1、.谷氨酸的简介谷氨酸的简介 谷氨酸，是一种酸性氨基酸。分子内含两个羧基，化学名称为-氨基戊二酸。谷氨酸是里索逊1856年发现的，为无色晶体，有鲜味，微溶于水，而溶于盐酸溶液，等电点3.22。大量存在于谷类蛋白质中，动物脑中含量也较多。谷氨酸在生物体内的蛋白质代谢过程中占重要地位，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应。.一、发酵前准备二、发酵阶段三、清洗仪器四、实验总结谷氨酸发酵及工艺流程谷氨酸发酵及工艺流程.一、发酵前准备一、发酵前准备 一级种的培养一级种的培养 二级种的培养二级种的培养 发酵培养基的配置发酵培养基的配置 试剂的配置试剂的配置 仪器设备的准备仪器设备的准备.一级种的培养一
2、级种的培养 菌种:谷氨酸产生菌BL-115 培养基的配置：按下列培养基配方配1000ml一级种子培养基。按20%装液量分装后，于121灭菌30min冷却备用。葡萄糖2.5%、尿素0.5%、硫酸镁0.04%、磷酸氢二钾0.1%、玉米浆2.5-3.5%、磷酸亚铁、硫酸锰各20ppm、pH7.0 一级种子培养：将斜面菌种接入已灭菌冷却的一级种子培养基中（250ml三角瓶内接入12环）于321、250r.p.m条件下培养12h。一级种子质量要求：种龄12h；pH6.40.1；光密度：净增O.D值0.5以上；无菌检查阴性，噬菌体检查无。.二级种的培养二级种的培养 菌种:一级种 培养基的配置：按下列培养基
3、配方配制1000ml二级种子培养基，并按20%装液量分装于三角瓶中后，于121灭菌30min冷却备用。葡萄糖2.5%、玉米浆2.5-3.5、K2HPO4 0.15%、MgSO4 0.04、尿素0.4%、FeSO4 2ppm、MnSO4 2PPm、pH6.87.0 二级种子培养：在已灭菌的二级种子培养基中，按0.5-1.0%接入上述以培养好的一级种子，于321、250r.p.m条件下培养7-8h，二级种子质量要求：种龄7-8h、pH6.87.2、OD值净增0.5左右 无菌检查：噬菌体无、残糖消耗1%左右 镜检：生长旺盛，排列整齐，G+.发酵培养基的制备 发酵培养基：按下列培养基配方制发酵培养基，
4、并按70%装液量装于小型发酵罐中，离位灭菌，121实罐灭菌20min，冷却备用。葡萄糖10%，玉米浆0.1-0.15%，Na2HPO4 0.17%，KCL 0.12%，MgSO4 0.04%，用NaOH溶液调pH7.20于110灭菌20min冷却备用。流加试剂:将40%尿素溶液、1%水解糖液、4%水解糖液分别装入流加瓶中,12115min备用.试剂的制备 甲液：称取15g硫酸铜与0.05g亚甲基蓝于1000mL容量瓶中，加蒸馏水定溶至刻度线处 乙液：称取50g酒石酸钾钠，75g氢氧化钠，4g亚铁氰化钾至1000mL容量瓶中，加蒸馏水定溶至刻度线 革兰氏染色：结晶紫、碘液，95%乙醇、番红 仪器
5、准备 仪器设备：摇床、显微镜、仪器设备：摇床、显微镜、751751型分光光度计、型分光光度计、5L5L发酵罐、空压机、革兰氏染液、发酵罐、空压机、革兰氏染液、PHPH计、离心机、计、离心机、药物天平药物天平.二、发酵阶段二、发酵阶段 发酵生产操作发酵生产操作:发酵液冷却至发酵液冷却至4040左右时，通过蠕左右时，通过蠕动泵加第一次尿素，添加量为动泵加第一次尿素，添加量为0.810.81。0%0%。接种将前次实验制备的二级种子接种将前次实验制备的二级种子8-10%8-10%的接种量接的接种量接入发酵罐。于入发酵罐。于353511、250r.p.m250r.p.m条件下培养条件下培养35h35h
