴定至终点。标准溶液滴定至终点。滴定前滴定终点同时做一试剂空白实验，记录空白滴定消耗盐酸的体积。同时做一试剂空白实验，记录空白滴定消耗盐酸的体积。实验注意事项实验注意事项消化消化（1）不时转动凯氏烧瓶、）不时转动凯氏烧瓶、缓和沸腾消化缓和沸腾消化（2）消化至呈透明后，继续消化）消化至呈透明后，继续消化30分钟，一般消化分钟，一般消化时间约时间约4小时小时（3）可加如少量辛醇、硅油做消泡剂）可加如少量辛醇、硅油做消泡剂（4）样品不易澄清时可冷却后加入）样品不易澄清时可冷却后加入30%过氧化氢过氧化氢2-3ml小结小结自动凯氏定氮仪法自动凯氏定氮仪法 在凯氏定氮法的基础上发展起来的自动凯氏
9、在凯氏定氮法的基础上发展起来的自动凯氏定氮仪法，具有安全、高效、准确的优点。定氮仪法，具有安全、高效、准确的优点。仪器：仪器：消化炉自动蒸馏装置1 1、原理及适用范围原理及适用范围 2 2、特点：特点：（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热红外线加热的消化炉。的消化炉。（2）快速：一次可同时消化）快速：一次可同时消化8个样品，个样品，30分钟分钟可消化完毕。可消化完毕。（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12分钟
10、完成分钟完成1个样。个样。双缩脲法（分光光度法）双缩脲法（分光光度法）1.1.原理原理双缩脲反应双缩脲反应 碱性条件下、碱性条件下、双缩脲双缩脲与硫酸铜作用生成紫红色配与硫酸铜作用生成紫红色配合物的反应。合物的反应。肽键（肽键（-CO-NH-）与双缩脲结构相似、能呈现此）与双缩脲结构相似、能呈现此反应反应。560nm处、由颜色深浅判定蛋白质含量多少。处、由颜色深浅判定蛋白质含量多少。KOHKOH、CuSO4、酒石酸钾钠配酒石酸钾钠配置置标准曲线标准曲线l标准曲线（标准曲线（standard curve）是指通过测定一系）是指通过测定一系列已知组分的标准物质的某理化性质，而得到的列已知组分的标准
11、物质的某理化性质，而得到的性质的数值曲线性质的数值曲线。2.2.标准曲线绘制标准曲线绘制（1）配置）配置一定浓度一定浓度（10mg/ml）的蛋白质标准溶液；）的蛋白质标准溶液；（2）分别量取）分别量取4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml蛋白质标准液于蛋白质标准液于7支支50ml比色管中；比色管中；（3）向上述）向上述7支试管中分别加入支试管中分别加入1ml四氯化碳后、用四氯化碳后、用碱性酒石酸铜溶液稀释至碱性酒石酸铜溶液稀释至50ml，振摇、静止，振摇、静止1h；（4）取上清液在）取上清液在2000r/min离心离心5min、560nm测定测定吸光度，绘制标准曲线。吸光度，绘制标准曲线。最终测定最终测定溶液中不能有溶液中不能有沉淀沉淀3.3.样品测定样品测定样品含量需在样品含量需在40-100mg内。内。4.4.结果计算（结果计算（mg/100gmg/100g）1100mmX燃烧法燃烧法
