1、第二节第二节体内样品分析的前处理体内样品分析的前处理 体内样品预处理的目的体内样品预处理的目的1常用体内样品预处理方法常用体内样品预处理方法 2p 前处理前处理(分离分离,浓集浓集,改性改性)为药物的测定提供条件为药物的测定提供条件p 前处理是体内药物分析过程中重要且繁复的工作前处理是体内药物分析过程中重要且繁复的工作 仪器污染仪器污染,劣化劣化(去蛋白去蛋白)提高测定灵敏度提高测定灵敏度/选择性选择性化学改性化学改性(衍生化衍生化)血浆蛋白结合物血浆蛋白结合物;缀合物缀合物使待测药物使待测药物/代谢物代谢物释放释放测定药物测定药物/代谢物代谢物总浓度总浓度 一、体内样品前处理的目的一、体内样
2、品前处理的目的样品介质组成复杂样品介质组成复杂:分离分离待测组分浓度低待测组分浓度低:浓集浓集 前处理前处理二、二、体内样品前处理的方法体内样品前处理的方法 去除蛋白质法去除蛋白质法 分离与浓集法分离与浓集法 缀合物水解法缀合物水解法 (一一)(二二)(三三)化学衍生化法化学衍生化法 (四四)(一一)去除蛋白质法去除蛋白质法l加入与水混加入与水混溶的有机溶剂溶的有机溶剂,蛋白析出蛋白析出药药物释放物释放l乙腈乙腈,甲醇甲醇,丙酮丙酮,四氢呋四氢呋喃等喃等 l血浆血浆/血清与血清与有机溶剂的体有机溶剂的体积比积比1 (2-3)l饱和硫酸铵饱和硫酸铵,硫酸钠硫酸钠,硫酸镁硫酸镁,氯化钠等氯化钠等l
3、血清与饱和血清与饱和硫酸铵溶液的硫酸铵溶液的比比1 2 l10%三氯醋三氯醋酸或酸或6%高氯高氯酸溶液酸溶液l血清与强酸血清与强酸的比的比1 0.6l上清液呈强上清液呈强酸性酸性(pH4)l酸性分解的酸性分解的药物不宜用药物不宜用 l热变性蛋白热变性蛋白质沉淀质沉淀l通常通常90l方法简单方法简单l只能除去热只能除去热变性蛋白变性蛋白l待测物热稳待测物热稳定性好定性好 1.溶剂沉淀法溶剂沉淀法 2.中性盐析法中性盐析法 3.强酸沉淀法强酸沉淀法 4.热凝固法热凝固法(二二)分离与浓集法分离与浓集法液相萃取法液相萃取法固相萃取法固相萃取法 超滤法超滤法1.2.3.(二二)分离与浓集法分离与浓集法
4、液相萃取法液相萃取法固相萃取法固相萃取法 超滤法超滤法1.2.3.1.液相萃取法液相萃取法溶剂的选择原则溶剂的选择原则溶剂的用量溶剂的用量 水相的水相的pH(1)(2)(3)提取操作提取操作(4)(1)溶剂的选取原则溶剂的选取原则对药物分子未电离形式可溶对药物分子未电离形式可溶,对电离形式不溶；对电离形式不溶；沸点低沸点低,易挥发易挥发;与水不相混溶与水不相混溶;无毒无毒,不易燃烧不易燃烧;具有化学稳定和惰性具有化学稳定和惰性;不影响紫外检测不影响紫外检测 溶剂紫外截止波长(nm)沸点()极性增加正己烷21069环己烷21081甲苯285111异丙醚*22068乙醚*22035醋酸戊酯2851
5、49三氯甲烷24561甲基异丁基酮230116醋酸乙酯26077正丁醇215118*:含过氧化物；含过氧化物；:肝脏毒性肝脏毒性,有致癌作用有致癌作用 辅助试剂的使用辅助试剂的使用 乙醚乙醚(1.2%水水):氯化钠氯化钠混合溶剂的使用混合溶剂的使用 正己烷正己烷-异丙醇异丙醇(95:5)(2)溶剂的用量溶剂的用量l 有机相与水相有机相与水相(样品样品)体积比为体积比为1:15:1l碱性药物碱性药物pH高于高于pKa 12单位单位l酸性药物酸性药物pH低于低于pKa 12单位单位l 碱性下提取碱性下提取,可减少内源性物质可减少内源性物质(酸性酸性)的干扰的干扰l 碱性下不稳定碱性下不稳定,在中性
6、用三氯甲烷和异丙醇提取在中性用三氯甲烷和异丙醇提取(3)水相的水相的pHl提取提取1 1次次l 若提取回收率较低若提取回收率较低(低于低于50%),提取提取23次次l 脂溶性干扰物脂溶性干扰物,可进行小体积水溶液反提取可进行小体积水溶液反提取(4)提取操作提取操作 2.固相萃取法固相萃取法固相萃取法的原理固相萃取法的原理 固相萃取法操作步骤固相萃取法操作步骤 注意事项注意事项(1)(2)(3)固相萃取法的特点固相萃取法的特点(4)自动化固相萃取自动化固相萃取(5)(1)固相萃取法的原理固相萃取法的原理含药物体内样品通过小柱时含药物体内样品通过小柱时,受到受到“吸附吸附”,“分配分配”,“离子交
