1、1.药物治疗药物治疗2.手术治疗手术治疗3.放射治疗放射治疗4.理疗理疗传统治疗方法传统治疗方法 基基 因因 治治 疗疗一、一、概念概念二、二、策略策略三、三、基本流程基本流程四、四、应用与展望应用与展望一、基因治疗的概念概念的发展概念的发展经典概念：经典概念：将具有正常功能的基因将具有正常功能的基因置换置换或或增增补补患者体内的缺陷基因，从而达到治疗疾病患者体内的缺陷基因，从而达到治疗疾病的目的。的目的。广义概念：广义概念：将某种遗传物质将某种遗传物质转移转移至患者细胞至患者细胞内，使其在体内内，使其在体内有效表达有效表达，最终达到治疗疾，最终达到治疗疾病目的的方法，均称之为基因治疗。病目的
2、的方法，均称之为基因治疗。二、基因治疗的策略二、基因治疗的策略(一一)直接策略直接策略：针对致病基因针对致病基因(二二)间接策略间接策略：导入与致病基因无直接联系的治疗基因导入与致病基因无直接联系的治疗基因(一一)直接策略直接策略1.基因基因矫正矫正（gene correction）2.基因基因置换置换（gene replacement）3.基因基因增补增补（gene augmentation）又称为又称为补偿性补偿性基因治疗基因治疗 4.基因基因干预干预（gene interference）又称为又称为反义反义基因治疗基因治疗 1.基因基因矫正矫正（gene correction）指将致病基
3、因的指将致病基因的突变碱基加以纠正突变碱基加以纠正，而，而保留正常部分。保留正常部分。2.基因基因置换置换（gene replacement）指通过同源重组（基因打靶）技术，将指通过同源重组（基因打靶）技术，将正常基因正常基因定点整合定点整合到靶细胞基因组内，到靶细胞基因组内，以以原位替换原位替换致病基因。致病基因。v不涉及基因组整体改变的情况下对缺陷基因进不涉及基因组整体改变的情况下对缺陷基因进行精确的行精确的原位修复原位修复，是，是最理想的治疗方式最理想的治疗方式。基因打靶技术基因打靶技术 指目的基因导入靶细胞后，通过目的基因指目的基因导入靶细胞后，通过目的基因与靶细胞内染色体上与靶细胞内
4、染色体上同源同源DNA序列间的交换序列间的交换，将目的基因定点整合到靶细胞基因组上某一确将目的基因定点整合到靶细胞基因组上某一确定位点的技术。定位点的技术。3.基因基因增补增补（gene augmentation）成熟的策略成熟的策略 是指不去除异常基因，将有功能的正常基因导是指不去除异常基因，将有功能的正常基因导入病变细胞或其它细胞后发生入病变细胞或其它细胞后发生非定点整合非定点整合，表，表达正常产物以达正常产物以补偿缺陷补偿缺陷基因的功能，或使原有基因的功能，或使原有的功能得以加强。的功能得以加强。4.基因基因干预干预 是采用特定的方法，导入外源基因选择性地阻断、是采用特定的方法，导入外源
5、基因选择性地阻断、干扰、抑制和封闭有害基因在干扰、抑制和封闭有害基因在DNA、RNA和蛋白质和蛋白质水平的表达及其生物合成。水平的表达及其生物合成。导入导入抑癌基因抑癌基因反义核酸技术反义核酸技术(antisense technology)：反义反义RNA；反基因技术；核酶；反基因技术；核酶RNA干扰干扰（RNA interference)抑癌基因疗法抑癌基因疗法v抑癌基因抑癌基因：是正常细胞内正常存在的，能抑制：是正常细胞内正常存在的，能抑制细胞转化和肿瘤发生的一类基因群。细胞转化和肿瘤发生的一类基因群。Rb基因，基因，p53基因，基因，MTS基因，基因，nm23基因基因vp53基因治疗研究
6、：基因治疗研究：（1）野生型）野生型p53基因的替代疗法基因的替代疗法 （2）突变型）突变型p53基因的阻断疗法基因的阻断疗法 （3）与）与p53基因有关的新型肿瘤疫苗基因有关的新型肿瘤疫苗反义核酸反义核酸1.反义反义RNA（antisense RNA）：与）：与mRNA互补的互补的RNA，抑制，抑制mRNA的加工与翻译。的加工与翻译。2.核酶核酶（ribozyme）：具有催化功能的）：具有催化功能的RNA，其与相应其与相应mRNA结合后能发挥酶活性，将结合后能发挥酶活性，将mRNA降解。降解。3.反义脱氧寡核苷酸，反义脱氧寡核苷酸，ODN反义反义RNA技术技术 体外合成体外合成反义反义RNA
