1、实验一 普通光学显微镜的使用和微生物形态的观察一、实验目的1学习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术；2了解油浸系物镜的基本原理；3掌握油浸系物镜的使用方法二、实验原理通过显微镜的物镜和目镜放大以后能够很好的看清个体微小的微生物的形态，显微镜性能的好坏处于放大倍数有关外还决定于显微镜的分辨率，分辨率即物镜能判别某物体两点间的最小距离（D）。因此就以分辨距离来衡量显微镜的分辨力。D可用下式表示：D=/2N.A.D值愈小，分辨力愈高，物象愈清楚。提高分辨力的方法：减低波长；（2）增大折射率；（3）加大镜口角来提高分辨力。当实际应用时光源和物镜的镜口角是确定的，所以在使用油镜时我们采用折射率较高的香柏油作
2、为介质提高显微镜的分辨率三、实验器材大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的永久装片光学显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸四、实验步骤认识光学显微镜的构造显微镜的机械装置（1）镜座和镜臂 它们是显微镜的基本骨架，起稳固和支持显微镜的作用。（2）镜筒 镜筒上接接目镜，下接转换器，形成接目镜与接物镜（装在转换器下）间的暗室。（3）物镜转换器 物镜转换器上可安装34个接物镜，可以按需要将其中的任何一个接物镜和镜筒接通，与镜筒上面的接目镜构成一个放大系统。（4）载物台 用于安放玻片。载物台中央有一孔，为光线通路。在台上装有弹簧标本夹和推动器，其作用为固定或移动标本的位置，使得镜检对象恰好位于视野中心。（5
3、）推动器 是移动标本的机械装置。（6）调焦装置 即粗螺旋和细螺旋，是移动镜筒调节接物镜和标本间距离的机件。显微镜的光学系统（1）反光镜由一平面和另一凹面的镜子组成，可以将投射在它上面的光线反射到聚光器透镜的中央，照明标本。（2）聚光器 在载物台下面，它是由聚光透镜、虹彩光圈和升降螺旋组成的。其作用是将光源经反光镜反射来的光线聚焦于样品上，以得到最强的照明，使物象获得明亮清晰的效果。（3）物镜物镜的种类很多，可从不同角度来分类：根据物镜前透镜与被检物体之间的介质不同，可分为：干燥系物镜 以空气为介质，如常用的40以下的物镜，数值孔径均小于1。油浸系物镜 常以香柏油为介质，此物镜又叫油镜头，其放大
4、率为90100，数值孔径值NA大于1。根据物镜放大率的高低，可分为：低倍物镜 指10以下；中倍物镜 指20；高倍物镜 指4065；油浸物镜 指90以上。（4）目镜 目镜的作用是把物镜放大了的实像再放大一次，并把物像映入观察者的眼中。普通光学显微镜的目镜通常由两块透镜组成，上端的一块透镜称“接目透镜”，下端的透镜称“聚透镜”。上下透镜之间或在两个透镜的下方，装有由金属制的环状光阑或叫“视场光阑”。2. 介绍显微镜的使用过程（一）观察前的准备（1）显微镜从显微镜柜或镜箱内拿出时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地将显微镜搬运到实验桌上。（2）将显微镜放在自己身体的左前方，离桌子边缘约10cm左
5、右，右侧可放记录本或绘图纸。（3）调节光照，将10物镜转入光孔，将聚光器上的虹彩光圈打开到最大位置，用左眼观察目镜中视野的亮度使视野的光照达到最明亮最均匀为止。（二）低倍镜观察将标本片放置在载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使被观察的标本处在物镜正下方，转动粗调节旋钮，使物镜调至接近标本处，用目镜观察并同时下降载物台，直至物像出现，再用细调节旋钮使物像清晰为止。用推动器移动标本片，找到合适的目的像并将它移到视野中央进行观察。（三）高倍镜观察在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后，轻轻转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置。对聚光器光圈及视野亮度进行适当调节后微调细调节器使物像清晰，利用
6、推进器移动标本仔细观察并记录所观察到的结果。（四）油镜观察1先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将载物台下降）约2cm，并将高倍镜转出。2在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。3从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升，使油浸物镜浸入香柏油中，使镜头几乎与标本接触。将聚光器升至最高位置并开足光圈，调节照明使视野的亮度合适，用粗调节器将载物台徐徐上升，直至视野中出现物像并用细调节器使其清晰准焦为止。4观察完毕，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醚酒精混合液（乙醚2份，纯酒精3份）或二甲苯，擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭23下即可，（注意向一个方向擦拭）。5将各
