1、第五章动物性食品中致病微生物和寄生虫的检验检疫提提 纲纲概述概述一一动物性食品中菌落总数与大肠菌群的检验动物性食品中菌落总数与大肠菌群的检验二二动物性食品中致病性细菌的检验动物性食品中致病性细菌的检验三三四四动物性食品中致病性寄生虫的检验动物性食品中致病性寄生虫的检验五五动物性食品中致病性病毒的检验动物性食品中致病性病毒的检验第一节 概述一.概述食源性食源性疾病：疾病：是指通过摄食而进入人体的有毒有害物质（包括生物性病原体）等致病因子所造成的疾病。根据国家食源性疾病监测网部分资料的分析结果，我国食源性疾病的高危食品依次为肉类、粮食、海产品、水果蔬菜、鸡蛋、豆类、奶。其中因微生物污染引起的食源性
2、疾病比例接近40%，远高于化学性食物中毒（20%）。纵观国内外食源性疾病的发病情况，动物性食品中微生物污染是人类食源性疾病的主要问题。第二节 动物性食品中菌落总数与大肠菌群的检验动物性食品中微生物污染的可能途径1.食品原料本身的污染2.养殖环境中的微生物的污染3.屠宰过程中的污染4.深加工过程的污染5.出厂、储存、运输、销售过程中的污染6.厨房中生熟食品的交叉污染微生物微生物非细胞生非细胞生物物病毒病毒细胞生物细胞生物原核生物原核生物细菌细菌真核生物真核生物酵母菌、霉菌酵母菌、霉菌食品中微食品微生物检测所涉及到的类群食品微生物检测所涉及到的类群微生物检测程序样品的采集样品的采集1.所用接触样品
3、的用具经过灭菌。2.取样要均匀、特殊样品要控制温度。3.样品采好后要贴上标签样品的微生物检验样品的微生物检验1.采好的样品送检不要超过3h。2.报告的填写微生物对食品的污染问题是我国乃至全世界食品安全中最突出的问题，我国为此数次颁布食品微生物检验标准。按照食品安全国家标准要求，菌落总数和大肠菌群是食品企业出厂时必检的微生物指标。一.菌落总数菌落总数：菌落总数：一定培养条件下（如需氧状况、培养基成分、PH、培养温度和时间等），每克（每毫升）食物样品中所生长出来的细菌菌落总数。检测菌落总数，可以判定食品被细菌污染程度，反映出食品的新鲜程度和卫生状况。如果某食品的菌落总数严重超标，说明其产品的卫生状
4、况达不到基本的卫生要求，食品将加速腐败变质，失去食用价值。菌落总数的测定方法：菌落总数的测定方法：37培养48 h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数。菌落总数的检验程序涂板，培养，菌落计数每个培养皿中加适量（1520ml）营养琼脂选择23个适宜稀释度，各取1ml分别加入灭菌培养皿中作几个适当倍数的稀释液，（如1:100,1:1000）25g(ml)样品+225ml生理盐水（1:10的稀释液）注意事项1.无菌操作。2.操作时间越短越好。3.样品不同，选择的稀释倍数不同。4.培养基冷却温度不宜过高或过低。二.大肠菌群大肠菌群系：大肠菌群系：一群能发酵乳糖、产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴
