1、单克隆抗体用于治疗存在的问题单克隆抗体用于治疗存在的问题 1 1、单克隆抗体的特异性、单克隆抗体的特异性 由于肿瘤特异性抗原较少，缺乏对肿瘤有严由于肿瘤特异性抗原较少，缺乏对肿瘤有严格特异性的单抗，对正常组织有交叉反应；格特异性的单抗，对正常组织有交叉反应；2 2、异种抗体反应、异种抗体反应 鼠源性单抗用于人体，导致异源性超敏反应鼠源性单抗用于人体，导致异源性超敏反应理想的抗体药物的性质理想的抗体药物的性质高特异性和高亲和力（高特异性和高亲和力（Kd=10Kd=108 810101010L/ML/M）对人没有免疫原性，不诱导机体对抗体的排对人没有免疫原性，不诱导机体对抗体的排斥反应斥反应游离抗
2、体不激活补体游离抗体不激活补体一旦结合到靶抗原上，能诱导效应功能一旦结合到靶抗原上，能诱导效应功能细胞系稳定，适合在无血清培养基中进行细胞系稳定，适合在无血清培养基中进行 大规模培养大规模培养抗体符合生物制品标准抗体符合生物制品标准 问问 题题异源蛋白导致产生抗抗体，异源蛋白导致产生抗抗体，影响靶向性和效果影响靶向性和效果靶部位摄取的量太低靶部位摄取的量太低效应功能弱效应功能弱在体内被清除速度快在体内被清除速度快 对对 策策 抗体人源化抗体人源化 改变抗体分子大小改变抗体分子大小 连接毒素、放射性连接毒素、放射性同位素、药物同位素、药物 抗体人源化抗体人源化抗体治疗存在的问题及对策抗体治疗存在
3、的问题及对策抗体药物改造的方向抗体药物改造的方向抗体人源化和人源抗体制备抗体人源化和人源抗体制备改变抗体分子大小改变抗体分子大小增强抗体亲和力增强抗体亲和力增强抗体效应功能增强抗体效应功能单克隆抗体人源化的改进单克隆抗体人源化的改进VHVH和和VLVL是抗原决定簇结是抗原决定簇结合位点合位点 高变区高变区 HVRHVR 决定簇互补区决定簇互补区CDRCDR 骨架区骨架区FRFRCH1CH1和和CLCL：Ig Ig同种异型同种异型的遗传标志的遗传标志CH2CH2：补体结合位点：补体结合位点 CH3CH3：某些细胞某些细胞FcFc受体受体结合部位结合部位 从杂交瘤细胞分离出从杂交瘤细胞分离出功能性
4、可功能性可变区基因，与人变区基因，与人IgIg恒定区（决定免疫原恒定区（决定免疫原性）基因连接，插入适当表达载体，转性）基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。鼠嵌合抗体。特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。能力。Pr 鼠鼠VH 人人 CH Pr 鼠鼠VL 人人 CL免疫球蛋白免疫球蛋白基因载体的构建基因载体的构建H链嵌合载体链嵌合载体L 链嵌合载体链嵌合载体共转染细胞共转染细胞启动子启动子人人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略鼠嵌合抗体基因工程改造策略
5、鼠鼠VH鼠鼠V L人人CL人人CH抗体分泌细胞抗体分泌细胞人人-鼠嵌合基因工程抗体鼠嵌合基因工程抗体决定簇互补区决定簇互补区CDR序列序列 CDR序列序列 鼠单克隆抗体鼠单克隆抗体 人抗体人抗体人源化抗体人源化抗体鼠单克隆鼠单克隆V区人源化（区人源化（CDR移植）移植）用基因工程方法，用基因工程方法，将抗体将抗体重链和轻链可重链和轻链可变区）通过一个连接肽连接而成变区）通过一个连接肽连接而成AgAgAg双特异性抗体的特点*将免疫细胞锚着于肿瘤部位，提高肿瘤部位的效靶比。*不受MHC的限制，直接激活免疫细胞的杀瘤机制。123提高抗体提高抗体效应功能效应功能抗体融合蛋白抗体融合蛋白双特异性抗体双特
6、异性抗体偶连细胞毒物质偶连细胞毒物质细胞内抗体细胞内抗体提高抗体效应功能提高抗体效应功能偶连细胞毒物质偶连细胞毒物质连接放射性同位素连接放射性同位素(131131I I、99m99mTcTc）连接植物或细菌毒素（连接植物或细菌毒素（ricinricin、PEPE4040）连接细胞毒性药物（连接细胞毒性药物（C1027C1027、柔红霉素）柔红霉素）免疫毒素免疫毒素CCVCVCCCSPDPSPDPRicin ARicin A（-FcRI-Ricin A）Ricin A:蓖麻毒素A,对肿瘤细胞具有毒性作用CH1CH2CH3IL-2scFvIL-2 免疫细胞因子免疫细胞因子(Immunocytoki