7、部分还原，转动物镜转换器，使物镜头不与载物台通光孔相对，而是成八字形位置，降下聚光器，反光镜与聚光器垂直，再将载物台下降至最低，用一个干净手帕将接目镜罩好，以免目镜头沾污灰尘。最后用柔软纱布清洁载物台等机械部分，然后将显微镜放回柜内或镜箱中。五、实验报告1实验结果 绘出大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态图2. 实验心得实验二 细菌的革兰氏染色法一、实验目的1学习并初步掌握革兰氏染色法。2了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。二、实验原理该染色法所以能将细菌分为G+菌和G菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联
8、度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。三、实验器材1. 菌种 培养12-16h的金黄色葡萄球菌，培养24小时的大肠杆菌（Escherichia coli）2. 试剂结晶紫、卢哥氏碘液、95%酒精、蕃红3. 其他用具载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜等四、实验步骤1制片： (1) 涂菌：取干净载玻片一块，在载玻片上加一滴生理盐水，按无菌操作法取菌涂片，注意取菌不要
9、太多。(2) 干燥：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。(3)固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）2染色(1) 初染：滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色2min，水洗。(2) 媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。(3) 脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95的乙醇脱色20sec，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。(4) 复染：用番红液复染约2min，水洗。3镜检：干燥后，从低倍到高倍顺次观察，最后用用油镜观察。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌，被染成红色的为革兰氏阴性菌大肠杆菌。4、混菌的
10、革兰氏染色：按上述方法，在同一载玻片上，以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作混和涂片、染色、镜检进行比较。五、实验报告1实验结果列表简述2株细菌的染色观察结果（说明各菌的形状、颜色和革兰氏染色反应），分别绘制单菌及混菌的染色结果。2. 实验作业（1）你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？（2）进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题？3. 实验心得实验三微生物大小的测定一、实验目的1. 学习并掌握使用显微测微尺测定微生物大小的方法；2. 掌握对酵母菌细胞大小测定的方法和基本要求，增强对酵母细胞大小的感性认识。二、实验原理微生物细胞的大小是
11、微生物的形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一。其测量工具一般为目镜测微尺和镜台测微尺。镜台测微尺是中央部分刻有标准刻度尺的载玻片，其尺度总长为1mm，精确分为10个大格，每个大格又分为10个小格，共100小格，每一小格长度为0.01mm，即10m。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每格的相对长度。目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，一般有等分为50小格和100小格两种。测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显微放大后的细胞物象。由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格在不同条件下所代表的实际长度也不一样
