1、第十二章第十二章 表观遗传学表观遗传学1ppt课件课件2ppt课件课件表观遗传学表观遗传学(epigeneticepigenetic)：DNADNA的序列不发生变化的序列不发生变化、基因表达改变、并且这、基因表达改变、并且这种改变可稳定遗传。种改变可稳定遗传。表观遗传学研究的内容：表观遗传学研究的内容：1.1.基因选择性转录、表达的调控。基因选择性转录、表达的调控。2.2.基因转录后调控。基因转录后调控。3ppt课件课件表观遗传修饰从多个水平上调控基因表达：表观遗传修饰从多个水平上调控基因表达：1.1.DNADNA水平：水平：DNADNA甲基化甲基化2.2.蛋白质水平：组蛋白修饰蛋白质水平：组
2、蛋白修饰3.3.染色质水平：染色质重塑染色质水平：染色质重塑4.4.RNARNA水平：水平：miRNAmiRNA、RNARNA干扰干扰4ppt课件课件表观遗传学的研究意义：表观遗传学的研究意义：1.1.表观遗传学补充了表观遗传学补充了“中心法则中心法则”所忽略的两个问所忽略的两个问题，即哪些因素决定了基因的正常转录和翻译以及题，即哪些因素决定了基因的正常转录和翻译以及核酸并不是存储遗传信息的唯一载体。核酸并不是存储遗传信息的唯一载体。2.2.表观遗传信息可以通过控制基因的表达时间、空表观遗传信息可以通过控制基因的表达时间、空间和方式来调控各种生理反应。所以许多用间和方式来调控各种生理反应。所以
3、许多用DNADNA序序列不能解释的现象都能够找到答案。列不能解释的现象都能够找到答案。5ppt课件课件 1 1、DNADNA甲基化甲基化(DNA(DNA methylationmethylation)DNA DNA甲基化是目前研究得最清楚、也是最重甲基化是目前研究得最清楚、也是最重要的表观遗传修饰形式。通过甲基供体要的表观遗传修饰形式。通过甲基供体S-S-腺苷甲硫氨酸，并在腺苷甲硫氨酸，并在DNADNA甲基转移酶甲基转移酶(DNA(DNA methyltransferasemethyltransferase，DNMT)DNMT)的催化下，的催化下，CpGCpG二核苷酸中的胞嘧啶环上二核苷酸中的
4、胞嘧啶环上55位置的氢被活位置的氢被活性甲基所取代，从而转变成性甲基所取代，从而转变成5-5-甲基胞嘧啶甲基胞嘧啶(5-mC)(5-mC)。6ppt课件课件胞嘧啶甲基化反应胞嘧啶甲基化反应 7ppt课件课件 DNA复制酶复制酶CH3CH3CH3CH3DNA甲基甲基转移酶转移酶CH3CH3CH3CH3DNA复制后甲基化型的维持复制后甲基化型的维持 8ppt课件课件CpG岛（岛（CpG island）9ppt课件课件10ppt课件课件 DNADNA甲基化甲基化基因沉默基因沉默(gene silence)(gene silence)非甲基化非甲基化(non-(non-methylationmethy
5、lation)基因活化基因活化(gene activation)(gene activation)去甲基化去甲基化(demethylationdemethylation)沉默基因的重沉默基因的重新激活（新激活（reactivationreactivation）11ppt课件课件DNADNA高甲基化：基因启动子区的高甲基化：基因启动子区的CpGCpG岛在正岛在正常状态下一般是非甲基化的，当发生甲基常状态下一般是非甲基化的，当发生甲基化时，基因转录沉寂，使一些重要基因如化时，基因转录沉寂，使一些重要基因如抑癌基因、抑癌基因、DNADNA修复基因等丧失功能，从而修复基因等丧失功能，从而导致正常细胞的
6、生长分化调控失常以及导致正常细胞的生长分化调控失常以及DNADNA损伤不能被及时修复，这与多种肿瘤形成损伤不能被及时修复，这与多种肿瘤形成密切相关。密切相关。12ppt课件课件DNADNA低甲基化：整个基因组普遍低甲基化，低甲基化：整个基因组普遍低甲基化，这种广泛的低甲基化会造成基因的不稳这种广泛的低甲基化会造成基因的不稳定，这与多种肿瘤的发生有关。定，这与多种肿瘤的发生有关。DNADNA的低甲基化也可能在异常组蛋白修饰的低甲基化也可能在异常组蛋白修饰的协同下引起某些的协同下引起某些T T细胞基因的异常活化、细胞基因的异常活化、导致自身免疫性疾病的发生。导致自身免疫性疾病的发生。13ppt课件