7、ne)(Immunocytokine)阻断靶蛋白的活性部位阻断靶蛋白的活性部位 阻断细胞内蛋白蛋白相互作用阻断细胞内蛋白蛋白相互作用 干扰细胞内靶蛋白的转运干扰细胞内靶蛋白的转运 促使靶蛋白降解促使靶蛋白降解今后抗体药物发展的方向今后抗体药物发展的方向寻找新的靶抗原寻找新的靶抗原基于抗原立体结构设计抗体基于抗原立体结构设计抗体基于抗原基于抗原-抗体相互作用设计小分子抗抗体相互作用设计小分子抗体模拟物体模拟物最理想的单克隆抗体最理想的单克隆抗体100%100%人源人源人类免疫系统自然产生人类免疫系统自然产生2525年来的全人抗体的尝试年来的全人抗体的尝试 鼠骨髓瘤不适合与人鼠骨髓瘤不适合与人B
8、B细胞融合细胞融合稳定性差稳定性差抗体产量低抗体产量低 非洲淋巴细胞瘤病毒非洲淋巴细胞瘤病毒 (EBV)(EBV)保存抗体分保存抗体分泌细胞泌细胞细胞株不稳定细胞株不稳定抗体的产量低抗体的产量低不能特异性地保存抗体分泌细胞不能特异性地保存抗体分泌细胞 很难获得人类骨髓瘤细胞株很难获得人类骨髓瘤细胞株成功建立人骨髓瘤细胞系，人源抗体进入新成功建立人骨髓瘤细胞系，人源抗体进入新的里程的里程用用 途：能稳定的保持人途：能稳定的保持人B B细胞分泌抗体的能力细胞分泌抗体的能力发明人：英国剑桥大学的发明人：英国剑桥大学的Dr KarpasDr Karpas教授教授意意 义：义：1 1 在整体水平上研究人
9、类产生抗体在整体水平上研究人类产生抗体 2 2 开创人类抗体基因组学的研究开创人类抗体基因组学的研究评评 价：价：1 1 诺贝尔奖得主诺贝尔奖得主Dr Milstein Dr Milstein 推荐发表在推荐发表在PNASPNAS 2 2 世界权威杂志世界权威杂志“科学科学”发表了新闻评述发表了新闻评述 3 3 剑桥大学开了新闻发布会剑桥大学开了新闻发布会未来单抗开发的完美方案未来单抗开发的完美方案从已知治疗靶子生产高亲和力全人从已知治疗靶子生产高亲和力全人抗体抗体全人抗体挑战靶分子的筛选全人抗体挑战靶分子的筛选开发未知抗原的治疗用抗体开发未知抗原的治疗用抗体已批准上市的单抗43适用病症靶抗原
10、抗体名称抗体来源临床阶段移植排斥大肠癌冠心病淋巴瘤移植排斥炎症性肠病、类风湿CD317-1A血小板受体baCD20CD25TNF-OKT3PanorexReoProRituxanSimulectRemicade鼠单抗鼠单抗人鼠嵌合抗体人鼠嵌合抗体人鼠嵌合抗体人鼠嵌合抗体19861995(德国)1994199719981998、199944适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段移植排斥乳腺癌RVS感染AMLCLLCD25HER-2RSV F蛋白CD33CD52ZanapaxHerceptinSynagisMylotargCAMPATH人源化抗体人源化抗体人源化抗体人源化抗体化疗药物交联物人源化抗
11、体19971998199820002001正在进行临床开发中的基因工程抗体45适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段银屑病IL8CD11a(IgG1)ICAM-3CD80CD2CD3ABXIL8Anti-CD11aICM3IDEC-114MEDI-507Smart anti-CD3Human(人源)Humanized(人源化)HumanizedPrimatizedHumanizedHumanized(IgG)，临床前/46适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段风湿性关节炎Complement(C5)TNF-TNF-TNF-CD4CD45G1.1D2E7CDP870InfliximabIDEC-
12、151MDX-CD4HumanizedHumanHumanized(Fab)Chimeric(IgG1)(嵌合)Primatized(IgG1)Human(IgG)FDA批准（1999）47适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段克罗恩病，节段性回肠炎溃疡性结肠炎自身免疫病TNF-TNF-47CD4CD3InfliximabCDP571LDP02OrthoClone OKT4ASmart anti-CD3Chimeric(IgG1)Humanized(IgG4)HumanizedHumanized(IgG)HumanizedFDA批准（1998）/48适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段系统性