5、性无芽孢杆菌，这些细菌可来自人和温血动物的肠道。食品大肠菌群数的计算方法：食品大肠菌群数的计算方法：100ml（g）检样中大肠菌群最大可能数。大肠菌群数的高低，表明食品和粪便污染有关的细菌污染的程度。如果某食品的大肠菌群超标，则可推测其产品中存在着肠道致病菌污染的可能性，食用之可能导致食物中毒或罹患流行病。第三节 动物性食品中致病性细菌的检验1.沙门氏菌2.致病性大肠杆菌3.副溶血弧菌4.金黄色葡萄球菌5.溶血性链球菌6.产单核细胞李斯特菌7.肉毒梭菌8.结核分枝杆菌9.空肠弯曲杆菌10.炭疽杆菌11.产气荚膜梭菌12.蜡样芽孢杆菌13.变形杆菌一.沙门氏菌沙门氏菌属是一群符合肠杆菌科定义并与
6、其血清学相关的革兰氏阴性、需氧性、无芽孢杆菌。本菌属种类繁多，抗原结构复杂，现已发现2000多个血清型，我国已经血清型近200个（一）沙门氏菌属简介沙门氏菌流行特征沙门氏菌流行特征1.突然发病2.潜伏期短3.发病者仅限于进食污染食物者4.食物常被同义传染源污染5.以家庭发生和食堂爆发常见6.在畜群发生后，一般呈散发性或地方性流行1.前增菌：前增菌：使食物样品在含有营养的非选择性培养基中增菌，使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状态。2.选择性增菌：选择性增菌：在含选择性抑制剂的促生长培养基中间，样品进一步增菌的一个步骤。此培养基允许沙门氏菌持续增值，同时阻止大多数其他细菌的增殖。3.选择性平
7、板分离：选择性平板分离：进一步采用固体选择性培养基，抑制非沙门氏菌的生长，提供肉眼可见的疑似沙门氏纯菌落的识别。4.生物化学筛选：生物化学筛选：排除大多数非沙门氏菌。也提供沙门氏菌培养物菌属的初步鉴定。5.血清学技术提供培养物菌种的鉴定血清学技术提供培养物菌种的鉴定。（二）沙门氏菌的检测1.形态特征与培养特征革兰氏阴性，大小为1-30.4-0.9m的两端钝圆的短杆菌，无芽孢，一般无荚膜，除鸡沙门氏菌和雏沙门氏菌以外，都有周身鞭毛，运动力强A.需氧或兼性厌氧，10-42都可生长，最适温度37，最适pH值6.8-7.8B.琼脂营养平板：上生长良好，圆形，表面光滑，无色半透明2-3mm的菌落。C.血
8、平板上：中等大小的灰白色菌落2.生化特性生化特性a.发酵葡萄糖产酸产气。b.能发酵麦芽糖、阿拉伯糖、鼠李糖、甘露醇和山梨醇。c.不发酵乳糖、蔗糖。d.不产生吲哚。e.不水解尿素。2.生化特性生化特性a.发酵葡萄糖产酸产气。b.能发酵麦芽糖、阿拉伯糖、鼠李糖、甘露醇和山梨醇。c.不发酵乳糖、蔗糖。d.不产生吲哚。e.不水解尿素。3.免疫学鉴定免疫学鉴定沙门氏菌属的抗原沙门氏菌属的抗原菌体抗原（O抗原）表面抗原（K抗原）：Vi抗原和M抗原鞭毛抗原（H抗原）纤毛抗原4.底物检测法鉴定底物检测法鉴定沙门氏菌产生辛酯酶，能分解底物4-甲基伞形酮辛酯（Mucap），形成游离的4-甲基伞形酮，在365nm的
9、紫外光照射下能发出很强的荧光。5.分子生物学检测方法分子生物学检测方法A.PCR检测法（关键在于靶基因的选择）B.核酸探针。（三）食品中沙门氏菌污染的控制1.加强食品卫生管理，防止污染2.控制繁殖（低温储存食物）3.杀灭病原菌（食物要煮熟煮透，生熟食品严格分开）二.致病性大肠杆菌肠道正常菌群的主要成员，一旦食品中检测出大肠杆菌，即意味着这些物品直接或间接地被粪便污染。水土不服是一个俗称，指由于不适应当地环境而出现的各种身心不适，并不是一个专门的医学术语。30多年前西方医学家发现，那些从发达地区前往发展中地区旅游或工作的人，有40-60%都会闹肚子，并把这种旅行期间或旅行后出现的，每天3次及以上