7、课件 DNA DNA以染色质的形式存在，染色质通常由以染色质的形式存在，染色质通常由DNADNA、组蛋白、非组蛋白以及少量组蛋白、非组蛋白以及少量RNARNA包装而成，其中包装而成，其中组蛋白是染色质的基本结构蛋白。组蛋白是染色质的基本结构蛋白。组蛋白的组蛋白的N-N-末端可通过共价作用从而发生乙末端可通过共价作用从而发生乙酰化、甲基化、泛素化以及磷酸化等翻译后的酰化、甲基化、泛素化以及磷酸化等翻译后的修饰，这些修饰的信息构成了丰富的组蛋白密修饰，这些修饰的信息构成了丰富的组蛋白密码，其中乙酰化和甲基化是最为重要的修饰方码，其中乙酰化和甲基化是最为重要的修饰方式。式。14ppt课件课件组蛋白的
8、不同修饰组蛋白的不同修饰15ppt课件课件组蛋白乙酰化：组蛋白乙酰化：组蛋白乙酰化是由组蛋组蛋白乙酰化是由组蛋白乙酰基转移酶白乙酰基转移酶(HAT)(HAT)和和组蛋白去乙酰基酶组蛋白去乙酰基酶(HDAC)(HDAC)协调催化完成，修饰的协调催化完成，修饰的部位一般位于部位一般位于N-N-末端保末端保守的赖氨酸残基上。组守的赖氨酸残基上。组蛋白乙酰化是一个可逆蛋白乙酰化是一个可逆的动力学过程，可以调的动力学过程，可以调节基因的转录。节基因的转录。16ppt课件课件组蛋白甲基化：组蛋白甲基化：组蛋白甲基化多发生于组蛋白组蛋白甲基化多发生于组蛋白H3H3、H4H4的的赖氨酸和精氨酸残基上，由特异的
9、组蛋白赖氨酸赖氨酸和精氨酸残基上，由特异的组蛋白赖氨酸甲基转移酶甲基转移酶(histonehistone methyltransferasemethyltransferase,HMT),HMT)催化完成，也是一个可调控的动态修饰过程。而催化完成，也是一个可调控的动态修饰过程。而组蛋白的去甲基化是由赖氨酸去甲基酶组蛋白的去甲基化是由赖氨酸去甲基酶(lysine-(lysine-specific specific demethylasedemethylase 1,LSD1)1,LSD1)催化完成。催化完成。17ppt课件课件组蛋白的其他修饰：组蛋白的其他修饰：组蛋白泛素化由组蛋白泛素化由E1E1、
10、E2E2、E3E3级联酶催化修饰级联酶催化修饰，也是一个可逆的动力学过程。，也是一个可逆的动力学过程。所有组蛋白的组分均能磷酸化。所有组蛋白的组分均能磷酸化。组蛋白的各种修饰不是相互独立的，而是互组蛋白的各种修饰不是相互独立的，而是互相联系的，例如相联系的，例如H3-Serl0H3-Serl0的磷酸化可以促进的磷酸化可以促进H3-K14H3-K14乙酰化，而乙酰化，而H3-K9H3-K9的甲基化则会阻止的甲基化则会阻止H3-Serl0H3-Serl0的磷酸的磷酸化。化。18ppt课件课件染色质重塑染色质重塑染色质重塑 染色质重塑是指染色质位置、结染色质重塑是指染色质位置、结构的变化，主要包括紧
11、缩的染色质在核小构的变化，主要包括紧缩的染色质在核小体连接处发生松动造成染色质的解压缩，体连接处发生松动造成染色质的解压缩，从而暴露了基因转录启动子区中的顺式作从而暴露了基因转录启动子区中的顺式作用元件，为反式作用因子的结合提供了可用元件，为反式作用因子的结合提供了可能。能。19ppt课件课件染色质重塑与基因转录染色质重塑与基因转录20ppt课件课件 动态的染色质重塑过程是大多数以动态的染色质重塑过程是大多数以DNADNA为为模板的生物学过程的基础，如基因的转录、模板的生物学过程的基础，如基因的转录、DNADNA的复制与修复等等，而这些生物学过程的混乱都的复制与修复等等，而这些生物学过程的混乱
12、都与疾病的发生、发展直接相关，因此染色质重塑与疾病的发生、发展直接相关，因此染色质重塑不仅能够调节基因的转录，同时还参与了与疾病不仅能够调节基因的转录，同时还参与了与疾病发生密切相关的那些基础细胞生理过程。但是不发生密切相关的那些基础细胞生理过程。但是不同的染色质重塑能够导致不同的疾病，又提示我同的染色质重塑能够导致不同的疾病，又提示我们这些生理过程并不是独立的起作用。们这些生理过程并不是独立的起作用。21ppt课件课件 功能性非编码功能性非编码RNARNA在表观遗传修饰中在表观遗传修饰中发挥极其重要的作用。发挥极其重要的作用。ncRNAncRNA按照大小可分为按照大小可分为两类：长链非编码两
13、类：长链非编码RNARNA和短链非编码和短链非编码RNARNA。长链非编码长链非编码RNARNA在基因簇乃至于整个染在基因簇乃至于整个染色体水平上发挥顺式调节作用，短链色体水平上发挥顺式调节作用，短链RNARNA在基在基因组水平对基因的表达进行调控。因组水平对基因的表达进行调控。22ppt课件课件 长链非编码长链非编码RNARNA X X染色体的失活就是长链染色体的失活就是长链ncRNAncRNA所介导的甲所介导的甲基化和组蛋白修饰共同参与的一个复杂的过程。基化和组蛋白修饰共同参与的一个复杂的过程。x x染色体上的失活基因编码出相应染色体上的失活基因编码出相应RNARNA，这些，这些RNARN
