1、鲈鱼病毒性疾病病原体的检测鲈鱼病毒性疾病病原体的检测与鉴定与鉴定 淡水鲈鱼具有生长快、适应性广、抗病能力强、肉质鲜美等特点，深受人们欢迎。我国沿海均有分布，资源丰富，虽然，鲈鱼抗病能力较强，自然条件下不易患病。但人工高密度养殖因其生存环境及空间发生很大变化，稍有不慎极易造成疾病，尤其是病毒性疾病，危害极大。鲈鱼常患的病毒性疾病有：鲈鱼常患的病毒性疾病有：鲈鱼淋巴囊肿病鲈鱼淋巴囊肿病 鲈鱼病毒性出血性败血症鲈鱼病毒性出血性败血症 鲈鱼病毒性脑坏死疾病鲈鱼病毒性脑坏死疾病 鱼类淋巴囊肿病是由淋巴囊肿病毒感染引起鱼类的一种典型的皮肤和浅表组织慢性病,它是最早发现最早发现的鱼类病毒性疾病。该病的普遍症
2、状是病鱼体表长有瘤状物该病的普遍症状是病鱼体表长有瘤状物,严严重时内脏组织器官也出现病变。重时内脏组织器官也出现病变。所以以鲈鱼淋巴囊肿病鲈鱼淋巴囊肿病为例设计实验证明这一病毒为这一病害的病原体。鲈鱼淋巴囊肿病病状：鲈鱼淋巴囊肿病病状：病鱼眼睛、口腔内外、鳃及上下体表各部位有大小不一的囊肿物，囊肿物小如念珠，大如菜花，颜色有白色、粉红色和黑色，较大的囊肿物上有肉眼可见的红色小血管。患病严重的，囊肿物遍布体表，当囊肿物破裂时，会形成开放性溃面。鲈鱼轻微发病时，摄食正常、但生长缓慢；疾病严重时，病鱼基本不摄食、部分死亡。检测方法检测方法 显微和超微观察显微和超微观察 核酸扩增技术核酸扩增技术 免疫
3、检测免疫检测 显微和超微观察显微和超微观察 显微镜和生物电镜技术是研究病毒感染引起的的病理变化，观察病毒和细胞超微结构，揭示病毒与宿主细胞相互作用的技术。通过电子显微镜可以观察病变细胞的病理结构、病毒形态大小和类型以及了解病毒的感染、复制和形态发生等特征。检测步骤检测步骤 收集病体鱼与健康鱼的细胞或组织样品 （主要靶器官鱼体表皮下结缔组织、其次是鳃、体腔膜、肠、脾和头主要靶器官鱼体表皮下结缔组织、其次是鳃、体腔膜、肠、脾和头肾肾）制备石蜡切片、冷冻切片或半薄切片经荧光染料染色观察并与健康鱼同区域细胞做对比观察到的症状观察到的症状 在体表皮下结缔组织中，当大量成纤维细成纤维细胞膨大、变圆胞膨大、
4、变圆，大小为1018m时，细胞膜外未出现囊壁，少数细胞的细胞质中观察到嗜碱性物质嗜碱性物质（碱性物质通常是指具有提供电子的能力或接受碱性物质通常是指具有提供电子的能力或接受质子的能力的物质。质子的能力的物质。）；1820m的膨大细胞在细胞膜外出现囊壁，细胞质内出现嗜碱性物质；大于20m的细胞具有了淋巴囊肿细胞的典型特征。另外，在鲈鱼的鳃等部位均观察到淋巴囊肿细胞淋巴囊肿细胞，并在鲈鱼脾内观察到膨大细膨大细胞。胞。显微和超微观察显微和超微观察 核酸扩增技术核酸扩增技术 核酸杂交技术是一种分子生物学的标准技术，用于检测DNA或RNA分子的特定序列（靶序列）。PCR技术具有特异、敏感、高效、快速、简
5、便、重复性好等优点。PCR由变性退火延伸三个基本反应步骤构成。目的是：在试管中将所要研究的鲈鱼病变组织的基因或DNA片段在数小时内扩增足量的DNA，再进行分析研究和检测鉴定。目前已成功进行了鱼类细胞淋巴囊肿病毒的检测。间接荧光法间接荧光法该方法分为两步：获取单克隆抗体、间接荧光法的检测和鉴定该方法分为两步：获取单克隆抗体、间接荧光法的检测和鉴定l 获取单克隆抗体的步骤：获取单克隆抗体的步骤：（1）抗原制备）抗原制备 1.取病体鱼的病变细胞或组织取病体鱼的病变细胞或组织 2.将样品制成组织匀浆，反复冻融三次，选择适当转速进行差速离心将样品制成组织匀浆，反复冻融三次，选择适当转速进行差速离心 或密
6、度梯度离心的方法进行纯化或密度梯度离心的方法进行纯化 3.进行灭活处理进行灭活处理（2）将待测抗原注射到小鼠体内（免疫动物）；）将待测抗原注射到小鼠体内（免疫动物）；（3）免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备、细胞融合；）免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备、细胞融合；（5）杂交瘤细胞的选择培养、筛选；）杂交瘤细胞的选择培养、筛选；（7）杂交瘤细胞的克隆化及单克隆抗体的大量制备。）杂交瘤细胞的克隆化及单克隆抗体的大量制备。间接法（又称荧光间接法（又称荧光抗体法）的步骤抗体法）的步骤（1）制作病体鱼的组织切片并固定）制作病体鱼的组织切片并固定（2）第一步，用已知未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原（待检）第一步，用已知未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原（待检标本）标本上，在湿盒中标本）标本上，在湿盒中37保温保温30min，使抗原抗体充分结合。洗，使抗原抗体充分结合。洗涤，除去未结合的抗体。涤，除去未结合的抗体。（3）加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗）加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM 抗体（通常为荧光标抗体（通常为荧光标记的对应二抗）。如果第一步发生了抗原抗体反应，标记的荧光标记记的对应二抗）。如果第一步发生了抗原抗体反应，标记的荧光标记二抗就会和已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定被检测抗原。二抗就会和已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定被检测抗原。