13、红斑狼疮多发性硬化症C5CD40LCD40LComplement(C5)VLA-4CD40L5G1.1AntovaIDEC-1315G1.1MEDI-507AntegrenIDEC-131HumanizedHumanized(IgG)HumanizedHumanized(IgG)Humanized(IgG)Humanized(继续)/49适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段自身免疫出血性病症气喘/变态反应CD64(FcgR)IL-5IL-5IL-4IgECD23MDX-33SCH55700SB-240563SB-240683rhuMab-E25IDEC-152HumanHumanized(I
14、gG4)HumanizedHumanizedHumanized(IgG1)Primmatized50适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段移植物抗宿主疾病同种异体移植排斥CD147CD2CD2CD3CD3ABX-CBLBTI-322MEDI507Orthoclone/OKT3SMAT anti-CD3Murine(IgM)(小鼠)Rat(IgG)(大鼠)Humanized Murine(Ig2a)Humanized/FDA批准（1996）/51适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段同种异体移植排斥CD25CD252-integrinCD4CD147ZenapaxSimulectLDP-01OK
15、T4AABX-CBLHumanized (IgG1)Chimeric(IgG1)Humanized (IgG)Humanized (IgG)Murine(IgM)FDA批准（1997）FDA批准（1998）/52适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段同种异体移植排斥中风青光眼抗凝血剂CD40LCD182-integrinTGF 2Fact AntovaAnti-LFA-1LDP-01CAT-152Corsevin MHumanized (IgG)Murine F(ab)2 Humanized (IgG)HumanChimeric(Fab)/(继续)/53适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段冠
16、状血管成形术并发症心肌梗死罗氏肉瘤病毒Glycoprotein ba receptorPDGF RCD18F proteinReoPro AbciximabCDP860Anti-CD18SynagisHumanized(IgG)Humanized F(ab)2Humanized F(ab)2Humanized(IgG1)/FDA批准（1998）54适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段艾滋病乙型肝炎巨细胞病毒中毒性休克一般癌症Gp120Hep BCMVTNF-CD14VEGFPRO542OstavirProtovirMAK-195(SEGAND)IC14Anti-VEGFCD4 fusionH
17、umanHumanMurine F(ab)2?Humanized(IgG1)(批准)55适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段卵巢癌结肠病肺病头、颈部病变CA12517-1A Cell surface antigenAnti-idiotypic GD3epitopeEGFROvaRexPanorexBEC2IMCC225MurineMurine(IgG2a)Murine(IgG)MerckKGaAChimeric(IgG0/德国批准（1995）56适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段乳腺病慢性淋巴细胞白血病急性粒细胞白血病非何杰金淋巴瘤HER2/neuCD52CD33CD20CD22Herc
18、eptinCampath1/(LDP03)SmartRituxanLymphoCideHumanized(IgG1)Humanized(IgG1)M195Chimeric(IgG1)Humanized(IgG)FDA批准（1998）生物制品许可申请蛋白质设计FDA批准/57适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段非何杰金淋巴瘤黑色素瘤HLAHLA DR抗id(GD2)*Smart 1D10Oncolym(Lym-1)TriGemHumanizedRadiolabelled murineMurine/武汉生物制品研究所研制的注射用鼠源性抗人T淋巴细胞CD3抗原单克隆抗体是国内自行研制最早批准上市的