14、A包包裹在裹在x x染色体上，达到某一水平后，在甲基化和组染色体上，达到某一水平后，在甲基化和组蛋白修饰的参与下共同导致并维持蛋白修饰的参与下共同导致并维持x x染色体的失活。染色体的失活。此外长链此外长链ncRNAncRNA常在基因组中建立单等位常在基因组中建立单等位基因表达模式，在核糖核蛋白复合物中充当催化基因表达模式，在核糖核蛋白复合物中充当催化中心，对染色质结构的改变发挥着重要的作用。中心，对染色质结构的改变发挥着重要的作用。23ppt课件课件 短链非编码短链非编码RNARNA 短链非编码短链非编码RNA(RNA(又又称小称小RNA)RNA)能够介导能够介导mRNAmRNA的的降解，诱
15、导染色质结构的降解，诱导染色质结构的改变，决定着细胞的分化改变，决定着细胞的分化命运，还对外源的核酸序命运，还对外源的核酸序列有降解作用以保护本身列有降解作用以保护本身的基因组。的基因组。短链非编码短链非编码RNARNA的表达与功能的表达与功能24ppt课件课件 真核生物真核生物mRNAmRNA编码区同源的外源双链编码区同源的外源双链RNA(DoubleRNA(Double Strand RNA,Strand RNA,dsRNAdsRNA)能特异地诱导能特异地诱导其同源其同源mRNAmRNA的降解，导致相应基因的沉默，这一的降解，导致相应基因的沉默，这一现 象 被 称 为现 象 被 称 为 R
16、 N AR N A 干 扰，干 扰，R N A iR N A i 依 赖 于 小 干 扰依 赖 于 小 干 扰RNA(SmallRNA(Small Interference RNA,Interference RNA,siRNAsiRNA)与靶序列与靶序列之间严格的碱基配对，具有很强的特异性。之间严格的碱基配对，具有很强的特异性。25ppt课件课件 真核生物体内另一真核生物体内另一类重要的非编码类重要的非编码RNARNA就是就是miRNAmiRNA。miRNAmiRNA是一类长约为是一类长约为2123nt2123nt的单链的单链RNARNA分子，广分子，广泛存在于从植物、线虫到人泛存在于从植物、
17、线虫到人类的细胞中。类的细胞中。miRNAmiRNA的生成与功能的生成与功能26ppt课件课件 表观遗传修饰从多个水平上调控基因表观遗传修饰从多个水平上调控基因表达，而不同水平的调控之间也是相互关联的，表达，而不同水平的调控之间也是相互关联的，任何一方面的异常都可能影响到其他水平的表任何一方面的异常都可能影响到其他水平的表观遗传修饰。事实上不同水平的表观遗传修饰观遗传修饰。事实上不同水平的表观遗传修饰在真核细胞中构成了一个完整的表观遗传调控在真核细胞中构成了一个完整的表观遗传调控网络。网络。27ppt课件课件 最初认为不同肿瘤细胞中的最初认为不同肿瘤细胞中的miRNAmiRNA的表达异常是缺的
18、表达异常是缺失或者突变的结果，但是一些最新研究显示失或者突变的结果，但是一些最新研究显示miRNAmiRNA的表达也的表达也会受到甲基化和其他表观遗传机制的影响。会受到甲基化和其他表观遗传机制的影响。miRNAmiRNA的表达受甲基化和其他表观遗传机制的调控的表达受甲基化和其他表观遗传机制的调控 siRNAsiRNA诱导诱导DNADNA的甲基化的甲基化 siRNAsiRNA诱导的转录水平基因沉默是通过指导基因组表诱导的转录水平基因沉默是通过指导基因组表观修饰完成的，包括指导基因组观修饰完成的，包括指导基因组DNADNA甲基化和指导组蛋白修甲基化和指导组蛋白修饰，饰，siRNAsiRNA指导的指
19、导的DNADNA甲基化具有精确特定的靶向性，在某甲基化具有精确特定的靶向性，在某种程度上与肿瘤细胞中抑癌基因特定沉默过程有关。种程度上与肿瘤细胞中抑癌基因特定沉默过程有关。28ppt课件课件 肿瘤细胞中的肿瘤细胞中的DNADNA甲基化一般表现为总甲基化一般表现为总体的低甲基化水平和特定区域的高甲基化，这些体的低甲基化水平和特定区域的高甲基化，这些变化可以同时发生在同一肿瘤组织内。基因总体变化可以同时发生在同一肿瘤组织内。基因总体甲基化水平降低导致染色体不稳定、甲基化水平降低导致染色体不稳定、DNADNA修复基修复基因、细胞周期调控基因、细胞凋亡基因相应的因、细胞周期调控基因、细胞凋亡基因相应的