10、未成形粪，或未成形粪次数不定但伴有发热、腹痛、恶心呕吐及便中带血等症状的情况，命之名为旅行者腹泻(Travelersdiarrhea，TD)。TD是感染性腹泻的一种特殊类型。细菌是导致成人旅行者腹泻的罪魁祸首，其中肠产毒性大肠杆菌(ETEC)最常见，世界范围内大概有一半的旅行者腹泻病例由此种细菌引起，紧随其后病原菌的还有ETEC的近亲肠侵袭性大肠杆菌(EAEC)以及其他细菌。（一）病原特性A.大肠杆菌O抗原有171种，K抗原103种，H抗原60种，因此形成许多种不同的血清型。B.一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有致病性。C.一些大肠杆菌正常情况下不致病，且对机体有利，但当机体抵抗力下降或大肠
11、杆菌入侵肠外组织或器官时，可硬气唱到尾感染。（二）致病性大肠杆菌的检测1.形态与培养特性鉴定形态与培养特性鉴定a.革兰氏阴性杆菌。b.普通培养基上生长良好，圆形，表面光滑，2-3mm的乳白色菌落。2.生化反应生化反应a.发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、木糖、阿拉伯糖。b.不水解尿酸。3.免疫学鉴定免疫学鉴定利用ELISA方法，检测O、K、H、F4种抗原4.分子生物学检测方法分子生物学检测方法A.PCR检测法（关键在于靶基因的选择）B.核酸探针。三.金黄色葡萄球菌广泛分布于环境、空气、水、牛奶、水、食品、污水、人和动物中。构成人体皮肤、鼻腔、咽部等处的正常细菌群，对人有致病性，是临床医学中常见的化脓
12、性球菌之一，也是污染食品造成失误中毒的细菌之一。1.形态特征与培养特征革兰氏阳性，直径为0.5-1.0m，各菌体的大小及排列比较整齐。在脓汁或液体培养基中生长，常呈双球或短链排列。无鞭毛，不能自由移动，无荚膜，不产生芽孢。A.需氧或兼性厌氧，最适温度37，最适pH值7.4B.琼脂营养平板：圆形、表面光滑、不透明的菌落，直径1-2。C.耐盐性强，能在10-15%氯化钠培养基中能生长。D.普通肉汤培养基中生长迅速。E.血琼脂平板上有色素产生。产生溶血毒素，从而形成溶血环。抵抗力抵抗力：较强，在干燥的脓汁中能存活数月。有些菌株需要80加热30-60分钟才能杀死。在5%石碳酸中15min死亡。致病性致
13、病性：所产生的多种胞外蛋白质对人和动物组织有害。A.各种酶类各种酶类(酯酶、蛋白酶、耐热DNA酶等)；B.各种毒素各种毒素(溶血素、溶白细胞素、肠毒素、化脓性毒素)机体抵抗力下降或受伤时，可引起局部或全身炎症，败血症、脓毒血症。污染食品后可能产生大量的肠毒素，是该菌引起食物中毒的主要因素。肠毒素的稳定性肠毒素的稳定性：极强的稳定性。只有在小于pH2的条件下蛋白酶才能使其失去活性。相当耐热，经煮沸30分钟后，仍不能完全破坏其毒性。四.结核分枝杆菌直或弯的杆菌，有分枝生长的趋势，可呈丝状或菌丝状生长。1.形态特征与培养特征革兰氏阳性。有时可见分枝，呈单、成堆、或成束排列，无鞭毛，无芽孢，有荚膜。A
