1、考点75 蛋白质的提取与分离 1蛋白质提取与分离的依据分子的形状、大小；电荷性质和多少；溶解度；吸附性质；对其他分子亲和力。2凝胶色谱法（1）材料：凝胶多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。 （2）步骤：混合物上柱洗脱大分子流动快、小分子流动慢收集大分子收集小分子原理：当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。3缓冲溶液（1）概念：在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生
2、明显变化的溶液。（2）作用：能够抵制外界的酸或碱的对溶液的pH的影响，维持pH基本不变。（3）配制：通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。由弱酸和相应的强碱弱酸盐溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等。（4）本实验使用的是磷酸缓冲液(NaH2PO4/Na2HPO4)，目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和科学研究（活性）。4电泳法（1）概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。（2）原理：分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使
3、带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。（3）类型：琼脂糖凝胶电泳法：由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子在电场中迁移速度决定于所带电荷性质的差异及分子的大小、形状的不同。聚丙烯酰胺凝胶电泳法：在凝胶中加入SDS，使蛋白质解聚成单链，与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，使其迁移速度完全取决于分子的大小。5实验操作实验操作的基本步骤：样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。（一）样品处理（1）红细胞的洗涤：目的：去除杂蛋白。为防止血液凝固，应先加入柠檬酸钠。所用洗涤液：是五倍体积的生理盐水（质量分数为0.9%的NaCl溶液）。缓慢搅拌，采用低速短时间离心。洗涤干净的标准是上清液没有黄色。
4、（2）血红蛋白的释放：在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。（3）分离血红蛋白溶液：（方法）离心。试管中的溶液分为4层，从上往下依次是：无色透明的甲苯层。白色薄层固体：脂溶性物质沉淀层。红色透明液体：血红蛋白溶液层。暗红色沉淀层：红细胞破碎物沉淀。（4）透析：方法：取1 mL血红蛋白溶液装入透析袋，将透析袋放入盛有300 mL物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液（pH为7）中，透析12 h。目的：去除样品中分子量较小的杂质。原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。（二）凝胶色谱操作（1）凝胶色谱柱的制作制作步骤：打孔挖穴安管覆网纱包插管。（2）凝胶色谱柱
5、的装填材料：实验所用凝胶是交联葡聚糖凝胶。方法：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，一次性缓慢倒入色谱柱内。不能有气泡存在。然后用300 mL物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡12 h，使凝胶装填紧密。（3）样品的加入和洗脱使吸管管口沿管壁将样品缓慢加入色谱柱内，不要破坏凝胶面。待红色的蛋白质接近色谱柱低端时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集。 考向一 蛋白质提取与分离的方法及原理 1下列有关提取和分离血红蛋白实验的叙述，错误的是A该实验的材料必须选用鸡血B通过透析法可以去除样品中相对分子质量较小的杂质，此为样品的粗提取C凝胶色谱法是利用蛋白质的相对分子
6、质量的大小分离蛋白质D电泳法是利用各种分子带电性质的差异及分子的大小差异分离蛋白质【参考答案】A 2已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种蛋白质分子，分子大小、电荷的性质和数量情况如图所示，下列有关蛋白质分离的叙述正确的是 A若将样品以2 000 r/min的速度离心10 min，分子戊在沉淀中，则丙也一定在沉淀中B若用凝胶色谱法分离样品中的蛋白质，则分子甲移动速度最快C将样品装入透析袋中透析12 h，若分子丙保留在袋内，则乙也一定保留在袋内D若用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质，则分子甲和分子丁形成的电泳带相距最远【答案】A 考向二 蛋白质提取与分离的实验操作 3红细胞中含有大量血
7、红蛋白，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验来提取和分离血红蛋白。下列对血红蛋白提取和分离的叙述，错误的是A血红蛋白提取和分离一般按照“样品处理粗分离纯化纯度鉴定”的顺序进行B纯化过程中要用生理盐水充分溶胀凝胶来配制凝胶悬浮液C样品处理过程中用蒸馏水的目的是使红细胞吸水涨破释放出血红蛋白D可经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定【参考答案】B【试题解析】血红蛋白提取和分离一般按照“样品处理粗分离纯化纯度鉴定”的顺序进行，A正确；纯化过程中要用缓冲溶液充分溶胀凝胶来配制凝胶悬浮液，B错误；样品处理过程中用蒸馏水的目的是使红细胞吸水涨破释放出血红蛋白，C正确；可经SDS聚丙烯酰胺凝胶