20、CpGCpG岛的甲基化沉默，进而促进了肿瘤细胞的形岛的甲基化沉默，进而促进了肿瘤细胞的形成。成。29ppt课件课件肿瘤类型表观遗传修饰改变肺癌基因组水平的低甲基化、CpG岛高甲基化（p16INK4a、DAPK1、RASSF1A）、CBP基因组及染色体重组因子BRG1的缺失乳腺癌基因组水平的低甲基化、CpG岛高甲基化（BRCA1、E-cadherin、TMS1、雌激素受体）食管癌组蛋白去甲基基因JMJD2C/GASC1扩增、CpG岛高甲基化（p16INK4a、p14ARF）胃癌CpG岛高甲基化（hMLH1、E-cadherin、p14ARF、p16INK4a）肝癌基因组水平的低甲基化、CpG岛高
21、甲基化（SOCS1、GSTP1、）、癌基因的低甲基化（c-fos、c-jun、c-myc）结直肠癌基因组水平的低甲基化、CpG岛高甲基化（hMLH1、p16INK4a、RARB2、SFRP1、WRN）、miRNA高甲基化、IGF2印记作用丢失、组蛋白修饰突变（EP300和HDAC2）、单乙酰化和组蛋白H4环丙烷形式的降低肾癌基因组水平的低甲基化、CpG岛高甲基化（VHL）、IGF2印记作用丢失膀胱癌基因组水平的低甲基化、CpG岛高甲基化（p16INK4a、TPEF/HPP1）、miRNA高甲基化前列腺癌基因组水平的低甲基化、CpG岛高甲基化（GSTP1）、组蛋白甲基转移酶EZH2基因扩增；组蛋
22、白H3和H4异常修饰、癌基因的低甲基化（k-ras）卵巢癌CpG岛高甲基化（BRCA1）、微卫星DNA低甲基化神经胶质瘤CpG岛高甲基化（MGMT、EMP3和THBS1）淋巴瘤CpG岛高甲基化（p16INK4a、p73和MGMT）、单乙酰化和组蛋白H4环丙烷形式的降低白血病CpG岛高甲基化（p16INK4a、p15INK4b、EXT1和ID4、E-eadherin）、组蛋白修饰易位（CBP、MOZ、MORF、MLL1、MLL3和 NSD1）不同肿瘤中表观遗传学修饰的异常变化不同肿瘤中表观遗传学修饰的异常变化30ppt课件课件原癌基因原癌基因(oncogeneoncogene)：较低水平的原癌基
23、因对于细胞的生：较低水平的原癌基因对于细胞的生长、发育、分化和信号传导都是必需的，当发生突变或基长、发育、分化和信号传导都是必需的，当发生突变或基因异常表达时癌症就产生了。研究发现原癌基因通常在肿因异常表达时癌症就产生了。研究发现原癌基因通常在肿瘤新生物中呈现低甲基化状态。瘤新生物中呈现低甲基化状态。肿瘤抑制基因肿瘤抑制基因(tumor suppression gene)(tumor suppression gene)：肿瘤抑制基因：肿瘤抑制基因的产物能够抑制细胞的生长，失去其功能将促进细胞的转的产物能够抑制细胞的生长，失去其功能将促进细胞的转化；与原癌基因在激活方式上的不同在于肿瘤抑制基因的
24、化；与原癌基因在激活方式上的不同在于肿瘤抑制基因的激活必须有等位基因的两次突变或缺失。激活必须有等位基因的两次突变或缺失。药物：叶酸和维生素药物：叶酸和维生素B12B12都是甲基的供体，能影响甲基化的都是甲基的供体，能影响甲基化的状态，主要是对全基因组甲基化上调的影响。状态，主要是对全基因组甲基化上调的影响。环境因素：环境因素亦可影响肿瘤中基因的甲基化，从而环境因素：环境因素亦可影响肿瘤中基因的甲基化，从而间接的促进或影响肿瘤的发生。间接的促进或影响肿瘤的发生。31ppt课件课件 DNA DNA甲基化的改变可以影响一些与黏附甲基化的改变可以影响一些与黏附分子和细胞因子表达相关的基因，导致分子和
25、细胞因子表达相关的基因，导致T T细胞的细胞的自身反应性改变，因此对维持自身反应性改变，因此对维持T T细胞的功能至关细胞的功能至关重要。研究证实，没有维持重要。研究证实，没有维持DNADNA甲基化水平和模甲基化水平和模式的成熟式的成熟T T细胞，在体内、外均能发生自身反应细胞，在体内、外均能发生自身反应性，因此表观遗传的失控可以引起自身免疫性疾性，因此表观遗传的失控可以引起自身免疫性疾病。病。32ppt课件课件 DNA DNA甲基化作为哺乳动物细胞基因组修甲基化作为哺乳动物细胞基因组修饰和表达调控的后遗传方式，在细胞的衰老过程饰和表达调控的后遗传方式，在细胞的衰老过程中总体水平下降，同时又伴