7、，直接导入；，直接导入；将特异的反义基因通过特定的将特异的反义基因通过特定的表达载体表达载体（质（质粒、病毒）粒、病毒）导入细胞，转录出反义导入细胞，转录出反义RNA发挥发挥作用，避免了在给药途径中易被作用，避免了在给药途径中易被RNase降解降解的缺点。的缺点。关键性问题关键性问题1.专一性转移专一性转移 如何专一的作用于病变细胞，而不影响其他如何专一的作用于病变细胞，而不影响其他正常细胞。正常细胞。2.反义反义RNA进入靶细胞前的进入靶细胞前的降解降解问题问题解决：解决：特定特定受体介导受体介导的反义的反义RNA转移转移受体介导的反义受体介导的反义RNA转移转移v 脱唾液酸糖蛋白（脱唾液酸
8、糖蛋白（ASGP）受体）受体介导的转移，介导的转移，通过化学物质作为中间连接物，将通过化学物质作为中间连接物，将ASGP与与多聚多聚赖氨酸（赖氨酸（PL）共价结合，得到共价结合，得到ASGP-PL复合物，复合物，这种复合物可以携带这种复合物可以携带RNA，再专一性地被肝细，再专一性地被肝细胞表面的胞表面的ASGP受体所识别，并被吞噬到肝细胞受体所识别，并被吞噬到肝细胞内发挥作用。内发挥作用。反义反义RNA应用前景应用前景1.安全性高安全性高 不改变基因结构，最终在细胞内被降解。不改变基因结构，最终在细胞内被降解。2.设计和制备方便设计和制备方便 体外转录体外转录获得。获得。3.具有剂量调节效应
9、具有剂量调节效应4.能直接作用于一些能直接作用于一些RNA病毒病毒反基因技术反基因技术 脱氧寡核苷酸脱氧寡核苷酸（oligodeoxyribonucleotide,ODN），也），也被称为被称为TFO(triple helix-forming oligo)通过通过TFO在在DNA结合蛋白的识别位点处，与靶基因结结合蛋白的识别位点处，与靶基因结合形成三螺旋，从而位点专一性地干扰合形成三螺旋，从而位点专一性地干扰DNA与反式作与反式作用因子的结合，抑制转录起始或转录延伸，达到用因子的结合，抑制转录起始或转录延伸，达到“反反基因基因”的目的。的目的。DNA水平水平阻止基因转录阻止基因转录 肽核酸肽核
10、酸（peptide nucleic acids，PNA，一种以多肽骨，一种以多肽骨架取代糖架取代糖-磷酸骨架的磷酸骨架的DNA类似物）类似物）核核 酶酶 催化催化RNA切割和切割和RNA剪接剪接Recognition sequences“hammerhead”ribozymes1981年，年，Cetch和和Alfman首次发现了一类具有首次发现了一类具有特异性剪切特异性剪切RNA活性的活性的RNA分子。分子。核酶具有稳定的空间结构，核酶具有稳定的空间结构，不易受到不易受到RNA酶酶的攻击的攻击。核酶在切断核酶在切断mRNA后，又可从杂交链上解脱后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合并切割其他的下
11、来，重新结合并切割其他的mRNA，效率效率高于反义高于反义RNA。核酶的特点核酶的特点 RNA干扰技术干扰技术概念：概念：短的双链短的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使同源导入细胞，可以使同源mRNA发生特异性的降解，从而阻断发生特异性的降解，从而阻断相应基因的表达。相应基因的表达。v 高度的序列专一性高度的序列专一性v 高效性高效性v 易操作性易操作性miRNA MicroRNA（miRNA）是内源性是内源性的，是一种非编码的的，是一种非编码的RNA；由；由miRNA基因表达出最初的基因表达出最初的pri-miRNA分子。分子。靶标靶标mRNA通常发生不完全结合，并且结合的位点是通常发
12、生不完全结合，并且结合的位点是mRNA的非编码区的的非编码区的3端；它不会降解靶标端；它不会降解靶标mRNA，而只是阻止而只是阻止mRNA的翻译。的翻译。miRNA能够能够调节与生长发育有关的基因调节与生长发育有关的基因。在生物体中的表达具有在生物体中的表达具有时序性、保守性和组织特异性时序性、保守性和组织特异性(二二)间接策略间接策略导入与致病基因无直接联系的治疗基因导入与致病基因无直接联系的治疗基因1.1.免疫免疫基因治疗基因治疗 2.2.分子化疗分子化疗3.3.特异性细胞杀伤特异性细胞杀伤1.1.免疫基因治疗免疫基因治疗(1)细胞因子细胞因子基因治疗基因治疗 IL-2、IL-4、IL-1