8、电泳进行纯度鉴定，D正确。易错警示1红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。2色谱柱的装填：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。3凝胶的预处理：沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡。4色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。 4血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2或CO2的运输。请根据血红蛋白的提取和分离流程图回答问题。 （1）将实验流程补充完整：A为_，B为_。凝胶色谱法是根据_而达到蛋白质分离的有效方法。（2）洗涤红细胞的目的是去除_，洗涤次数过少，无法除去_；离心速度过高和时间过长会使_一同沉淀，达不到分离的效果。洗涤干净的标志是_。释放
9、血红蛋白的过程中起作用的是_。（3）在洗脱过程中加入物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH为7.0)的目的是_。如果红色区带_，说明色谱柱制作成功。【答案】（1）血红蛋白的释放 样品的加入和洗脱 相对分子质量的大小（2）杂蛋白(血浆蛋白) 血浆蛋白 白细胞和淋巴细胞 离心后的上清液中没有黄色 蒸馏水和甲苯（3）准确模拟生物体内的生理环境，保持体外的pH和体内一致 均匀一致地移动【解析】（1）血红蛋的提取与分离的实验步骤主要有样品处理：红细胞的洗涤血红蛋白的释放分离血红蛋白溶液透析；粗分离；纯化：凝胶色谱柱的制作凝胶色谱柱的装填样品的加入和洗脱；纯度鉴定聚丙烯酰胺胶电泳。所以A表示血
10、红蛋白的释放，B表示样品的加入和洗脱。凝胶色谱法的原理是分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。所以凝胶色谱法是根据相对分子质量大小而达到蛋白质分离的有效 1蛋白质的分离与提纯技术是蛋白质研究的重要技术，下列有关叙述不正确的A根据蛋白质分子不能通过半透膜的特性，可将样品中各种不同蛋白质分离B根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小，可通过电泳分离蛋白质C根据蛋白质相对分子质量的大小，可通过凝胶色谱法分离蛋白质D根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法分离蛋白质2蛋白质提取过程中有关透析的叙述，错误的是A用于透析的薄膜要具有
11、选择透过性B透析膜一般是用硝酸纤维素制成的C透析能使小分子自由出入，而将大分子保留在袋内D透析可用于更换样品的缓冲液3下列关于凝胶色谱法的原理及操作不正确的是A是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法B在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而最先流出，而小分子可以进入凝胶内部而流速缓慢，以致最后流出C凝胶内部有很微细的多孔网状结构，其孔隙大小与被分离的物质分子的大小无相应关系D一般情况下，凝胶对要分离的物质没有吸附作用，因此所有要分离的物质都应该被洗脱出来4将处理破裂后的红细胞混合液以2 000 r/min的速度离心10 min后，离心管中的溶液分为四层，从上到下的顺序依次是A血红蛋白、甲
12、苯层、脂质物质层、细胞破碎物沉淀层B甲苯层、细胞破碎物沉淀层、血红蛋白、脂质物质层C脂质物质层、血红蛋白、甲苯层、细胞破碎物沉淀层D甲苯层、脂质物质层、血红蛋白、细胞破碎物沉淀层5为了提取血红蛋白，从学校附近的屠宰场取新鲜的猪血，对猪血处理的正确操作是A要在采血容器中预先加入抗凝血剂柠檬酸钠B取血回来后，马上进行高速长时间离心C将离心后的血细胞加入清水缓慢搅拌D重复洗涤直到上清液呈红色为止6相对分子质量不同的两种蛋白质在凝胶色谱柱中的行进过程，可表示为图中哪一个ABCD7下列有关血红蛋白的提取与分离的实验操作的叙述，正确的是A分离红细胞时采用低速长时间离心B红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水
13、即可C分离血红蛋白溶液要低速短时间离心D透析时要用20 mmol/L的磷酸缓冲液，透析12 h8镰刀型细胞贫血症是一种由基因突变引起的遗传病，患者的红细胞是弯曲的镰刀状。这样的红细胞容易破裂，使人患溶血性贫血，严重时会导致死亡。某科学兴趣小组计划从血红蛋白的成分是否变化来开展研究性学习。下列是该小组成员获得纯度很高的血红蛋白的实验过程，不正确的一项是A对红细胞进行洗涤，在加入蒸馏水和甲苯使红细胞破裂释放出血红蛋白后，将混合液静置一段时间后分层获得血红蛋白溶液B将血红蛋白溶液装入透析袋中透析，可达到粗分离的目的C利用凝胶色谱操作对血红蛋白进行纯化D使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行纯度鉴定，以获