12、。因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞的实际大小。 镜台测微尺中央部分及镜台测微尺校正目镜测微尺三、实验器材1. 菌种及装片葡萄酒干酵母、酿酒酵母的染色玻片标本。2. 仪器和其他用品镜台测微尺，目镜测微尺，普通光学显微镜，擦镜纸等。四、实验步骤1. 目镜测微尺的安装取出接目镜，把目镜上的透镜旋下，将目镜测微尺刻度朝下放在目镜镜筒内的隔板上，然后旋上目镜透镜，再将目镜插回镜筒内。双目显微镜的左目镜通常配有屈光度调节环，不能被取下，因此使
13、用双目显微镜时目镜测微尺一般都安装在右目镜中。2. 校正目镜测微尺将镜台测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上。先用低倍镜观察，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央，调节焦距，当清晰地看到镜台测微尺的刻度后，转动目镜使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行。利用推进器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，然后分别数出两重合线之间镜台测微尺和目镜测微尺所占的小格数。用同样的方法换成高倍镜和油镜进行校正，分别测出在高倍镜和油镜下，两重合线之间两尺分别所占的格数。由于已知镜台测微尺每格长10 m，根据下列公式即可分别计算出在不同放大倍数下，目镜测微尺每格所代表的长度。目镜测微尺每小格长度（m）
14、=两对重合线间镜台测微尺格数10两对重合线间目镜测微尺格数3. 菌体大小的测定目镜测微尺校正完毕后，取下镜台测微尺，换上酵母菌制片和酵母菌染色装片。先用低倍镜找到标本后，换高倍镜测定酵母的宽度和长度。测定时，通过转动目镜测微尺和移动载玻片，测出酵母菌直径或宽和长所占目镜测微尺的格数。最后将所测得的格数乘以目镜测微尺每格所代表的长度，即为该菌的实际大小。值得注意的是，同一种群中的不同酵母细胞之间也存在个体差异，因此在测定每一种细胞的大小时应至少随机选择10个细胞进行测量，然后计算平均值。4. 测定完毕测量完毕后取出目镜测微尺，将目镜放回镜筒，再将目镜测微尺和镜台测微尺分别用擦镜纸擦拭干净，放回盒
15、内保存。注意事项1. 目镜测微尺很轻、很薄，在取放时应特别注意防止使其跌落而损坏。2. 观察时光线不宜过强，否则难以找到镜台测微尺的刻度；换高倍镜和油镜校正时，务必十分细心，防止物镜压坏镜台测微尺和损坏镜头。五、实验结果1结果（1）将目镜测微尺校正结果填入下表目镜测微尺校正结果物镜物镜倍数目镜测微尺格数镜台测微尺格数目镜测微尺每格代表的长度/m低倍镜高倍镜油镜菌体大小测定记录12345678910平均值m葡萄酒干酵母酿酒酵母装片2. 思考题在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一细菌的大小时，其测定结果是否相同？为什么？六、心得体会实验四 显微镜直接计数一、实验目的1明确血
16、细胞计数板计数的原理。2掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。二、实验原理显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。对雪球技术板进行介绍：用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。血球计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短槽隔成两半，每一边的平台上各自刻有一个方格网，每个方格网共分为九个大格，中间的大方格即为计数室。血细胞计数板构造如下图。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格；另一种是一个大方
17、格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为1mm，则每一个大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均数，再乘上25或16，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。三、实验器材1菌种 酿酒酵母2器材 血细胞计数平板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管等四、实验步骤1菌悬液制备：以无菌生理盐水将酿酒酵母制成浓度适当的菌悬液。2镜检计数室：在加样前，先对计数板的计数室进行镜
18、检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数。3加样品：将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，一般计数室均能充满菌液。4显微镜计数：加样后静止5min，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。若计数区是由16个中方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个中方格（即100小格）的菌数；如果是25个中方格组成的计数区，除数上述四个中方格外，还需数中央l个中方格的菌数（即80个小格）；如菌体位于中方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左