13、、IL-6、IL-7、IL-12、INF-、TNF-、G-CSF、GM-CSF(2)免疫增强免疫增强基因疗法基因疗法 MHC I类抗原、共刺激分子类抗原、共刺激分子(3)肿瘤肿瘤DNA疫苗疫苗疗法疗法 癌胚抗原（癌胚抗原（CEA）制备的肿瘤）制备的肿瘤DNA疫苗疫苗 Tumour Necrosis Factor2.分子化疗(1)自杀基因自杀基因疗法：疗法：TK基因、基因、CD基因基因(2)化疗保护性化疗保护性基因治疗：基因治疗：MDR基因基因(3)药物增敏药物增敏基因治疗：基因治疗：钙调素基因钙调素基因 (1)(1)自杀基因疗法自杀基因疗法 自杀基因（自杀基因（suicide gene)，前体
14、药物酶转化基因，前体药物酶转化基因 该基因表达产生的酶可催化该基因表达产生的酶可催化无毒性无毒性的药物前体转变为的药物前体转变为细胞毒性物质细胞毒性物质，从而杀死肿瘤细胞；，从而杀死肿瘤细胞；同时通过同时通过“旁观者效应旁观者效应”（bystander effect）杀死邻）杀死邻近未导入该基因的分裂细胞而显著扩大杀伤效应。近未导入该基因的分裂细胞而显著扩大杀伤效应。由于携带该基因的受体细胞本身也被杀死，所以这类由于携带该基因的受体细胞本身也被杀死，所以这类基因被称为基因被称为“自杀基因自杀基因”。自杀基因 单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒胸苷激酶（胸苷激酶（HSV-TK）基因）基因 编 码 胸 苷
15、激 酶（编 码 胸 苷 激 酶（T K）催 化 丙 氧 鸟 苷）催 化 丙 氧 鸟 苷（ganciclovir,GCV）成为磷酸化的核苷酸类）成为磷酸化的核苷酸类似物，阻断似物，阻断DNA的合成而使细胞死亡。的合成而使细胞死亡。大肠杆菌大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（胞嘧啶脱氨酶（CD）基因）基因 将将5-氟氟胞胞嘧啶（嘧啶（5-FC）转化为）转化为5-氟氟尿尿嘧啶嘧啶（5-FU）而发挥细胞毒性作用。）而发挥细胞毒性作用。viral vector （HSV）tumour cellthymidine kinasegeneganciclovir phosphateGanciclovir（GCV）tkGanc
16、iclovir phosphateinhibits DNA polymeraseCell death Including bystander cells (2)(2)化疗保护性基因治疗化疗保护性基因治疗 指将编码指将编码抗细胞毒性药物蛋白的基因抗细胞毒性药物蛋白的基因导入人体导入人体细胞，以提高机体耐受肿瘤化疗药物的能力。细胞，以提高机体耐受肿瘤化疗药物的能力。如将多药抗性（如将多药抗性（multiple drug resistance,MDR）基因基因MDR-1导入骨髓造血干细胞，减少骨髓受导入骨髓造血干细胞，减少骨髓受抑制的程度，以加大化疗剂量，提高化疗效果。抑制的程度，以加大化疗剂量，提
17、高化疗效果。(3)(3)药物增敏基因治疗药物增敏基因治疗 将外源基因插入肿瘤细胞后，改变肿瘤细胞对将外源基因插入肿瘤细胞后，改变肿瘤细胞对药物的敏感性。药物的敏感性。如将如将钙调素基因钙调素基因转入癌细胞，其表达产物转入癌细胞，其表达产物作为作为细胞内信号转导系统的重要物质，明显增强肿细胞内信号转导系统的重要物质，明显增强肿瘤细胞对化疗药物的吸收量而相应减少了排出瘤细胞对化疗药物的吸收量而相应减少了排出量，量，使癌细胞对化疗药物的敏感性明显提高。使癌细胞对化疗药物的敏感性明显提高。3.3.特异性细胞杀伤特异性细胞杀伤 指利用重组指利用重组DNA技术将生物来源的技术将生物来源的细胞毒素基细胞毒素
18、基因因与一些特异与一些特异受体的配体基因受体的配体基因融合，构建融合融合，构建融合基因，导入高度表达该受体的肿瘤细胞，以特基因，导入高度表达该受体的肿瘤细胞，以特异性杀伤该肿瘤细胞。异性杀伤该肿瘤细胞。特异性细胞杀伤特异性细胞杀伤 如将绿脓杆菌外毒素（如将绿脓杆菌外毒素（PE）或白喉毒素（）或白喉毒素（DT）基因与基因与TGF基因组成基因组成融合基因融合基因TGF-PE，或，或TGF-DT。由于由于TGF与表皮生长因子与表皮生长因子EGF结构类似，也结构类似，也能与表皮生长因子受体（能与表皮生长因子受体（EGFR）结合）结合；故该融合基因可故该融合基因可特异性进入并杀死特异性进入并杀死高度表达