6、发酵过程的控制发酵过程的控制:温度控制温度控制pHpH控制控制糖液流加糖液流加.温度控制 谷氨酸发夹012h为长菌期，最适温度在3032，发酵12小时后进入产酸期，控制3436。由于发酵期代谢活跃，发酵罐要注意冷却，防止温度过高引起发酵迟缓。pHpH控制控制发酵过程中产物的积累导致pH下降，而氮源的流加导致pH的升高，发酵中当pH值进行控制既8h前pH7.0-7.6；8h后pH7.2-7.3，,20-24h期间pH7.0-7.1,24-35h期间pH6.5-6.6.尿素流加总量为4%糖液流加糖液流加从第10h开始每隔4h补糖一次，每次补入1%的水解糖液，在发酵26h前补入4%的水解糖液。.发酵
7、过程中，需注意完成下列工作发酵过程中，需注意完成下列工作注意发酵罐运转是否正常，检查各控制参数是否在适合的范围内，遇注意发酵罐运转是否正常，检查各控制参数是否在适合的范围内，遇有故障及时排除。有故障及时排除。每两小时取样一次，每次取样每两小时取样一次，每次取样80ml，取样时，用量筒准确取流出的，取样时，用量筒准确取流出的培养液培养液80ml，对号倒入三角瓶中，封口，来不及测定的样液要立即，对号倒入三角瓶中，封口，来不及测定的样液要立即放入冰箱保存放入冰箱保存每每2小时记录发酵过程温度、小时记录发酵过程温度、pH、OD、通风、转速的测定数值，并、通风、转速的测定数值，并记录操作情况。记录操作情
8、况。OD值测定方法：均匀取样值测定方法：均匀取样5ml于编号试管中，用空白发酵液稀释至于编号试管中，用空白发酵液稀释至一定浓度，在一定浓度，在722分光光度计上测定分光光度计上测定A600，根据菌体浓度与吸光度之，根据菌体浓度与吸光度之间关系的标准曲线换算出菌体浓度；其余发酵于间关系的标准曲线换算出菌体浓度；其余发酵于2000r/min条件下离条件下离心分离心分离10min，上清夜入编号三角瓶，用于测糖，上清夜入编号三角瓶，用于测糖还原糖测定：用菲林快速定糖法。还原糖测定：用菲林快速定糖法。菌体形态观察：革兰氏染色，油镜观察菌形、革兰氏染色结果以及有菌体形态观察：革兰氏染色，油镜观察菌形、革兰
9、氏染色结果以及有无杂菌污染无杂菌污染.清洗仪器清洗仪器 放罐：到放罐标准后，及时放罐。经过发酵约35h后，后残糖在1%以下且糖耗缓慢或残糖0.5%，菌量增长（OD）值缓慢时，便可放罐，放罐操作同取样。排放液需灭菌处理才可进入下水道 清洗：放罐后，将发酵罐清洗干净，关闭所有电源 粗提：用浓硫酸将发酵液pH调至谷氨酸的等电点（pH3.15），用等电点法进行谷氨酸的粗提。.结果分析结果分析 样液OD值变化表分析：OD值各组变化差距很大，据我所知是由于操作失误所致.茚三酮检测茚三酮检测OD值变化情况表值变化情况表分析：有个别组测的值很高，可能是操作问题所致，总体来说，谷氨酸检测的OD值偏低，不在0.20.8这一合理范围之内，失去意义OD值组别.本组镜检结果本组镜检结果第一阶段，视野中有少量菌体第二阶段，镜片有污渍，无法观察.残糖测定浓度变化表残糖测定浓度变化表分析：总趋势是残糖浓度在下降，说明有菌体在代谢，但变化趋势不明显，说明菌体浓度不高.综合分析综合分析 1、本次实验的数据与正常情况出入很大，可能是仪器操作失误所致 2、实验中后期由于显微镜镜头太脏，镜检视野无法分清是否为菌体，很难具体了解菌体的情况 3、总体来说实验不算不成功，我们茚三酮检测OD值总体来说不会变化，正常情况是逐渐上升.The end 谢谢！