19、线不数右线，以减少误差；如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量。1625型血细胞计数板的计算公式：2516型血细胞计数板的计算公式：5清洗血细胞计数板：使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头上用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。五、实验报告1实验结果酵母菌细胞数的测定（课后第一题）2.思考题根据你的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差、力求准确？六、心得体会实验五 培养基的制备、
20、分装与灭菌 一、实验目的1. 了解并掌握培养基的配制、分装方法 2. 掌握各种实验室灭菌方法及技术3. 掌握微生物实验中常用器具的灭菌方法二、实验原理1. 培养基配置的原理培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。2. 灭菌原理灭菌的原理就是使蛋白质和核酸等生物大分子发生变性，从而达到灭菌的作用，实
21、验室中最常用的就是干热灭菌和湿热灭菌。干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160170），时间长（12h）。但干热灭菌温度不能超过180。否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，
22、从而使沸点增高，得到高于100的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。 在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大，三是湿热的蒸气有潜热存在。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。三、实验器材1. 试剂 牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，1mol/LNaOH, 1mol/LHCl 2. 仪器 电热干燥箱、手提式高压灭菌锅等3.其他器具 培养皿，培养皿，试管，吸管，天平，牛角匙， pH试纸(pH 5.59.0)，棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等四、操作步骤1
23、. 首先按牛肉膏蛋白胨培养基的配方称取各个药品配制培养基。2. 介绍高压蒸汽灭菌锅和热风干燥箱的构造及使用时注意事项。3. 对配置的培养基进行高压蒸汽灭菌具体过程如下：(1) 首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。(2) 放回内层锅，并装入待灭菌物品（培养基等）。注意不要装得太挤，以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果，三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透人棉塞。(3) 加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺拴，使螺栓松紧一致，勿使漏气。(4) 用电护或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内
24、的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上徘气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所得压力时，控制热源，维持压力至所需时间。(5) 灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。4. 将灭好的培养基放进五十度的干燥箱中冷却以备到平板使用。五、实验报告1. 实验思考题高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽?灭菌完毕后，为什么待压力降至“0”时才能打开排气阀，开盖取物?六、实验心得体会实验六 水中细菌总数的测定【课前提问】1.自来水作为饮用水对细菌总数有什么要求？2.细菌总数的测定采用什么