19、高度表达EGFR的膀胱癌、肾癌、肺癌、乳腺癌等肿瘤的膀胱癌、肾癌、肺癌、乳腺癌等肿瘤细胞。细胞。三、基因治疗的基本流程三、基因治疗的基本流程（一）（一）外源基因外源基因的选择与制备的选择与制备 （二）（二）载体载体的选择与构建的选择与构建 （三）（三）靶细胞靶细胞的选择的选择（四）（四）基因转移基因转移 （五）基因转染细胞的（五）基因转染细胞的筛选与鉴定筛选与鉴定（六）（六）回输体内回输体内 基因治疗的方式根据基因导入的方式分为两种：根据基因导入的方式分为两种：1.直接体内疗法（直接体内疗法（in vivo）是指将目的基因是指将目的基因直接导入直接导入体内有关的组织器官，体内有关的组织器官，使
20、其进入相应的细胞并进行表达。使其进入相应的细胞并进行表达。2.间接体内疗法（间接体内疗法（ex vivo）是指在体外将目的基因是指在体外将目的基因导入靶细胞导入靶细胞，经过，经过筛选筛选和增殖和增殖后将细胞后将细胞回输回输给患者，使该基因在体内给患者，使该基因在体内有效地表达相应产物，以达到治疗的目的。有效地表达相应产物，以达到治疗的目的。基因治疗的种类基因治疗的种类 生殖细胞生殖细胞基因治疗基因治疗 可遗传性可遗传性 伦理学问题伦理学问题 禁止应用人体禁止应用人体 体细胞体细胞基因治疗：基因治疗：研究重点研究重点体细胞治疗体细胞治疗的概念的概念 指应用人的自体、同种异体或异种（非人体）指应用
21、人的自体、同种异体或异种（非人体）的的体细胞体细胞；经经体外操作体外操作后。后。回输回输（或植入）人体的治疗方法。（或植入）人体的治疗方法。（一）外源基因的选择与制备（一）外源基因的选择与制备 外源基因外源基因 目的基因：目的基因：与致病基因相对应的有功能的正常基因与致病基因相对应的有功能的正常基因 与致病基因无关、有治疗作用的基因与致病基因无关、有治疗作用的基因 标记基因标记基因:新霉素磷酸转移酶（新霉素磷酸转移酶（Neo）基因）基因 外源基因的获得外源基因的获得 基因克隆基因克隆 人工合成人工合成 PCR扩增扩增 外源基因的选择原则外源基因的选择原则1.1.体内少量表达就可显著改善症状体内
22、少量表达就可显著改善症状；2.2.过高表达不会对机体造成危害过高表达不会对机体造成危害；3.3.在在抗病毒抗病毒和和病原体病原体的基因治疗中，所选择的靶基因的基因治疗中，所选择的靶基因应在病毒和病原体的生活史中起重要的作用，并且应在病毒和病原体的生活史中起重要的作用，并且该序列是特异的；该序列是特异的；4.4.肿瘤肿瘤病人多有免疫缺陷，可选用病人多有免疫缺陷，可选用免疫因子基因免疫因子基因转入转入人体；可采用反义技术封闭细胞内活化的人体；可采用反义技术封闭细胞内活化的癌基因癌基因或或向细胞内转入向细胞内转入野生型抑癌基因野生型抑癌基因，抑制肿瘤生长，所，抑制肿瘤生长，所针对的癌基因或抑癌基因应
23、与该肿瘤的发生和发展针对的癌基因或抑癌基因应与该肿瘤的发生和发展有明确的相关性。有明确的相关性。（二）载体的选择与构建（二）载体的选择与构建 病毒载体：病毒载体：逆转录病毒（逆转录病毒（RV)腺病毒（腺病毒（AV)腺相关病毒（腺相关病毒（AAV)单纯疱疹病毒（单纯疱疹病毒（HSV)痘苗病毒（痘苗病毒（VV)非病毒载体：非病毒载体：脂质体法脂质体法 直接注射法直接注射法 受体介导基因转移受体介导基因转移 DNA-磷酸钙共沉淀磷酸钙共沉淀 电穿孔电穿孔逆转录病毒结构逆转录病毒结构逆转录病毒的基因组结构逆转录病毒的基因组结构3LTR5LTRgag pol env 结构基因结构基因gag(group
24、antigen)：编码核心蛋白和属特异性抗原：编码核心蛋白和属特异性抗原pol(polymerase)：编码逆转录酶编码逆转录酶env(envelop)：编码编码病毒外壳蛋白和包膜蛋白病毒外壳蛋白和包膜蛋白LTR（long terminal repeat）序列）序列含增强子、启动子、转录所需起始和终止信号含增强子、启动子、转录所需起始和终止信号逆转录病毒的生活史逆转录病毒的生活史逆转录病毒逆转录病毒宿主宿主细胞细胞病毒病毒RNAcDNA前前 病病 毒毒病毒病毒RNA包装蛋白包装蛋白包装包装成完整成完整的病毒颗粒的病毒颗粒出芽分泌出芽分泌子代病毒子代病毒感染其他感染其他细胞细胞整整 合合病毒载体
