1、.1蛋白原核表达 卫文强 2015.12.2 目的基因-T 表达载体 酶切，胶回收，连接 转化到克隆用细胞（Top10)提质粒，酶切验证 转化到表达用细胞（BL21（DE3)）诱导表达 SDS-PAGE.3DNA中的杂质如中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。等都会影响酶的活性。1）.DNA的纯度的纯度 影响限制性内切酶活性的因素影响限制性内切酶活性的因素2）.DNA的甲基化程度 dam甲基化酶（修饰甲基化酶（修饰GATC中的中的A）；）；dcm甲基化酶（修饰甲基化酶（修饰CCA/TGG的的C）。）。.43）.温度 不同的限制性内切酶的最
2、适反应温度不不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。同。大多数是大多数是37 oC，少数要求，少数要求40-65 oC。是影响限制酶活性的重要因素。是影响限制酶活性的重要因素。4）.缓冲液(Buffer)商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。MgCl2、NaCl/KCl：提供提供Mg2+和离子强度；和离子强度；Tris-HCl：维持维持pH；二硫苏糖醇（二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；）：保持酶稳定性；牛血清白蛋白牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；等：有助于酶的稳定；巯基乙醇巯基乙醇：保持酶的稳定性，防止酶失活。.5 用时在冰上操作；取酶用干燥、灭菌、新
3、的枪头 酶用量不能超过酶切总体积的10%；多种酶进行酶切时，先低盐后高盐先低盐后高盐缓冲液；关心小关心小贴士告贴士告诉你诉你 使用时注意事项：使用时注意事项：.6连接、转化与重组子鉴定连接、转化与重组子鉴定1、连接、连接.7（1）必须是两条）必须是两条双链双链DNA。（2）DNA 3 端有游离的端有游离的-OH，5端有一个磷酸基团（端有一个磷酸基团（P）。）。（3）需要）需要能量能量动物或噬菌体中：动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中：大肠杆菌中：NAD+（2）.连接条件连接条件.8 ATP：反复冻熔，ATP活性降低，ATP溶解度不高，连接缓冲液宜分装；单价离子：150-200mM NaCl，提
4、高连接效果；PEG：5%以下可以提高连接效率连接效果最好在37，但形成的互补不稳定;最佳连接温度：最佳连接温度：12-16，较好的连接效果，互补又较稳定;2）连接）连接温度：温度：3）反应液中的成分：反应液中的成分：.9目的或作用：目的或作用：4）插入片段与载体的浓度比例）插入片段与载体的浓度比例 载体载体DNA与外源与外源DNA的分子摩尔比通的分子摩尔比通常为常为13左右，甚至左右，甚至110 或更高或更高。增加插入片段与载体的接触机会，减增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。少载体自我连接的现象。.10 化学法（化学法（CaClCaCl2 2法法)：转化原理：是Ca2+2+
5、与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构液晶结构，后者经热脉冲经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙细胞膜出现空隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内（感受态细胞）。2、转化、转化.11影响转化率的主要影响因素影响转化率的主要影响因素:载体本身的性质及其空间构象：超螺载体本身的性质及其空间构象：超螺旋构象转化率最高；旋构象转化率最高；插入片段的大小：插入片段越大，转化插入片段的大小：插入片段越大，转化效率越低；效率越低；受体细胞的类型及预处理；受体细胞的类型及预处理；转化方法：电击法高于化学法。转化方法：电击法高于化学法。.12ROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IE
6、coR ICla IHind IIIHind IIBal IAprpBR3224363 bpori 限制性酶切图谱法限制性酶切图谱法3、转化子的筛选和鉴定、转化子的筛选和鉴定.13质粒质粒DNADNA的提取的提取基因组DNA质粒DNA 质粒具有自主复制质粒具有自主复制和转录能力，能在子和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携拷贝数，并表达所携带的遗传信息。带的遗传信息。质粒质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环不等，为双链、闭环的的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细分子，
7、并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。胞中。.14质粒质粒DNA提取方法：提取方法：碱裂解法碱裂解法、煮沸法、煮沸法、SDS法等法等 碱裂解法碱裂解法原理：原理：在碱性碱性条件下，双连DNA氢键断裂，结构破坏变性，环状超螺旋质粒不充分不充分变性变性。在中性条件下变性质粒恢复原来构型，而线性大分子细菌DNA不能复性呈不溶物而经离心除去。.15 抽提出质粒的构型：抽提出质粒的构型：1 1）超螺旋质粒质粒DNADNA:在提取质粒过程中，在提取质粒过程中，超螺旋超螺旋DNADNA占大部分。占大部分。2 2）开环质粒质粒DNADNA：如果质粒：如果质粒DNADNA两条链中两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分