26、随着某些基因的高甲中总体水平下降，同时又伴随着某些基因的高甲基化。永生化细胞基因组的甲基化水平较高，因基化。永生化细胞基因组的甲基化水平较高，因此甲基化水平过高又是肿瘤细胞的表现。目前年此甲基化水平过高又是肿瘤细胞的表现。目前年龄相关的甲基化已作为细胞生命历史的标签。龄相关的甲基化已作为细胞生命历史的标签。33ppt课件课件 心血管疾病被认为是受甲基化控制的心血管疾病被认为是受甲基化控制的人类重要疾病，对心血管疾病的人类重要疾病，对心血管疾病的DNADNA甲基化调甲基化调控机制深入研究，有利于制定心血管疾病的有控机制深入研究，有利于制定心血管疾病的有效防御策略，同时效防御策略，同时DNADNA
27、甲基化的可逆性，为采甲基化的可逆性，为采用控制饮食及其他环境手段干预心血管疾病的用控制饮食及其他环境手段干预心血管疾病的进程提供了新的方法。进程提供了新的方法。34ppt课件课件 1972 1972年年GottesmanGottesman就将外遗传这一概念引就将外遗传这一概念引入精神病遗传学研究。近些年当传统遗传研究在入精神病遗传学研究。近些年当传统遗传研究在精神疾病的研究中困难重重时，外遗传与精神疾精神疾病的研究中困难重重时，外遗传与精神疾病尤其是病尤其是DNADNA甲基化与精神分裂症的关系，引起了甲基化与精神分裂症的关系，引起了研究者的重视。虽然目前还处于假说阶段，但不研究者的重视。虽然目
28、前还处于假说阶段，但不少研究已提示少研究已提示DNADNA甲基化参与了精神分裂症的发生。甲基化参与了精神分裂症的发生。35ppt课件课件 染色质重塑复合物、组蛋白修饰染色质重塑复合物、组蛋白修饰酶的突变均与转录调控、酶的突变均与转录调控、DNADNA甲基化、甲基化、DNADNA重组、细胞周期、重组、细胞周期、DNADNA复制和修复的复制和修复的异常相关，这些异常可以引起生长发育异常相关，这些异常可以引起生长发育畸形，智力发育迟缓，甚至导致癌症。畸形，智力发育迟缓，甚至导致癌症。36ppt课件课件 染色质重塑异常引发的疾病是由于重塑复合物染色质重塑异常引发的疾病是由于重塑复合物中的关键蛋白突变导
29、致染色质重塑失败，即核小体中的关键蛋白突变导致染色质重塑失败，即核小体不能正确定位，并使不能正确定位，并使DNADNA损伤修复复合物，基础转损伤修复复合物，基础转录装置等不能接近录装置等不能接近DNADNA，影响基因的正常表达。如，影响基因的正常表达。如果突变导致抑癌基因或调节细胞周期的蛋白出现异果突变导致抑癌基因或调节细胞周期的蛋白出现异常将导致癌症的发生。乙酰化酶的突变导致正常基常将导致癌症的发生。乙酰化酶的突变导致正常基因不能表达，去乙酰化酶或一些去乙酰化酶相关蛋因不能表达，去乙酰化酶或一些去乙酰化酶相关蛋白的突变使去乙酰化酶错误募集将引发肿瘤等疾病。白的突变使去乙酰化酶错误募集将引发肿
30、瘤等疾病。37ppt课件课件 基因组印记是指来自父方和母方的等基因组印记是指来自父方和母方的等位基因在通过精子和卵子传递给子代时发生了位基因在通过精子和卵子传递给子代时发生了修饰，使带有亲代印记的等位基因具有不同的修饰，使带有亲代印记的等位基因具有不同的表达特性，这种修饰常为表达特性，这种修饰常为DNADNA甲基化修饰，也甲基化修饰，也包括组蛋白乙酰化、甲基化等修饰。包括组蛋白乙酰化、甲基化等修饰。38ppt课件课件 目前发现的印记基因大约目前发现的印记基因大约80%80%成簇，这些成簇成簇，这些成簇的基因被位于同一条链上的顺式作用位点所调控，该的基因被位于同一条链上的顺式作用位点所调控，该位
31、点被称做印记中心位点被称做印记中心(imprinting center,IC)(imprinting center,IC)。印记基因异常表达引发伴有复杂突变和表型印记基因异常表达引发伴有复杂突变和表型缺陷的多种疾病，许多印记基因对胚胎和胎儿出生后缺陷的多种疾病，许多印记基因对胚胎和胎儿出生后的生长发育调节非常重要，对行为和大脑功能也有很的生长发育调节非常重要，对行为和大脑功能也有很大影响，印记基因的异常同样可诱发癌症。大影响，印记基因的异常同样可诱发癌症。39ppt课件课件 女性有两条女性有两条X X染色体，男性只有一条染色体，男性只有一条X X染色体，为保持染色体，为保持平衡，女性一条平衡，