25、构建病毒载体构建（1）去除去除病毒病毒致病性结构致病性结构的基因序列如逆转录的基因序列如逆转录病毒的病毒的gag、pol、env基因，从结构上保证病基因，从结构上保证病毒的安全性。同时毒的安全性。同时产生的空白区以目的基因取产生的空白区以目的基因取而代之；而代之；（2）保留保留其基因的其基因的调控序列及包装序列调控序列及包装序列 等；等；（3）插入标记基因插入标记基因如如Neo基因以对基因转染细基因以对基因转染细胞的抗性筛选等。胞的抗性筛选等。包装细胞 指指将将缺失缺失了了包装信号包装信号及相关序列的及相关序列的缺陷型逆转缺陷型逆转录病毒录病毒（辅助病毒辅助病毒）导入哺乳细胞内而制备成）导入哺
26、乳细胞内而制备成的一种特殊的细胞系的一种特殊的细胞系.这种细胞因携带有完整这种细胞因携带有完整的病毒结构基因序列能够大量产生病毒包装蛋的病毒结构基因序列能够大量产生病毒包装蛋白，而辅助病毒自身缺乏包装信号（白，而辅助病毒自身缺乏包装信号（序列）序列）而不能包装而不能包装,不产生有复制能力的野生型病毒不产生有复制能力的野生型病毒颗粒。颗粒。假病毒颗粒假病毒颗粒 当逆转录病毒载体转染进包装细胞后，转录出标记基当逆转录病毒载体转染进包装细胞后，转录出标记基因和目的基因的因和目的基因的RNA，含有两端的，含有两端的LTR和和包装信号包装信号，被包装细胞产生的病毒蛋白包装成病毒颗粒被包装细胞产生的病毒蛋
27、白包装成病毒颗粒。因包装的因包装的RNA中不含病毒蛋白的编码序列，导致这种中不含病毒蛋白的编码序列，导致这种病毒只有病毒只有一次感染能力一次感染能力，即在感染细胞后，不能产生，即在感染细胞后，不能产生新的病毒颗粒，称为新的病毒颗粒，称为假病毒颗粒假病毒颗粒。假病毒颗粒释放到包装细胞的培养液中，用于感染靶假病毒颗粒释放到包装细胞的培养液中，用于感染靶细胞，从而将其携带的治疗基因送入靶细胞。细胞，从而将其携带的治疗基因送入靶细胞。Vector DNAHelper DNAEngineering a Virus into a Vectorwildtype virusViral vectorreplic
28、ationproteinsstructuralproteinsPackagingTherapeutic geneessential viral genesPackaging cellY YvectorVector uncoatingTherapeutic mRNAand proteinEpisomalvectorIntegrated expressionTarget cellGene TransferBased on Kay et al 2001逆转录病毒载体的特点逆转录病毒载体的特点 1.1.env env编码的糖蛋白结合细胞膜上的特异性受编码的糖蛋白结合细胞膜上的特异性受体，体，基因转移效
29、率更高基因转移效率更高；2.2.结构基因结构基因gaggag、envenv、polpol的缺失不影响其他的缺失不影响其他部分的活性；部分的活性；3.3.整合到靶细胞基因组，可整合到靶细胞基因组，可长期表达长期表达；4.4.包装好的假病毒颗粒分泌至包装细胞的培包装好的假病毒颗粒分泌至包装细胞的培养上清中，养上清中，易于分离制备易于分离制备。问题问题1.只能感染分裂期细胞只能感染分裂期细胞,靶细胞靶细胞DNA合成很活合成很活跃，跃，因为病毒感染和整合作用均依赖靶细胞因为病毒感染和整合作用均依赖靶细胞DNA的复制的复制；2.安全性安全性问题问题随机整合随机整合：诱发插入突变诱发插入突变，激活癌基因激
30、活癌基因缺陷型逆转录病毒通过缺陷型逆转录病毒通过重组重组获得复制能力获得复制能力腺病毒载体腺病毒载体 1.基因组：基因组：双链无包膜双链无包膜DNA病毒病毒，36kb 2.通过通过受体介导内吞作用受体介导内吞作用进入细胞，基因导入进入细胞，基因导入效率高。效率高。3.不整合不整合宿主基因组，安全。宿主基因组，安全。4.宿主细胞范围广泛。宿主细胞范围广泛。5.可口服、喷雾吸入或气管内滴注。可口服、喷雾吸入或气管内滴注。6.载体容量大。载体容量大。7.体外容易培养制备，病毒滴度较高。体外容易培养制备，病毒滴度较高。常用的病毒载体及其基因转移的特点常用的病毒载体及其基因转移的特点 逆转录病毒逆转录病