14、.专性需氧菌，最适温度37，最适pH值6.5-6.8B.营养要求高，在含有蛋黄、马铃薯、甘油和天门冬素等的培养基上才能生长。C.固体培养基菌落：坚硬、表面呈颗粒状、乳酪色或淡黄色，形似菜花样。2.2.生化特性生化特性A.生化不活泼。B.不发酵糖类C.多数菌株触酶阳性，热触酶阴性；非结核分枝杆菌大多数两种试验均呈阳性。食品中结核分枝杆菌污染的控制1.早期发现，严格隔离，彻底治疗2.对畜禽采取综合性防疫措施，加强检疫，隔离，防止疾病传播给人，淘汰阳性畜禽，培养将抗畜禽群。第四节 动物性食品中致病性病毒的检验口蹄疫病毒流行性感冒病毒禽流感病毒猪瘟病毒新城疫病毒马立克氏病病毒朊病毒冠状病毒一.口蹄疫病
15、毒是牛、猪、羊等偶蹄动物口蹄疫的病原。是全球性最重要的动物健康问题之一。是最早发现的动物病毒1.生物学特性二十面体，直径20-25nm，无囊膜，病毒基因组为单股正链RNA。在宿主细胞质内形成晶格状排列2.抵抗力对酸敏感，pH5.0时每秒钟灭活90%，pH5.0时瞬间灭活。对碱敏感，但是对消毒剂的抵抗力较强。在低温下能长期保存。灭活温度为851min，7010min，6015min3.抗原性有7个主型：A、O、C、南非I、南非II、南非III和亚洲I型。各型之间没有相互免疫作用。本病毒有较大的变异性，病毒在保存和流行中，常发生血清学的变异，有时流行初期与末期毒型不一致，几乎每年都有新的亚型出现。
16、4.培养特性（1）组织培养：利用犊牛、幼猪的肾脏或豚鼠、牛胚胎上皮组织制成细胞单层来培养病毒。（2）鸡胚培养：不易在鸡胚上生长，必须反复交替通过牛与鸡胚或在添有牛舌上皮的鸡胚组织培养继代后，才能适应于鸡胚培养。5.致病性（1）自然条件下，主要发生于偶蹄兽。（2）传播途径：呼吸道、消化道（被污染的饲料、饮水）、创伤（皮肤、粘膜）。（3）流行特点：有一定的季节性（冬春发病多，夏季可以平息），传播迅速，一般沿交通线进行传播。6.微生物学诊断（1）豚鼠接种试验：选择500g以上健康豚鼠4-6只，剪去后肢足掌部被毛，将足掌部皮肤划破，把感染性病料涂擦与划破处，如第二天局部有水疱，即可确诊。（2）乳鼠接种
17、试验：选2-7日龄乳鼠5只，4只做检样，1只做对照，每只颈部皮下接种0.1ml，观察1周，及时取出，制备1:3检样，传代。如无死鼠取活鼠冻死传代，传2-3代不死亡为阴性。二.禽流感病毒禽流感是野生鸟类和家禽感染了一种甲型流感病毒，引起体温升高，打喷嚏，头部水肿，呼吸困难，腹泻等症状。1.生物学特性直径为80-120nm，内有一直径为70nm的电子致密核心。核酸为单股负链RNA，甲、乙型流感病毒为8个节段，丙型为7个节段，每一个节段就是一个基因，决定流感病毒的遗传特性。2.抵抗力灭活温度为5630min，6010min，65-70 15min对紫外线敏感。在阳光直射下40-48h即失活。3.传播
18、途径飞沫经呼吸道传播接触传播：口、粘膜、破损皮肤。经口传播：污染物、粪便。3.实验室检查（1）病毒分离采用鼻咽拭子、气管/肺泡灌洗液、含漱液采集样品。采用鸡胚或敏感细胞系培养病毒分离后需经过核酸检测（2）核酸检测常用技术：RT-PCR、NASBA等目的基因：H5(HA1、HA0)、NP、NS等（3）抗体检测抗体：抗体：抗血凝素（HA）抗体、抗H5特异性抗体、抗神经氨酸酶（NP）抗体等方法：方法：免疫荧光技术、ELISA、血凝抑制试验。意义：意义：检测病毒特异性抗体。（4）抗原检测病原学检测需要有两个实验室平行检测，可与其他具有一定条件的实验室协同。禽流感疫情的确认要由国家情流感参考实验室（哈尔滨兽医研究所）检测鉴定