32、女性一条X X染色体被永久失活染色体被永久失活“剂量补偿剂量补偿”效应。效应。X X染色体随机失活是染色体随机失活是X X失活中心失活中心(X inactivation(X inactivation center,center,XicXic)调控的。调控的。X X染色体失活相关疾病多是由染色体失活相关疾病多是由X X染色体不对称失活使携染色体不对称失活使携带有突变等位基因的带有突变等位基因的X X染色体在多数细胞中具有活性所致。染色体在多数细胞中具有活性所致。40ppt课件课件 ncRNAncRNA对细胞自身稳定和发育起着重要作对细胞自身稳定和发育起着重要作用，而它们在肿瘤发生过程中的作用机制
33、正在用，而它们在肿瘤发生过程中的作用机制正在逐渐被认识。其中逐渐被认识。其中miRNAmiRNA能够调控那些与发育、能够调控那些与发育、增殖、凋亡及应激反应相关基因的表达，而且增殖、凋亡及应激反应相关基因的表达，而且它们的表达异常是人类恶性肿瘤的一个共同特它们的表达异常是人类恶性肿瘤的一个共同特征。征。41ppt课件课件 人们对于表观遗传过程的关注人们对于表观遗传过程的关注程度日益增强，以程度日益增强，以DNADNA甲基化和组蛋白修甲基化和组蛋白修饰为靶向的治疗方法也初露端倪；在表饰为靶向的治疗方法也初露端倪；在表观遗传修饰分析技术发展的基础之上，观遗传修饰分析技术发展的基础之上，我们可以进一
34、步了解表观遗传过程的机我们可以进一步了解表观遗传过程的机制并设计出针对这一过程的治疗性干预制并设计出针对这一过程的治疗性干预手段。手段。42ppt课件课件A.A.高效液相色谱柱相关方法高效液相色谱柱相关方法高效液相色谱仪结构示意图高效液相色谱仪结构示意图最明显优点在于最明显优点在于,可用于高通量混合可用于高通量混合样本的检测，能明样本的检测，能明确显示目的基因组确显示目的基因组整体甲基化的水平，整体甲基化的水平，缺点：不能定位具缺点：不能定位具体的甲基化位点。体的甲基化位点。43ppt课件课件B.B.SssISssI甲基转移酶法甲基转移酶法缺点：缺点：SssISssI甲基转移酶不稳定，结果不够
35、精确。甲基转移酶不稳定，结果不够精确。C.C.氯乙醛法氯乙醛法该法可以直接测定基因组整体的该法可以直接测定基因组整体的5mC5mC水平，水平，优点：所使用的试剂价格低廉且稳定性好，可以优点：所使用的试剂价格低廉且稳定性好，可以避免放射性污染，避免放射性污染，缺点：费时费力，且氯乙醛为有毒物质。缺点：费时费力，且氯乙醛为有毒物质。44ppt课件课件A.A.甲基化敏感性限制性内切酶甲基化敏感性限制性内切酶-PCR/Southern-PCR/Southern法法该方法是一种经典的甲基化研究方法，该方法是一种经典的甲基化研究方法，优点：可同时检测基因组内多个位点。易解释，成本低廉。优点：可同时检测基因
36、组内多个位点。易解释，成本低廉。缺点：由于缺点：由于CGCG不仅限于不仅限于CCGGCCGG序列中，因此非该序列中的序列中，因此非该序列中的CGCG将被忽略；只有检测与转录相关的关键性位点的甲基化状将被忽略；只有检测与转录相关的关键性位点的甲基化状态时，该检测方法的结果才有意义；样本量大；存在酶消态时，该检测方法的结果才有意义；样本量大；存在酶消化不完全引起假阳性的问题；不适用于混合样本。化不完全引起假阳性的问题；不适用于混合样本。45ppt课件课件B.B.直接测序法直接测序法重亚硫酸盐处理示意图重亚硫酸盐处理示意图 该方法可靠性和精确度均较高，能明该方法可靠性和精确度均较高，能明确目的片段中
37、每一个确目的片段中每一个CpGCpG位点的甲基化状态，但位点的甲基化状态，但是需要大量的克隆测序，操作过程繁琐且费用是需要大量的克隆测序，操作过程繁琐且费用昂贵。昂贵。46ppt课件课件C.C.甲基化特异性的甲基化特异性的PCRPCR法法优点：避免了使用限制性内优点：避免了使用限制性内切酶及相关问题；敏感性高，切酶及相关问题；敏感性高，可用于石蜡包埋样本。可用于石蜡包埋样本。缺点：对引物设计的要求高，缺点：对引物设计的要求高，可靠的引物需设计包含两或可靠的引物需设计包含两或多个完全甲基化或非甲基化多个完全甲基化或非甲基化位点，限制了该方法的应用；位点，限制了该方法的应用；只能作定性研究，不能作
38、定只能作定性研究，不能作定量检测；重亚硫酸盐处理不量检测；重亚硫酸盐处理不完全导致结果假阳性。完全导致结果假阳性。甲基化特异性的甲基化特异性的PCRPCR示意图示意图47ppt课件课件D.D.甲基化敏感性单核苷酸引物延伸法甲基化敏感性单核苷酸引物延伸法优点：可以检测特异位点甲优点：可以检测特异位点甲基化情况且不受内切酶限制；基化情况且不受内切酶限制；通过设计不同的引物可在同通过设计不同的引物可在同一延伸反应中得到不同位点一延伸反应中得到不同位点甲基化的情况；可检测甲基甲基化的情况；可检测甲基化位点分布不均的样本；能化位点分布不均的样本；能够定量检测甲基化水平；仅够定量检测甲基化水平；仅需少量的