14、得纯度很高的血红蛋白9如图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置。请据图回答下列问题： （1）血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，它在红细胞中的作用体现了蛋白质的_功能。（2）甲装置用于_，目的是_。用乙装置分离蛋白质的方法叫_，是根据_分离蛋白质的有效方法。（3）甲装置中，B是血红蛋白溶液，则A是_；乙装置中，C溶液的作用是_。（4）用乙装置分离血红蛋白时，待_时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集。10红细胞内含有大量血红蛋白，我们可以选用猪、牛、羊或其他哺乳动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白。请回答下列有关问题：（1）血红蛋白的提取和分离一般可分为四步：_、粗
15、分离、纯化和_。（2）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行处理、离心后，收集血红蛋白溶液。以上所述的过程即是样品处理，它包括红细胞的洗涤、_、_。（3）收集的血红蛋白溶液要进行粗分离，其方法是_。然后通过_将样品进一步纯化，最后经_进行纯度鉴定。（4）如图是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品加入和洗脱示意图。请据图回答下列问题。 在加样品示意图中，正确的顺序是_。用吸管加样品时，应注意正确操作，分别是_、_、_。待_时，才加入缓冲溶液。待_接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每_mL收集一管，连续收集。 1【答案】A【解析】蛋白质分子不能通过半透膜，但溶液中的小
16、分子物质则可以透过半透膜，因此可以将蛋白质和溶液中的小分子物质分离，A项错误。电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程，根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小，可通过电泳使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现蛋白质分子的分离，B项正确。凝胶色谱法的原理是：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快，而分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢，所以可以根据蛋白质相对分子质量的大小，通过凝胶色谱法使大分子的蛋白质先洗脱出来，小分子的蛋白质后洗脱出来，从而实现蛋白质分子的分离，C项正确。根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法使不同密度的蛋白质分子位于不同层次的离心液
17、中，从而实现蛋白质的分离，D项正确。2【答案】A 3【答案】C【解析】凝胶内部有很微细的多孔网状结构，其孔隙大小决定了被分离的物质分子的运输路径，从而实现了物质的分离，C错误。4【答案】D【解析】将处理破裂后的红细胞混合液以2 000 r/min的速度离心10 min后，离心管中的溶液分为四层，从上到下的顺序依次是甲苯层、脂质物质层、血红蛋白、细胞破碎物沉淀层，D正确。5【答案】A【解析】为了防止血液凝固，要在采血容器中预先加入抗凝血剂柠檬酸钠，A正确；取血后，应进行低速短时间离心，B错误；离心后的血细胞加入蒸馏水和40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌，使红细胞破裂，C错误；红细胞重复洗
18、涤直到上清液不再呈现黄色为止，D错误。6【答案】B【解析】相对分子质量小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程长，移动的速度慢，相对分子质量大的蛋白质不容易进入凝胶内部的通道，路程短，移动的速度快，B正确。7【答案】D【解析】分离红细胞应采用低速短时间离心，防止白细胞与红细胞一同沉淀，A错误；红细胞释放血红蛋白，需加入蒸馏水和40%体积的甲苯，再在磁力搅拌器上充分搅拌10 min，B错误；分离血红蛋白要高速长时间离心，C错误；透析时要用20 mmol/L的磷酸缓冲液，透析12 h，D正确。8【答案】A 9【答案】（1）运输（2）透析（粗分离） 去除样品中相对分子质量较小的杂质 凝胶色谱法 相对分
19、子质量的大小（3）磷酸缓冲溶液 洗脱血红蛋白（4）红色的蛋白质接近色谱柱的底端【解析】（1）血红蛋白具有运输O2的作用，体现了蛋白质的运输功能。（2）甲是透析装置，用于透析，其目的是去除样品中相对分子质量较少的杂质，使大分子蛋白质保留在袋中。乙是利用凝胶色谱法分离蛋白质的装置，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。（3）甲所示的透析装置中，透析袋内的B是血红蛋白溶液，则透析袋外的A是磷酸缓冲溶液。乙装置中的C为缓冲溶液，其作用是洗脱血红蛋白。（4）由于血红蛋白带有红色，当红色的蛋白质接近色谱柱的底端时，用试管收集血红蛋白，每5 mL收集一管，连续收集。10【答案】（1）样品处理 纯度鉴定（2）血红蛋白的释放 分离血红蛋白溶液 （3）透析 凝胶色谱法 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 （4） 不能破坏凝胶面 贴着管壁加样 使吸管管口沿管壁环绕移动 样品完全进入凝胶层 红色的蛋白质 5【解析】（1）血红蛋白的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。（2）样品处理包括红细胞洗涤、血红蛋白释放、分离血红蛋白溶液和透析四步。（3）收集的血红蛋白溶液要通过透析的方法进行粗分离；样品的纯化是通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，最后