25、方法？细菌总数单位的意义？【目的要求】1学习水样的采取方法和水样细菌总数的测定方法。2了解平板菌落计数的原则。【基本原理】在食品卫生学指标中，细菌菌落总数也称杂菌总数，杂菌总数的多少表示食品的新鲜程度和被污染的程度。饮用水中的细菌总数是指1mL水样在普通营养琼脂培养基中，在37，培养24h，所生长的菌落总数。本实验应用平板菌落计数技术测定样品中细菌总数。它常用于测定水、食品、发酵制品等中的活菌数。由于该方法采用倾注法，容易造成人为的误差（如稀释过程、培养基温度的控制等）。另外，由于水中细菌种类繁多，每种细菌都有它一定的生理要求（如对氧、培养温度、培养pH等），很难实现一种条件下，使水中所有的细
26、菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落来计算水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基完成实验。【实验用品】1. 实验样品 根据需要选择自来水、池水、湖水等；2. 培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基；3. 仪器和其他用品 生理盐水或无菌水，培养箱，无菌操作台，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管，灭菌三角烧瓶，试管架等。 【方法步骤】1水样的采取1）自来水：先将自来水龙头用火焰烧灼3分钟灭菌，再开放水龙头使水流5min后，用灭菌三角烧瓶接取水样，快速进行分析。2）池水、河水或湖水：应取距水面1015cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向
27、下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。2细菌总数测定1）自来水 用灭菌吸管吸取1mL水样，注入灭菌培养皿中。共做两个平皿。 分别倾注约15mL已溶化并冷却到45左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，并立即在桌上作平面旋摇，使水样与培养基充分混匀。 另取一空的灭菌培养皿，倾注牛肉膏蛋白胨琼脂培养基15mL，作空白对照。 培养基凝固后，于37温箱中，倒置培养24小时，进行菌落计数。两个平板的平均菌落数即为1mL水样的细菌总数。2）池水、河水或湖水等 稀释水样：取3个灭菌空试管，分别加入9mL生理盐水。取1mL水样注入第一管
28、9mL灭菌水内，摇匀；再自第一管取1mL至下一管灭菌水内；如此稀释到第三管。稀释度分别为10-1、10-2与10-3。稀释倍数看水样污浊程度而定，以培养后平板的菌落数在30300个之间的稀释度最为合适，若三个稀释度的菌数均多到无法计数或少到无法计数，则需继续稀释或减小稀释倍数。一般中等污秽水样，取10-1、10-2、10-3三个连续稀释度，污秽严重的取10-2、10-3、10-4三个连续稀释度。 自最后三个稀释度的试管中各取1mL稀释水加入空的灭菌培养皿中，每一稀释度做两个培养皿。 各培养皿倾注15mL已溶化并冷却至45左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，立即放在桌上摇匀。 凝固后于37培养箱中倒置
29、培养24小时。3菌落计数方法1）先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个培养皿有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的培养皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到培养皿的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全培养皿的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。2）首先选择平均菌落数在30300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细菌总数（见表6-1，例1）。3）若有两个稀释度的平均菌落数均在30300之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应采取两者的平均数；若大于2，则取其中
30、较小的菌落总数（见表，例2及例3）。表6-1 菌落总数计算方法及报告方式举例例次不同稀释度的平均菌落数两个稀释度菌落数之比菌落总数/（CFUmL-1）备注10-110-210-311 3651642016 400或1.6104两位以后的数字采取四舍五入的方法22 760295461.637 750或3.810432 890271602.227 100或2.71044无法计数1 650513513 000或5.1105527115270或2.71026无法计数3051230 500或3.11044）若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数（见表9-1，例4）