39、需少量的DNADNA，且可用于石，且可用于石蜡包埋样本。蜡包埋样本。缺点：实验步骤略复杂，检测多位点时需设计多个引物，不缺点：实验步骤略复杂，检测多位点时需设计多个引物，不能对较长序列进行全面检测；存在放射性污染及重亚硫酸盐能对较长序列进行全面检测；存在放射性污染及重亚硫酸盐处理不完全的问题。处理不完全的问题。48ppt课件课件E.E.结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法优点：相对简单，不需预优点：相对简单，不需预先知道位点及样本序列；先知道位点及样本序列；可进行定量研究；检测所可进行定量研究；检测所需的样本量较少，可用于需的样本量较少，可用于石蜡包埋样本。石蜡包埋样本
40、。缺点：只能获得特殊酶切位点甲基化情况，因此阴性检测结缺点：只能获得特殊酶切位点甲基化情况，因此阴性检测结果不能排除样品中甲基化存在的可能；由于限制性内切酶和果不能排除样品中甲基化存在的可能；由于限制性内切酶和PCRPCR的使用，序列分析受到限制。的使用，序列分析受到限制。49ppt课件课件F.甲基化敏感性单链构象分析甲基化敏感性单链构象分析优点：可用于等位基因甲优点：可用于等位基因甲基化分析；能提示甲基化基化分析；能提示甲基化状态分布的不均性。状态分布的不均性。缺点：只有甲基化水平较缺点：只有甲基化水平较高的单链才能明显的区分高的单链才能明显的区分开，而水平较低的不易分开，而水平较低的不易分
41、开，有时会因为甲基化位开，有时会因为甲基化位点的随机和不均匀分布导点的随机和不均匀分布导致电泳条带出现拥挤、拖致电泳条带出现拥挤、拖尾的现象，故敏感性及准尾的现象，故敏感性及准确性略低；检测的片段不确性略低；检测的片段不宜过长。宜过长。50ppt课件课件G.G.甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳优点：可以用来检测出除最高温度解链区域优点：可以用来检测出除最高温度解链区域以外的所有发生甲基化的以外的所有发生甲基化的DNADNA片段，所需的样片段，所需的样品量少，能较直观的显示出甲基化情况。品量少，能较直观的显示出甲基化情况。缺点：解链温度和缺点：解链温度和DGGEDGGE的
42、变性浓度梯度需要的变性浓度梯度需要摸索。摸索。51ppt课件课件H.H.甲基化敏感性解链曲线分析甲基化敏感性解链曲线分析最大的优点：能够对甲基化分布不均匀的最大的优点：能够对甲基化分布不均匀的DNADNA样本进行半定样本进行半定量分析。量分析。缺点：不能够精确检测出甲基化的具体位点；研究序列的缺点：不能够精确检测出甲基化的具体位点；研究序列的长度不宜过长；对低水平的长度不宜过长；对低水平的DNADNA甲基化敏感性低。甲基化敏感性低。52ppt课件课件I.I.MethylightMethylight优点：高敏感、快速，非甲基化等位基因比例很高也能精优点：高敏感、快速，非甲基化等位基因比例很高也能
43、精确地检测出甲基化的等位基因，可做多样本、多位点分析，确地检测出甲基化的等位基因，可做多样本、多位点分析，具备可重复性，所需的样本量少，不需电泳分离，能够为具备可重复性，所需的样本量少，不需电泳分离，能够为临床样本的研究提供可靠的技术支持。临床样本的研究提供可靠的技术支持。缺点：测定每个位点都要用一对引物和探针，费用高且受缺点：测定每个位点都要用一对引物和探针，费用高且受较多因素的影响。较多因素的影响。J.J.DNADNA微阵列法微阵列法优点：可用于多样本、多位点甲基化的检测，检测所需的优点：可用于多样本、多位点甲基化的检测，检测所需的样本量少，适于临床样本；样本量少，适于临床样本；缺点：不能
44、得到每个位点的信息，探针可能存在交叉杂交缺点：不能得到每个位点的信息，探针可能存在交叉杂交致结果假阳性，因此该方法进行检测时一定要设立对照。致结果假阳性，因此该方法进行检测时一定要设立对照。53ppt课件课件K.甲基化敏感性斑点分析甲基化敏感性斑点分析优点：快速、简便、易于掌握，能够一次检测优点：快速、简便、易于掌握，能够一次检测多种样本，包括石蜡包埋样本。多种样本，包括石蜡包埋样本。缺点：检测序列不能过长；若探针错误杂交或缺点：检测序列不能过长；若探针错误杂交或重亚硫酸盐处理不完全，则可能出现假阳性或重亚硫酸盐处理不完全，则可能出现假阳性或假阴性结果。假阴性结果。54ppt课件课件L.L.M