19、抗体；北京百泰生物与古巴合作开发的I类癌症治疗新药“重组人源化抗人表皮生长因子受体单克隆抗体”(商品名：泰欣生)是我国批准的第一个人源化单克隆抗体药物；58 第四军医大学、成都华神联合研制的美妥昔单抗注射液(商品名：利卡汀)是全球第一个用于治疗原发性肝癌的药物，也是我国第一个具有自主知识产权的抗体类药物。59噬菌体展示系统Phage on displayExponential growth in publications referring to phage display.The number of Medline citations containing the terms phagean
20、d display are plotted against the year of publication.TIBTECH NOVEMBER 1999(VOL 17).Of Needles and Haystacks噬菌体展示系统Phage on display噬菌体展示原理 噬菌体展示定义、分类 简介噬菌体及淘选过程噬菌体展示应用商业化噬菌体展示系统表型 基因型展示肽 编码基因什么是噬菌体展示是一项筛选技术，将 外源多肽或蛋白 与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面，而编码该融合子的 DNA 则位于病毒粒子内。使大量多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使各种靶分子（抗
21、体、酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过淘选得以快速鉴定。Smith 在 1985 年首次证实外源 DNA 可以插入丝状噬菌体基因 III 中，并与 pIII 蛋白融合展示。Smith GP.Science 1985;228:1315-7噬菌体展示技术Phage Display TechnologyWhat can be displayed?Proteins from 6-300 aa Short peptides Antibody fragments cDNA library enzymes1Pan library withimmobilized targets2Wash off unboun
22、d phage3Elute bound phage4Amplify overnight5Pan eluted phage6Isolate individual colony3-4 2004 Montarop YamabhaiCell Free展示系统Display SystemPhage DisplayCell BasedCell Surface DisplayRibosome DisplaymRNA Display根据噬菌体不同根据载体不同根据文库不同PhageLibrary噬菌体展示系统的分类Classification of phage display systems根据载体不同Vect
23、orTrue PhagePhagemid根据噬菌体不同PhageM13,f1,fdT7,T4,lamda根据文库不同Library随机肽库cDNA文库抗体文库蛋白质文库Schematic representation of M13 PhageSchematic representation of T7 Phage种为结构蛋白质。与展示密切相关的有两种结构蛋白质。DNA在细菌内滚环复制，细菌不被裂解，但生长速度减慢，并且分泌大量噬菌体颗粒。M13噬菌体的组成和结构Structure of M13 filamentous phage丝状噬菌体：M13、f1和fd。单链DNA病毒,6407 bp。基
24、因组编码11种蛋白质，其中5Schematic representation of M13 PhageLife Cycle of M13pIII蛋白结合于 E.Coli 的F纤毛;细菌的Tol蛋白复合体解聚噬菌体的衣壳蛋白，转运至胞浆（再用）;病毒ssDNA进入细菌的胞浆合成dsDNA；以dsDNA为模版合成所有的病毒蛋白，且通过滚环复制合成组装病毒所需的ssDNA。第一代噬菌体在感染10分钟后出现在培养液中（37 oC）。感染后1小时内平均每个细胞分泌1000个噬菌体。次要衣壳蛋白pIIIBRIEFINGS IN FUNCTIONAL GENOMICS AND PROTEOMICS.VOL