7、换离子交换”或其它亲和力或其它亲和力作用作用,药物及内源性物质同时被保留在固定相药物及内源性物质同时被保留在固定相(填料填料)洗脱方式有两种洗脱方式有两种:冲洗溶剂洗去干扰物冲洗溶剂洗去干扰物,再用对药物再用对药物亲和力更强的溶剂洗脱药物亲和力更强的溶剂洗脱药物;药物直接被洗脱药物直接被洗脱,干扰物保留干扰物保留(2)固相萃取法操作步骤固相萃取法操作步骤l 第第1步步:甲醇润湿小柱甲醇润湿小柱,活化填料活化填料;净化填料净化填料l 第第2步步:水水/缓冲液冲洗小柱缓冲液冲洗小柱,去除甲醇去除甲醇;甲醇含量甲醇含量 过低过低(低于低于5%)致致C18链弯曲折叠链弯曲折叠,回收率降低回收率降低l
8、第第3步步:加样加样,使样品通过小柱使样品通过小柱,并弃去滤过液并弃去滤过液l 第第4步步:水水/缓冲液冲洗缓冲液冲洗 小柱小柱,去除内源性及其去除内源性及其 它干扰物质它干扰物质l第第5步步:洗脱溶剂洗脱洗脱溶剂洗脱 待测物待测物,收集洗脱液收集洗脱液,平衡平衡(3)注意事项注意事项l 样品样品(血浆血浆)通过萃取柱的流速在通过萃取柱的流速在 1-2ml/min;l 冲洗液和洗脱剂的强度与用量适当冲洗液和洗脱剂的强度与用量适当,否则导致药物损失否则导致药物损失/选择性下降选择性下降,通常选用可与水混溶的洗脱剂通常选用可与水混溶的洗脱剂;l 萃取碱性药物时萃取碱性药物时,洗脱剂中常加酸洗脱剂中
9、常加酸,有机胺有机胺,氨水氨水,醋酸铵或离子对试剂醋酸铵或离子对试剂(4)自动化自动化固相萃取法固相萃取法l对于单个样品处理对于单个样品处理,SPE操作省时操作省时l对于大量样品的处理对于大量样品的处理l半自动半自动SPE:萃取过程机械化萃取过程机械化l全自动化仪器全自动化仪器:通过柱切换技术通过柱切换技术 实现固相萃取与实现固相萃取与HPLC联用联用柱切换柱切换:固相萃取固相萃取-LC/MS/MS(5)自动化自动化固相萃取法固相萃取法3.超滤超滤法法l ultrafiltration是一种膜分离技术是一种膜分离技术l 按照截留分子量按照截留分子量,选择半透膜选择半透膜,可分离可分离30 10
10、00kD的可溶性生物大分子的可溶性生物大分子l 无化学试剂无化学试剂,无相变化无相变化提取操作提取操作(4)l 简便简便,游离药物分析的首游离药物分析的首选方法选方法;尤其适合尤其适合TDM(三三)水解法水解法l 简便简便,快速快速l 水解过程中水解过程中发生药物分解发生药物分解l 专一性较差专一性较差l 葡萄糖醛酸苷葡萄糖醛酸苷酶或酶或/和硫酸酯酶和硫酸酯酶l 专属性强专属性强l 时间较长时间较长l 可引入粘蛋白可引入粘蛋白l 溶剂萃取过溶剂萃取过程中缀合物程中缀合物(尤尤其硫酸酯其硫酸酯)直接直接分解分解l 测定尿药总量测定尿药总量,水解缀合物水解缀合物l 趋向于直接测定缀合物趋向于直接测
11、定缀合物 1.酸水解法酸水解法2.酶水解法酶水解法 3.溶剂解法溶剂解法(四四)化学衍生化法化学衍生化法1.在在GC中的应用中的应用(1)硅烷化硅烷化:三甲基硅烷(TMCS)(2)酰化酰化:三氟乙酸酐(TFAA)(3)烷基化烷基化:碘庚烷(C7H15I)(4)不对称衍生化不对称衍生化:(S)-N-三氟 乙酰脯氨酰氯(ST-FPC)2.在在HPLC中的应用中的应用(1)衍生化的分类衍生化的分类 柱前/柱后;在线/离线(2)衍生化方法衍生化方法 (1)紫外衍生化 (2)荧光衍生化 (3)非对映体衍生化l GC:提高药物的挥发性提高药物的挥发性;增加药物的增加药物的 稳定性稳定性;生成非对映异构体生成非对映异构体l HPLC:提高检测灵敏度提高检测灵敏度;改善色谱分离改善色谱分离 容量容量分析法分析法