45、S-MLPAMS-MLPA优点：所需的样本量少，由优点：所需的样本量少，由于探针具有非常短的识别序于探针具有非常短的识别序列，因此可以用于局部降解列，因此可以用于局部降解的的DNADNA，如石蜡包埋的样本；，如石蜡包埋的样本；可用于分析大量的混合样本，可用于分析大量的混合样本，可一次检测多个靶基因中位可一次检测多个靶基因中位点的甲基化情况。点的甲基化情况。缺点：探针连接位点受限制性内切酶位点识别的限制，且要缺点：探针连接位点受限制性内切酶位点识别的限制，且要考虑到所用酶的反应适宜温度。考虑到所用酶的反应适宜温度。55ppt课件课件A.A.限制性标记基因组扫描限制性标记基因组扫描优点：可一次得到
46、多个位点甲基化的情况，利于新甲基优点：可一次得到多个位点甲基化的情况，利于新甲基化位点的寻找。化位点的寻找。缺点：缺点：RLGSRLGS图谱不能完全确认缺失的片段是由于甲基化图谱不能完全确认缺失的片段是由于甲基化还是由于样本本身缺失所致；对还是由于样本本身缺失所致；对DNADNA质量要求高；结果复质量要求高；结果复杂，不易解释。杂，不易解释。B.B.MBDMBD柱层法柱层法优点：高通量，可对未知片段进行初筛，选出含有甲基优点：高通量，可对未知片段进行初筛，选出含有甲基化的片段进一步检测，快速、简便。化的片段进一步检测，快速、简便。缺点：缺点：DNADNA片段的特殊构型也可与片段的特殊构型也可与
47、MBDMBD柱相结合，造成非柱相结合，造成非特异性捕获引起假阳性；是一种定性而非定量的方法；特异性捕获引起假阳性；是一种定性而非定量的方法；由于由于MBDMBD柱中所含多肽的量不完全相同，因此不同的柱中所含多肽的量不完全相同，因此不同的MBDMBD柱或多次使用的柱或多次使用的MBDMBD柱的结果可能存在差异。柱的结果可能存在差异。56ppt课件课件C.C.COMPARE-MSCOMPARE-MS该方法联合运用了该方法联合运用了MBDMBD柱层法及柱层法及MS-REMS-RE法，法，避免了单用避免了单用MBDMBD时非时非特异性捕获及单用内特异性捕获及单用内切酶时不完全消化所切酶时不完全消化所致
48、的假阳性。在快速、致的假阳性。在快速、简便同时，保证了结简便同时，保证了结果的特异性和敏感性。果的特异性和敏感性。缺点：需要使用限制性内切酶，因此不同程度地受到内切缺点：需要使用限制性内切酶，因此不同程度地受到内切酶识别位点的限制。酶识别位点的限制。57ppt课件课件 染色质免疫沉淀技术染色质免疫沉淀技术(ChIPChIP)是研究是研究DNADNA与蛋白质相互与蛋白质相互作用的重要工具。它可以灵敏地检测目标蛋白与特异作用的重要工具。它可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNADNA片段片段的结合情况，还可以用来研究组蛋白与基因表达的关系。的结合情况，还可以用来研究组蛋白与基因表达的关系。根据根据“组蛋
49、白密码组蛋白密码”学说，组蛋白的各种共价修饰的学说，组蛋白的各种共价修饰的组合会以协同或拮抗的方式诱导特异的下游功能，因此染色组合会以协同或拮抗的方式诱导特异的下游功能，因此染色质免疫沉淀技术也为研究组蛋白修饰在基因表达中的作用，质免疫沉淀技术也为研究组蛋白修饰在基因表达中的作用，全面阐明真核基因表达调控机制提供了强有力的工具。全面阐明真核基因表达调控机制提供了强有力的工具。58ppt课件课件基本原理：基本原理：生理状态下把细胞内的生理状态下把细胞内的DNADNA与蛋白质交联在一起，与蛋白质交联在一起，通过超声破碎将染色质随机切断为一定长度范围内的染色质通过超声破碎将染色质随机切断为一定长度范
50、围内的染色质片段，用所要研究的目的蛋白的特异性抗体沉淀交联复合体，片段，用所要研究的目的蛋白的特异性抗体沉淀交联复合体，再经过蛋白质与再经过蛋白质与DNADNA解除偶联，最后纯化目的片段并检测。解除偶联，最后纯化目的片段并检测。主要步骤：主要步骤：A.A.细胞固定；细胞固定；B.B.超声破碎断裂染色质；超声破碎断裂染色质；C.C.染色质的免疫沉染色质的免疫沉淀；淀；D.D.解除交联和纯化解除交联和纯化DNA DNA；E.DNAE.DNA的检测。的检测。59ppt课件课件染色质免疫沉淀与芯染色质免疫沉淀与芯片相结合技术片相结合技术(ChIPChIP-on-chip)on-chip)，成为研究，成
