1、时间分辨荧光光谱在生物、时间分辨荧光光谱在生物、化学中的应用化学中的应用主主 要要 内内 容容q荧光原理及时间分辨荧光光谱的实现荧光原理及时间分辨荧光光谱的实现q时间分辨荧光光谱在生命科学中的应用举例时间分辨荧光光谱在生命科学中的应用举例q时间分辨荧光光谱在化学中的应用举例时间分辨荧光光谱在化学中的应用举例s0120s1s2Fluorescence（荧光）（荧光）转动转动碰撞碰撞Intensity1/eTimeI(t)=I0 e-t/分子能级图分子能级图:荧光寿命荧光寿命Z方向偏振的激发光：方向偏振的激发光：h 荧光荧光Anisotropy(各向异性）定义各向异性）定义I II +2Ir=h
2、时间推移时间推移各向异性值各向异性值 r 0各向异性值变化快慢反映了周围环境对发光分子的作用各向异性值变化快慢反映了周围环境对发光分子的作用h 时间相关单光时间相关单光子计数方法子计数方法(TCSPC)时间分辨荧光技术的实现时间分辨荧光技术的实现 时间相关单光子计数技术时间相关单光子计数技术 频闪观测技术频闪观测技术 超快成像技术超快成像技术 频率上转换技术频率上转换技术 相调制技术相调制技术 稳态荧光光谱稳态荧光光谱 时间分辨荧光光谱时间分辨荧光光谱皮秒、飞秒激光器皮秒、飞秒激光器有很大的发展有很大的发展高速响应的探高速响应的探测器的问世测器的问世众多荧光探针众多荧光探针分子的出现分子的出现
3、最近最近2020年年时间分辨荧光光谱广泛应用于生物、化学领域时间分辨荧光光谱广泛应用于生物、化学领域q DNA和和RNA的排序和空间结构的排序和空间结构q 蛋白质的一级、二级和三级结构蛋白质的一级、二级和三级结构q DNA与蛋白质间的相互作用与蛋白质间的相互作用q 蛋白质与蛋白质间的相互作用蛋白质与蛋白质间的相互作用q 动态跟踪许多生理过程动态跟踪许多生理过程时间分辨荧光光谱在生命科学中应用时间分辨荧光光谱在生命科学中应用 应用时间分辨荧光检测手段对应用时间分辨荧光检测手段对DNA进行测序进行测序Anal.Chem.1998,70,4771第一步：用以下四种荧光探针分子分别对低聚核苷酸进行标记
4、第一步：用以下四种荧光探针分子分别对低聚核苷酸进行标记(Cy5-ddCTP,MR200-1-ddGtp,JA169-ddTTP,JA242-ddATP)Cy5MR200-1JA169JA242T G T A A A A C G G C C A G TA C A T T T T G C C G G T C A?353 ddNTP?第二步：合成被测第二步：合成被测DNA链的互补链链的互补链DNA聚合酶聚合酶被检测的被检测的DNA模板模板标记后的引物标记后的引物带碱基带碱基A,C，T，G的核苷酸的核苷酸特定的双脱氧特定的双脱氧核苷核苷ddNTP第三步：测序第三步：测序结合结合TCSPC的测序装置的测
5、序装置最后得到测序结果最后得到测序结果CGT 应用时间分辨荧光研究应用时间分辨荧光研究DNAProtein 间的相互作用间的相互作用Biochemistry 1991,37,1513Klenow fragment(Eschericia coli DNA聚合酶聚合酶片断片断)与与DNA间的相互作用间的相互作用 fluorescent probe聚合位聚合位核酸外切位核酸外切位时间分辨荧光各向异性衰减曲线时间分辨荧光各向异性衰减曲线r(t)=fe(t)re(t)+fb(t)rb(t)rb(t)responds to buried statere(t)responds to exposed stat
6、eQADLLaserObjectivez(QA)z(DL)SamplePolychromatorBeam SplitterDichroic MirrorNipkow Disk 应用皮秒级荧光寿命成像谱对活细胞内大分子状态的鉴定应用皮秒级荧光寿命成像谱对活细胞内大分子状态的鉴定K.Kemnitz http:/www.europhoton.de多通道时间空间多通道时间空间相关单光子计数相关单光子计数（TSCSPC）显）显微成像装置微成像装置ethidium bromide 在活细胞中状态在活细胞中状态22 ns1.8 ns时间分辨荧光光谱在化学中应用举例时间分辨荧光光谱在化学中应用举例激发态动力学
7、信息对于光物理、光化学及激发态动力学信息对于光物理、光化学及光生物学过程的理解起到重要作用光生物学过程的理解起到重要作用Journal of Photochemistry and photobiology A:Chemistry 132(2000)99 Powder Particle size(nm)355 nm excitation Life time(ns)a PT101 63.8 0.03 0.63 105b 0.04 0.63 148c 0.08 0.63NS51 220 0.43 0.64 NS9O 3000 1.6 0.7 a Resolution is about 0.03 ns
8、.b Heat treated at 800 C for 2 h.c Heat treated at 900 C for 2 h.金红石荧光衰减曲线的拟合金红石荧光衰减曲线的拟合 I=I0t1 exp(t/)Intensity/a.u.Time/ns分散于溶液中的分散于溶液中的TiO2在在Fe3+加入前后的荧光衰减加入前后的荧光衰减分散于溶液中的分散于溶液中的TiO2在在Fe3+加入前后发射光子数加入前后发射光子数(a)Without Fe3+(b)With Fe3+在在Fe3+溶液中溶液中TiO2光催化水氧化的反应机理光催化水氧化的反应机理DL systemQA system 时间分辨荧光寿命谱对时间分辨荧光寿命谱对Hairpin Ribozyme(RNA)三级结构的分析三级结构的分析荧光标记的荧光标记的ribozyme(核黄素核黄素)的示意图的示意图34 78 Z方向偏振的激发光：方向偏振的激发光：h 荧光荧光Anisotropy(各向异性）定义各向异性）定义I II +2Ir=各向异性值变化快慢这过程反映了各向异性值变化快慢这过程反映了周围环境对发光分子的作用周围环境对发光分子的作用时间推移时间推移各向异性值各向异性值 r 0激发态分子偶极距的空间分布：激发态分子偶极距的空间分布：h