25、1.NO 2.189203.JULY 2002406 aa 组成，5个拷贝，位于噬菌体的尾部。由三个功能区组成：N1 穿膜区：作用于E.coli细胞膜上的TolA蛋白；与噬菌体的入侵有关。N2 受体结合 区：负责结合F菌毛。CT 疏水区：组装前黏附在细菌内膜上；与噬菌体组装终止有关。G1、G2:甘氨酸片段，在感染过程中，增加各个功能域之间的灵活性。Infection of E.coli by Ff baceriophage主要衣壳蛋白pVIII每个病毒子含约2700个拷贝，约10%能有效地融合外源多肽或蛋白。以pIII融合子方式表达的多肽是低价的，而以pVIII融合子方式表达的多肽则是高价的（
26、每个病毒子200个拷贝）。这种高价pVIII展示所增加的亲和力有利于筛选到亲和力非常低的配体，而低价pIII展示则将筛选限制在具有较高亲和力的配体上。所有Ph.D.文库都是pIII融合方式（每个病毒子展示5个拷贝的外源多肽）。Smith et al.(1997)Chem.Rev.97,391-410phagemid vectorsTypes of phage displaysystempVIII 展示的多肽比较小，如果太大会影响噬菌体壳蛋白的组装。pIII只要不影响感染，可以展示300 aa的多肽。噬菌质粒能展示的蛋白已经达到86 kDa。噬菌体质粒方便克隆、增强遗传稳定性Phage disp
27、lay with phagemid vectors噬菌体质粒特征：携带有欲在噬菌体上融合展示的蛋白基因，没有其他噬菌体基因。有质粒复制起点(322 ori)和噬菌体复制起点(f1 ori用于合成ssDNA)。有包装序列信号（packing signal）。有供筛选的抗生素标记基因。Helper phage：提供噬菌体质粒复制、合成ssDNA和病毒包装所需要的所有蛋白和酶（f1ori defect)。包装后的噬菌体包含有两种不同来源的成份：噬菌体质粒和Helper phage。多价展示？单价展示？Polyvalent or monovalent display?展示价位（Display vale
28、ncy)：噬菌体表面展示的多肽的拷贝数。展示价位不同所筛选的分子亲和力就会不同。用噬菌体质粒时，以pIII展示为例：10%病毒展示为单价，非常少量的展示为两个拷贝，绝大多数只展示野生型pIII。The major displaying speciesis monovalent,but mostparticles do not display at all.True phagePhagemid多价展示单价展示筛选到的分子亲和力相对低亲和力高极少或无未展示的噬菌体*大 部 分 是 未 展 示 的 噬 菌 体高拷贝数增加了抗原性可能会影响噬菌体的组装和增殖易克隆，遗传稳定性好改进 helper ph
29、agepJuFo噬菌质粒中加入了 Jun and Fos Leu Zipper基因两个基因都以 PelB 作为 signal sequence，以 lac作为 promoter/operator。NH2-pelB+Jun Leu zipper+C-terminal domain pIII-COOHNH2-pelB+Fos Leu zipper+cDNA-product COOHJun和 Fos通过二硫键形成异源二聚体展示 cDNA 文库Selection from cDNA librariesCarmeri et al.Gene 1993淘选Finding the needle in the
30、haystack:Screeningphage display libraries建立噬菌体展示库淘选噬菌体展示库分析克隆淘选的方法亲和淘选直接包被法淘选法：优点：简单直接。缺点：偶尔会导致配体结合位点难以进入 可能是由于分子的立体封阻 或者是靶分子表面的部分变性而引起液相法：先将噬菌体库在液相中与靶分子进行预结合，然后将噬菌体-靶分子复合物亲和捕获于亲和介质上，如：链霉亲和素包被的表面。噬菌体肽库与靶分子相互作用洗涤去未结合的或非特异性结合的噬菌体将特异性结合的噬菌体洗脱下来三轮淘选后，克隆测序噬菌体肽库淘选示意图：亲和筛选测定抗FLAG M2单克隆抗体的抗原决定簇对每 轮 淘选 所得到的克
31、隆测序，结果清晰地显示核心抗原决定簇是DYKXXD,其中X可以是任意氨基酸。为 了 确 定 FLAG 抗 原 决 定 簇 序 列DYKDDDDK中哪一个氨基酸是抗体结合所必需的，将单克隆抗体包被于96孔板，对Ph.D.-7 展 示 文 库 进 行 三 轮 淘选。噬菌体展示系统Phage on display噬菌体展示原理噬菌体展示应用商业化噬菌体展示系统噬菌体展示的应用抗原表位分析制备特异性抗体制备疫苗、多价疫苗构建新型的生物催化剂如Ren et al(1997)将T4 DNA连接酶展示于T4噬菌体，所表达的融合蛋白能够高效连接黏性或者平末端。有可能把催化某一代谢途径的多种酶展示到噬菌体上，制