31、毒 腺病毒腺病毒 腺相关病毒腺相关病毒 单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒 基因组基因组 正链正链RNA RNA 线性线性dsDNA dsDNA 线性线性ssDNA dsDNAssDNA dsDNA 8 811 kb 36 kb 4.7 kb 152 kb11 kb 36 kb 4.7 kb 152 kb外源基因容量外源基因容量 7 kb 7.5 kb 3.5 kb 30 kb 7 kb 7.5 kb 3.5 kb 30 kb 重组病毒滴度重组病毒滴度 中中 高高 较低较低 高高靶细胞状态靶细胞状态 分裂细胞，表面分裂细胞，表面 分裂细胞或分裂细胞或 分裂细胞或分裂细胞或 分裂细胞或分裂细胞或 须有特殊
32、受体须有特殊受体 非分裂细胞非分裂细胞 非分裂细胞非分裂细胞 非分裂细胞非分裂细胞基因转移效率基因转移效率 高高 高高 高高 高高 基因整合基因整合 随机整合随机整合 不整合不整合 定点整合于定点整合于 不整合不整合 染色体染色体19q19q外源基因表达状况外源基因表达状况 短暂短暂/稳定表达稳定表达 短暂表达短暂表达 稳定表达稳定表达 短暂短暂/稳定表达稳定表达安全性及其它安全性及其它 相对较安全相对较安全 可能引起炎症可能引起炎症 无病原性无病原性 可能出现毒性反应可能出现毒性反应 宿主范围广宿主范围广 和免疫反应和免疫反应 神经细胞嗜向性神经细胞嗜向性(三三)靶细胞的选择靶细胞的选择 生
33、殖细胞生殖细胞:禁止禁止 体细胞体细胞：淋巴细胞、造血细胞、淋巴细胞、造血细胞、内皮细胞、肌肉细胞、内皮细胞、肌肉细胞、肝细胞、成纤维细胞肝细胞、成纤维细胞 肿瘤细胞等肿瘤细胞等 靶细胞的选择靶细胞的选择 可根据疾病的特点、目的基因及其转移的可根据疾病的特点、目的基因及其转移的方式等因素来确定。方式等因素来确定。选择的原则：选择的原则：(1)(1)便于从体内取出和回输；便于从体内取出和回输；(2)(2)便于在体外培养与增殖；便于在体外培养与增殖；(3)(3)便于基因的高效转移；便于基因的高效转移；(4)(4)能够持续表达目的基因。能够持续表达目的基因。(四四)基因转移基因转移 病毒法：病毒法：
34、主要通过携带有外源基因的病毒载体感染靶细主要通过携带有外源基因的病毒载体感染靶细胞来实现基因的转移。胞来实现基因的转移。非病毒法：非病毒法：物理方法物理方法DNADNA直接注射、显微注射、电穿孔、直接注射、显微注射、电穿孔、微粒轰击及基因枪技术等；微粒轰击及基因枪技术等；化学方法化学方法脂质体融合法、磷酸钙沉淀法、脂质体融合法、磷酸钙沉淀法、DEAE-DEAE-葡聚糖法等。葡聚糖法等。受体介导的内吞作用受体介导的内吞作用 脂质体脂质体 liposomes 其基本原理是利用阳离子脂质体单体与其基本原理是利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可以自动形成包埋外源混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂
35、质的脂质体，然后与细胞一起温育，即可通过细胞内体，然后与细胞一起温育，即可通过细胞内吞作用将外源吞作用将外源DNA转移到细胞内。转移到细胞内。优势：使用方便、成本低廉。优势：使用方便、成本低廉。缺陷缺陷：转染效率较低转染效率较低和和转染基因表达时间短暂。转染基因表达时间短暂。(五五)基因转染细胞的筛选与鉴定基因转染细胞的筛选与鉴定(五五)基因转染细胞的筛选与鉴定基因转染细胞的筛选与鉴定 外源基因表达的鉴定：外源基因表达的鉴定：采用采用Northern印迹杂交印迹杂交：检测：检测mRNA的表达的表达 测定其表达产物即测定其表达产物即蛋白质的含量蛋白质的含量等方法。等方法。动物实验动物实验(六六)
36、回输体内回输体内 方式：方式：静脉注射、肌注、皮下注射、滴鼻等静脉注射、肌注、皮下注射、滴鼻等 基因修饰的淋巴细胞以基因修饰的淋巴细胞以静脉注射静脉注射的方式回输到血的方式回输到血液中；液中；将皮肤成纤维细胞以将皮肤成纤维细胞以细胞胶原悬液注射细胞胶原悬液注射至患者皮至患者皮下组织；下组织；采用采用自体骨髓移植自体骨髓移植的方法输入造血细胞；的方法输入造血细胞；或以或以导管技术导管技术将血管内皮细胞定位输入血管等。将血管内皮细胞定位输入血管等。第一军医大学分子生物学研究所第一军医大学分子生物学研究所第一军医大学分子生物学研究所第一军医大学分子生物学研究所第一军医大学分子生物学研究所第一军医大学