8、子就能有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松驰型的环状旋转而消除链的张力，形成松驰型的环状分子，称开环分子，称开环DNADNA。3 3）线状质粒质粒DNADNA：如果质粒：如果质粒DNADNA的两条链在的两条链在同一处断裂，则形成线状同一处断裂，则形成线状DNADNA。.16抽提出的质粒三种构型电泳结果：1）开 环 2）线 状 3）超螺旋+-电泳方向电泳方向.17凝胶电泳技术凝胶电泳技术电泳目的：对核酸分子进行分离和检测电泳目的：对核酸分子进行分离和检测.18 凝胶分辨DNA的能力：琼脂糖 聚丙烯酰胺凝胶 浓度 分辨范围(kb)浓度 分辨范围(bp)0.3%5-60 3
9、.5 1000-2000 0.6%1-20 5 90-500 0.7%0.8-10 8.0 60-400 0.9%0.5-7 12 40-200 1.2%0.4-6 15 25-160 1.5%0.2-3 20 6-100凝胶浓度凝胶浓度:浓度浓度大大，筛孔小，适合，筛孔小，适合小小分子电泳；分子电泳；浓度浓度小小，筛孔大，适合，筛孔大，适合大大分子电泳分子电泳凝胶浓度的选择：取决于待检测的凝胶浓度的选择：取决于待检测的DNA的大小的大小原来如此！.19电泳缓冲液电泳缓冲液 pH值：偏碱性，带负电荷值：偏碱性，带负电荷 离子浓度：离子浓度高离子浓度：离子浓度高 电流大电流大 发热快发热快胶溶解
10、胶溶解 种类：种类：TAE（Tris+EDTA+醋酸）醋酸）:电流大，易产生离子富集电流大，易产生离子富集TBE（Tris+EDTA+硼酸）硼酸）:缓冲能力最强缓冲能力最强TPE（Tris+EDTA+磷酸）磷酸）:缓冲能力低缓冲能力低TNE（Tris+EDTA+醋酸钠）醋酸钠）.20pET表达载体表达载体.21.22.23.24pET表达载体的启动子是表达载体的启动子是T7噬菌体基因噬菌体基因10启动子（启动子（T7启动启动子），需要子），需要T7RNA聚合酶才能转录。聚合酶才能转录。T7RNA聚合酶转录机制十分有效并具有选择性：充分诱导聚合酶转录机制十分有效并具有选择性：充分诱导时，几乎所有
11、的细胞资源都用于表达目的蛋白；在非诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；在非诱导条件下，几乎可以使目的基因完全处于沉默而不转录。条件下，几乎可以使目的基因完全处于沉默而不转录。T7RNA聚合酶基因插入由大肠杆菌聚合酶基因插入由大肠杆菌lacUV5启动子控制、启动子控制、DE3溶原状态下的大肠杆菌染色体上。溶原状态下的大肠杆菌染色体上。25.T7 表达系统 转录调控的机理 化学诱导型 噬菌体 DE3 是 l 噬菌体的衍生 株，一段含有 lacI、lacUV5 启 动子和 T7 RNA 聚合酶基因的 DNA 片段被插入其 int 基因中 用噬菌体 DE3 的溶源菌作为表 达载体的宿主菌，调
12、控方式为 化学诱导型，类似于 Lac 表达 系统。T7 RNA 聚合酶基因 lac 启动子E.Coli（DE3）T7 启动子 目的基因T7 RNA 聚合酶IPTG诱导26.27基本原理 SDS-PAGESDS-PAGE技术是根据技术是根据SDSSDS能使蛋白质变性解能使蛋白质变性解聚成肽链并与肽链侧链以一定比例结合成聚成肽链并与肽链侧链以一定比例结合成SDSSDS肽链复合体，从而掩盖了肽链本身所带电荷肽链复合体，从而掩盖了肽链本身所带电荷（SDSSDS带负电），并消除了蛋白质分子间的形状带负电），并消除了蛋白质分子间的形状差异，再结合差异，再结合PAGEPAGE技术（根据分子的形状、电技术（根
13、据分子的形状、电荷、分子量综合差异来分离不同分子的技术）荷、分子量综合差异来分离不同分子的技术）来分离不同分子量蛋白质或测定定蛋白质分子来分离不同分子量蛋白质或测定定蛋白质分子量的实验技术。量的实验技术。.28基本步骤 制备分离胶 制备浓缩胶 上样并电泳 凝胶板剥离与染色脱色 结果分析.29出现明显界面时，出现明显界面时，分离胶凝聚完成分离胶凝聚完成（minh）倒出水，并用滤纸倒出水，并用滤纸吸干吸干v制备分离胶制备分离胶封水的目的是使分离胶上表面平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。.30加入浓缩胶溶加入浓缩胶溶液液 pH 6.8v制备浓缩胶制备浓缩胶样梳需一次平稳
14、插入样梳需一次平稳插入,梳梳口处不得有气泡口处不得有气泡,梳底需梳底需水平。水平。插入样品梳插入样品梳.31v上样及电泳上样及电泳.32凝胶板剥离与染色 电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1-2小时左右。脱色：染色后的凝胶用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质条带清晰。.33结果分析 标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。=蛋白样品距加样端迁移距离（cm）溴酚蓝区带中心距加样端距离（cm）相对迁移率 以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量。.34此课件下载可自行编辑修改，此课件供参考！此课件下载可自行编辑修改，此课件供参考！部分内容来源于网络，如有侵权请与我联系删除！部分内容来源于网络，如有侵权请与我联系删除！