31、。5）若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数（见表9-1，例5）。6）若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数（见表9-1，例6）。【注意事项】1. 取样时应注意避免人为因素造成的污染。2. 培养基倾注前的温度，不能过高或过低，过高容易将所检测样品中微生物烧死，过低则培养基部分凝固，难以和水样混匀。3. 菌落计数的时候可采用计数器划块计数（参考图9-1）。【实验报告】1实验结果（1）自来水表9-2 自来水中菌落总数平板菌落数1mL自来水中细菌总数12（2）池水、河水或湖水等表9-3 池水、河水或湖水中的细菌
32、总数稀释度10-110-210-3平板121212菌落数平均菌落数计算方法细菌总数/(cfu/mL)2思考题1）从自来水的细菌总数检测结果来看，是否合乎饮用水的标准中细菌总数的要求？2）你所测的水源水的污秽程度如何？实验七 水中大肠菌群的测定【课前预习】1. 典型的大肠杆菌群菌落特征是什么？2. 食品中大肠菌群数测定的意义是什么？【目的要求】1. 学习和掌握大肠菌群的测定方法；2. 了解测定过程中每一步的反应原理。【基本原理】大肠菌群是一群能在37培养48h内发酵乳糖产酸、产气的需氧或兼氧革兰氏染色阴性无芽抱杆菌。以大肠杆菌为主，包括肠细菌属、柠檬酸细菌属、埃希氏菌属和克雷伯氏菌属等。大肠菌群
33、数可用来判断水源或食品被粪便污染的可能性和程度。因为大肠菌群在肠道和粪便中数量非常高，且与肠道和粪便中的病原菌生活习性相近，抗逆能力稍强，在数量上两者具有一定相关性，且大肠菌群易于培养和检测，所以非常适合用来作为判断样品是否被人、畜粪便污染的标志，间接反映水源或食品中消化道传染病源菌的数量。 大肠菌群的测定方法一般采用多管发酵法，此法是根据大肠菌群具有发酵乳糖产酸产气的特性，利用含乳糖的培养基培养不同稀释度的样品，经初发酵、平板分离和复发酵3个检测步骤，最后根据结果查最大自然数表，算出食品中的大肠菌群数。【实验用品】1. 被检样品根据不同需要选择检测样品（如自来水、酱油、食醋、酸乳、啤酒等）。
34、2. 培养基乳糖蛋白胨发酵培养基，伊红美蓝固体培养基，乳糖发酵培养基。3. 试剂革兰氏染色液，芽孢染色液。4. 其它显微镜，天平，培养箱，水浴锅，研钵，平皿，德氏管，刻度吸管，涂布器等。【方法步骤】1. 初发酵试验在三倍浓缩乳糖培养基中加入稀释度为10-1、10-2、10-3的被检样品10mL（如大肠菌群超出检测限量，则可取更高的稀释度），每个稀释度各5个重复，混匀置37培养24h。2. 平板分离培养24h后如不产酸（乳糖发酵液变黄色）、产气（小指管底部有气泡）和不变浑浊者为阴性反应，产酸产气或仅产酸的乳糖发酵管为阳性反应，将阳性反应画线接种于伊红美蓝平板上，37培养24h。在伊红美蓝平板上大
35、肠菌群的典型菌落为深紫黑色，具有金属光泽，或者紫黑色，不带或略带金属，或者淡紫红色，中心较深的菌落。将带有上述典型特征的菌落做革兰氏染色镜检。3. 复发酵试验将上述革兰氏染色镜检为阴性无芽孢杆菌的菌落接种到乳糖蛋白胨培养基中，37培养24h。如仍为产酸、产气者为大肠菌群阳性。4. 结果计算根据3个稀释度中的阳性管数组成一个数量指标，查表10-1计算。【实验结果】1. 将实验测出的各样品大肠菌群数以报表方式报告结果。2. 对样品大肠菌落数作出是否符合卫生要求的结论。【实验报告】1. 在进行食品中大肠杆菌群数的测定时，为什么要进行复发酵试验？2. 典型的大肠杆菌群菌落特征是什么，食品中大肠菌群数测
36、定的意义是什么？实验八 实验室环境和人体表面微生物的检查【课前预习】1. 微生物的五大共性；2. 细菌、霉菌的菌落特征；3. 微生物的接种方法。【目的要求】1. 证明实验室环境与人体表面存在大量微生物；2. 体会无菌操作的重要性。【基本原理】 牛肉膏蛋白胨培养基含有细菌等微生物生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种到培养基上，适温培养后，如果有微生物存在，则12天内会形成肉眼可见的菌落，而且与样品中的微生物种类和数量有直接关系。因此，可通过平板培养来检查不同来源的样品中微生物的数量和类型，并初步观察各类微生物的菌落特征。【实验用品】1. 培养基牛肉膏蛋白胨培养基。2. 仪器 恒温培养箱
37、，无菌操作台，高压蒸汽灭菌锅3. 其他用品 无菌水，灭菌棉签，接种环，酒精灯，试管架，记号笔【方法步骤】1. 写标签。班级、姓名、日期、样品来源，用记号笔写于培养皿底部。2. 取样、接种。1）空气。在实验室工作台上打开培养基平板皿盖，接触空气十分钟，盖好皿盖。2）实验台面。从试管中取出灭菌棉签，在无菌水中润湿，于实验室工作台上涂擦，范围约4cm2，然后用棉签在培养基平板上划线。3）手指。用自己的右手食指在培养基平板上不同区域轻轻接触34次。4）头发。取自己的头发一根，在培养基平板上紧密接触34次。5）咳嗽。打开培养基平板皿盖，正对平板咳嗽3次，距离在20 cm左右。6）鼻腔。从试管中取出灭菌棉