37、分子生物学研究所基因治疗的应用基因治疗的应用遗传病遗传病 替补法，导入正常基因替补法，导入正常基因病毒性疾病病毒性疾病 阻断病毒基因在体内的转录和翻译阻断病毒基因在体内的转录和翻译肿瘤肿瘤 基因的补充和修复，免疫疗法，细胞毒基因基因的补充和修复，免疫疗法，细胞毒基因疗法疗法遗传病的基因治疗遗传病的基因治疗 1 1）在）在DNADNA水平水平明确其发病原因及机制明确其发病原因及机制；2 2）隐性遗传的单基因遗传病隐性遗传的单基因遗传病；3 3）该基因的）该基因的表达不需要精确调控表达不需要精确调控；4)4)该基因能在一种该基因能在一种便于临床操作便于临床操作的组织细胞的组织细胞中表达并发挥生理作
38、用；中表达并发挥生理作用；5 5）该遗传病）该遗传病不经治疗将有严重后果不经治疗将有严重后果。遗传病基因治疗的临床研究遗传病基因治疗的临床研究1.腺苷脱氨酶（腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症）缺乏症2.家族性高胆固醇血症（家族性高胆固醇血症（FH）3.囊性纤维变性（囊性纤维变性（CF）4.粘多糖沉积症粘多糖沉积症5.血友病血友病B（凝血因子（凝血因子IX缺乏）缺乏）“先天性重症联合免疫缺陷综合征先天性重症联合免疫缺陷综合征”(SCID)(SCID)Ashanti De Silva was the first patient to be treated with gene therapy in 199
39、0.She received infusions of T cells that had been transduced with a gene for ADA(an enzyme that she lacks)ADAADA缺陷病的分子机制缺陷病的分子机制 腺苷脱氨酶（腺苷脱氨酶（ADAADA）催化腺嘌呤核苷（）催化腺嘌呤核苷（A A）和脱）和脱氧腺嘌呤核苷（氧腺嘌呤核苷（dAdA）脱氨，生成次黄嘌呤核苷）脱氨，生成次黄嘌呤核苷和脱氧次黄嘌呤核苷。和脱氧次黄嘌呤核苷。ADAADA缺陷缺陷 脱氧腺嘌呤核苷酸代谢受阻脱氧腺嘌呤核苷酸代谢受阻 dATPdATP 抑制核糖核苷还原酶活性抑制核糖核苷还原
40、酶活性 阻止阻止DNADNA复制和修复复制和修复 导致细胞死亡，对导致细胞死亡，对淋巴细淋巴细胞胞毒性最强。毒性最强。1 1）单个核细胞的分离单个核细胞的分离：使用淋巴细胞分层液：使用淋巴细胞分层液分离患儿血中单个核细胞；分离患儿血中单个核细胞；2 2）单个核细胞培养：）单个核细胞培养：以以“CD3CD3抗体抗体 +IL2+IL2”体体外培养以外培养以刺激刺激T T细胞增殖细胞增殖，分化；，分化；3 3）逆转录病毒载体介导）逆转录病毒载体介导外源基因外源基因（治疗基因（治疗基因 +标志基因）标志基因）转染转染T T细胞细胞；4 4）将转染细胞）将转染细胞回输回输给患儿体内。给患儿体内。ADA基
41、因治疗方案基因治疗方案肿瘤的基因治疗策略肿瘤的基因治疗策略 一、一、抑制和杀伤肿瘤细胞抑制和杀伤肿瘤细胞 1.自杀基因疗法（自杀基因疗法（tk、CD基因基因）2.抑制癌基因的表达抑制癌基因的表达 （反义反义RNA、核酶核酶、细胞内抗体细胞内抗体）3.恢复抑癌基因的功能（恢复抑癌基因的功能（p53、Rb基因基因）4.抗肿瘤血管形成抗肿瘤血管形成肿瘤的基因治疗策略肿瘤的基因治疗策略 二、二、肿瘤细胞的基因肿瘤细胞的基因“修饰修饰”1.导入细胞因子基因导入细胞因子基因 2.导入导入MHC基因和共刺激分子基因基因和共刺激分子基因 三、调节和增强机体的免疫功能三、调节和增强机体的免疫功能 1.1.细胞因