38、签，在无菌水中润湿，然后接触自己的鼻腔，用棉签在培养基平板上划线。以上步骤均按无菌操作的要求进行。3. 培养。37培养箱，皿底向上，培养12天。4. 观察。对培养好的平板分别进行观察并纪录。 【实验结果】1. 菌落计数：统计各平板的菌落数；2. 观察不同的菌落类型：大小、颜色、形态、高度、干湿情况、透明程度、边缘。【注意事项】1. 接种过程要注意样品与培养基的接触，不要因为未接触上而出现空平板。2. 样品与培养基的接触不要过重，以免造成平板破损。3. 接种过程必须按无菌操作的要求进行，以保证实验结果的可信度。【实验报告】 表2-1 菌落计数结果样品空气实验台面手指头发咳嗽鼻腔菌落数表2-2 菌
39、落的特征菌落特征大小颜色形态高度干湿情况透明程度边缘菌落类型1234【思考题】1）为什么实验室环境和体表存在一定数量的微生物？2）实验操作的过程为什么要按无菌操作的要求进行？实验九 牛乳的巴氏消毒、细菌学检查及酸乳的制作一、实验目的 1、了解牛乳的消毒和细菌学检查的重要性和质量判断标准2、学习牛乳的巴氏消毒和细菌学检查方法3、学习乳酸发酵和制作酸乳的方法 二、实验原理 巴氏消毒：在较低温度下85，杀死牛乳中的病原体，但不破坏牛奶的营养成分。标准平板计数法：平板计数法美兰还原酶实验：细菌数量与氧化还原电位相关酸乳：乳酸菌发酵乳糖产生乳酸使蛋白质凝固。三、实验器材1、菌种市售酸乳中的菌种 2、培养
40、基和牛乳样品乳酸菌培养基、紫红胆汁琼脂、鲜牛奶、蔗糖、市售酸乳。 3、仪器及其他用品恒温水溶锅、酸度计、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、培养箱、酸乳瓶(200-280ml)、培养皿、试管、无菌吸管、10ul微量加样器。 四、 实验步骤 1、标准平板计数细菌数按前述平板计数法操作进行牛乳或酸乳中细菌总数检查。2、牛奶的巴氏消毒及乳酸的制作 （1 ）将市售奶粉30g加到250ml的三角瓶中，同时加入 5蔗糖和70ml蒸馏水，或用市售牛奶100ml加5g蔗糖，充分混合，用无菌封口膜封好三角瓶。（2）将三角瓶于 80-85灭菌10-15min，乳要完全浸于80水中，不时摇动，保持15min后，取出用冷水冲
41、其外壁迅速冷却至 35-40，作为制作饮料的培养基质。 （3）开启封口膜，以5%-10%接种量将市售鲜酸乳加入三角瓶。接种后摇匀，封号封口膜。（4）把接种后的酸乳瓶置于40-42恒温箱中培养6-8h。培养时注意观察，在出现凝乳后停止培养。然后转入 4-5的低温下冷藏 24h以上。经此后熟阶段，达到酸乳酸度适中(pH 4-4.5)，凝块均匀致密，无乳清析出，无气泡，获得较好的口感和特有风味。 4 以品尝为标被评定酸乳质量 五、实验结果1、根据标准平板计数法计算牛乳中的细菌数。2、将你制作的酸乳和市售酸乳进行比较。（从凝块状态、表层光洁度、口感、有无异味、pH等）实验十 固定化酵母发酵产啤酒一、实
42、验目的（1）了解固定化细胞技术的方法和意义;（2）了解酵母发酵产生啤酒主要生产过程和发酵工艺，并认识固定化酵母发酵产啤酒的优点二、实验原理发酵利用酵母将麦芽汁中的小分子量物质发酵产生酒精，由于采用原料及工艺不同发酵成啤酒。将生物酶或细胞固定在一定的基质上，从而提供酶或细胞的利用效率；固定化技术生产啤酒可使固定化细胞能重复使用；发酵后菌体与发酵液易于分离；后处理工艺简单，成本低；可连续发酵,过程自动化；传统发酵法酵母细胞发酵一次即弃去菌体包埋法固定化技术的一种;将微生物细胞均匀的包埋在水不溶性载体的紧密结构中,细胞不易漏出;制定固定化细胞时,细胞和载体不起任何反应,细胞处于最佳生理状态;固定化细
43、胞有载体为屏障,可避免外界不利因素的影响;三、实验材料:1、菌种啤酒酵母;2、培养基及原理:150ml麦芽汁(8%10%)/250ml三角瓶，麦芽汁培养基、酒花、耐高温淀粉酶、糖化酶3、溶液和试剂:2.5%海藻酸钠溶液,灭菌;1.5% CaCl2,灭菌;0.025mol/L碘液，乳酸或磷酸4、仪器和其他用品搪瓷盘或玻璃容器，纱布，无菌封口膜，糖度计，水浴锅，三角瓶四、实验步骤1、麦芽汁的制备2、菌体培养将啤酒酵母接种于新鲜麦芽汁琼脂培养基斜面培养24h，从斜面接种于30ml麦芽汁的三角瓶中28，100r/min培养24h;3、细胞固定化将上述培养液于4000r/min离心20min，沉淀物中加入10ml生理盐水10ml，将冷却至302.5%海藻酸钠溶液与上述酵母悬液混匀，用无菌滴管缓慢而稳定的加入1.5%CaCl2 溶液,边滴加边搅拌,即可得到直径约3mm左右的凝胶珠;钙化30min;用无菌生理盐水洗涤2次。4、固定化细胞发酵啤酒取20g固定化酵母加到含50mL发酵培养基（麦芽汁）28培养24小时倒出发酵液，即完成固定化酵母第一次发酵产啤酒；再将麦芽汁加入经发酵过的固定化酵母中，进行第二次发酵，收集发酵液，还可重复发酵几次，合并发酵液。用加酒花的麦芽汁进行上述固定化发酵。五、实验报告对固定化发酵啤酒进行品尝，并与市售比较。六、实验心得。