42、子基因导入免疫细胞细胞因子基因导入免疫细胞 2.2.基因修饰的树突状细胞基因修饰的树突状细胞 3.3.分泌免疫毒素的分泌免疫毒素的T T淋巴细胞淋巴细胞 4.4.肿瘤肿瘤DNADNA疫苗疫苗肿瘤的基因治疗策略肿瘤的基因治疗策略肿瘤基因治疗临床试验方案肿瘤基因治疗临床试验方案黑色素瘤黑色素瘤8383前列腺癌前列腺癌4444乳腺癌乳腺癌3232间质瘤间质瘤3 3卵巢癌卵巢癌3131头颈部癌症头颈部癌症3131胶质瘤胶质瘤2828结肠癌结肠癌2525肺癌肺癌2626胰腺癌胰腺癌3 3肾癌肾癌2121膀胱癌膀胱癌2 2成神经细胞瘤成神经细胞瘤7 7子宫颈癌子宫颈癌6 6病毒病毒性疾病的基因治疗性疾病的
43、基因治疗针对病毒针对病毒:1.诱导对病毒诱导对病毒RNA的降解的降解2.抑制病毒与宿主细胞结合抑制病毒与宿主细胞结合3.干扰病毒基因组的转录起始和调控干扰病毒基因组的转录起始和调控4.抑制病毒基因组的复制和蛋白质合成抑制病毒基因组的复制和蛋白质合成5.RNA干扰技术干扰技术中国的基因治疗中国的基因治疗1991.12 血友病血友病B，凝血因子，凝血因子IX，逆转录病毒载，逆转录病毒载体，导入患者自身皮肤成纤维细胞。体，导入患者自身皮肤成纤维细胞。恶性脑胶质瘤，恶性脑胶质瘤，TKTK基因基因非小细胞肺癌，逆转录病毒，非小细胞肺癌，逆转录病毒，IL-2基因治疗药物基因治疗药物 20032003年年1
44、010月月1616日，拥有自主知识产权的重组日，拥有自主知识产权的重组人人p53p53腺病毒注射液腺病毒注射液(Gendicine)(Gendicine)获得国家食获得国家食品药品监督管理局批准的新药证书。品药品监督管理局批准的新药证书。这是世界上第一个获得正式批准的基因治疗这是世界上第一个获得正式批准的基因治疗药物。药物。基因治疗存在的问题基因治疗存在的问题 三个关键问题：三个关键问题：构建高效、靶向性基因转移系统构建高效、靶向性基因转移系统 发现切实有效的治疗基因发现切实有效的治疗基因 外源基因表达的调控外源基因表达的调控 一个需要重视的问题：一个需要重视的问题：外源基因的导入对机体带来的
45、不利影响外源基因的导入对机体带来的不利影响 l19991999年年“杰辛格杰辛格”基因疗法基因疗法失败失败.l1818岁的泽西岁的泽西杰辛格患有鸟杰辛格患有鸟氨酸氨甲酰基转移酶氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)(OTC)缺失症，接受基因疗法后意缺失症，接受基因疗法后意外死亡外死亡。现状及展望现状及展望基因治疗现阶段仅仅是实验性地运用于经过其基因治疗现阶段仅仅是实验性地运用于经过其他治疗无效的他治疗无效的“绝症绝症”；酶及药物性的化学疗法，以及骨髓、器官移植酶及药物性的化学疗法，以及骨髓、器官移植仍然是当前治疗多种遗传病的最有效手段；仍然是当前治疗多种遗传病的最有效手段；癌症的治疗仍以手术切除及化疗为
46、主。癌症的治疗仍以手术切除及化疗为主。道路曲折，前途光明道路曲折，前途光明本章小结本章小结 基因治疗：基因治疗：指将外源基因转移至患者细胞内并有效适度表达，以达指将外源基因转移至患者细胞内并有效适度表达，以达到治疗疾病的目的。到治疗疾病的目的。基因治疗策略：基因治疗策略：(1)(1)直接策略：直接策略：基因矫正、基因置换、基因增补、基因干预；基因矫正、基因置换、基因增补、基因干预；(2)(2)间接策略：间接策略：免疫基因治疗、分子化疗、特异性细胞杀伤等。免疫基因治疗、分子化疗、特异性细胞杀伤等。本章小结本章小结 基因治疗方式基因治疗方式：直接体内疗法和间接体内疗法两种。直接体内疗法和间接体内疗
47、法两种。基本流程：基本流程：外源基因的选择与制备、表达载体的选择与构建、靶外源基因的选择与制备、表达载体的选择与构建、靶细胞的选择，基因转移，基因转染细胞的筛选与鉴定，细胞的选择，基因转移，基因转染细胞的筛选与鉴定，回输体内。回输体内。基因治疗在遗传性疾病、肿瘤、心血管疾病、感染性基因治疗在遗传性疾病、肿瘤、心血管疾病、感染性疾病以及神经系统疾病等的治疗中具有诱人的前景。疾病以及神经系统疾病等的治疗中具有诱人的前景。思思 考考 题题 肿瘤的基因治疗包括哪些基本策略？肿瘤的基因治疗包括哪些基本策略？以逆转录病毒载体进行以逆转录病毒载体进行ex vivoex vivo基因治疗为例，基因治疗为例，试述其技术原理及基本过程。试述其技术原理及基本过程。针对目前存在的问题，该怎样看待基因治疗的针对目前存在的问题，该怎样看待基因治疗的现状及发展前景？现状及发展前景？93本文档支持任意编辑，本文档支持任意编辑，下载使用，定会成功！下载使用，定会成功！