32、造人工的多酶复合体。或者把成百上千个酶分子的活性位点展示到同一个噬菌体颗粒上，制造superenzyme。噬菌体展示的应用筛选酶抑制剂是寻找抑制酶活性肽段的理想工具。Dennis从肽库中筛选到非竞争性地抑制 F VIIa 活性的肽段。Coagulation Cascade.A current simplified view of thecoagulation cascade initiated by the TFFVIIa complex is shown.噬菌体展示的应用蛋白质蛋白质相互作用噬菌体cDNA文库与芯片相结合(a)合成噬菌体cDNA文库。(b)生物淘选。(c)铺板，挑克隆入微孔板
33、，为制备芯片做准备。General selection scheme for cDNA expression-products displayed on phagesurface.Konthur et al 2003 TARGETS Vol.2,No.6 261-270.噬菌体展示的应用噬菌体cDNA文库与芯片结合(a)淘选后的文库，制作DNA芯片。(b)确认插入片段的种类。(c)生物化学方法进一步确认。Scheme for the elucidation of the complexity of enriched cDNA expression-productphage display li
34、braries.Konthur et al 2003 TARGETS Vol.2,No.6 261-270.用病人IgE血清对6种不同的cDNA文库淘选，5轮后，挑出38,000个克隆，鉴别了233种蛋白，其中47种为已知，186种是新的过敏源。烟曲霉(Aspergillus fumigatus)已成为临床上仅次于白色念珠菌的一种重要的条件致病真菌。草本枝孢(小麦黑霉病菌)Cladosporium herbarum鸡腿蘑（Coprinus comatus）皮屑牙胞菌(Malassezia furfur)花生和人肺组织Crameri,R.et al.(2001)Tappingallergen r
35、epertoires by advancedcloning technologies.Int.Arch.Allergy Immunol.124,4347噬菌体展示的应用应用举例噬菌体展示系统Phage on display噬菌体展示原理噬菌体展示应用商业化噬菌体展示系统Commercial suppliers of phagedisplay vectors and librariesPhDTM Phage Display System用于 PhD 中的噬菌体是 M13KE由M13mp19衍生的溶源性噬菌体。随机肽与次要衣壳蛋白N-端融合，经细胞膜分泌，噬菌斑模糊不透明，用有-互补的宿主菌在含X
36、gal/IPTG的平板上可呈蓝斑。融合蛋白表达时N端有一段信号肽前导序列，蛋白分泌后前导序列被切除，使随机七肽直接展示于成熟蛋白的N端。噬菌体展示肽库E.coli ER2738 宿主菌-28 gIII 测序引物（用于人工测序）-96 gIII 测序引物（用于自动测序）链霉亲和素 Streptavidin生物素试剂盒组成文库克隆载体可以买到吗？用 来 构 建 所有这三种Ph.D.文库的载体，M13KE（#E8101S），是 可 以 购 买 到的。M13KE 是M13mp19 的 衍 生 株，其pIII 基因的5 端构建了限制性酶切位点，用户可 以 将 设 计 好 的 人 工 基 因 盒（synt
37、hetic cassette）插 入 此 处 构建自己的肽库。因为M13KE是噬菌体，而不是噬菌粒载体，所以在已加工的病毒子上所有5个拷贝的pIII蛋白均携带有展示肽序列。另外，大于20-30个氨基酸的展示多肽会影响噬菌体的感染力，所以此载体仅适合展示短的多肽。M13K07 Helper Phage由M13衍生而来。在M13复制起始点处，插入有卡那霉素抗性基因。能在无噬菌质粒的情况下复制。当有噬菌质粒时，由于噬菌质粒含有野生型M13或者f1复制起始点，因此，单链噬菌质粒的DNA会被优先包装并分泌。不能用M13KO7作为克隆载体，如果要克隆噬菌体展示库，建议使用M13KE噬菌体克隆载体。M13噬
38、菌体与其他噬菌体比较有什么优点？M13噬菌体为非裂解性噬菌体（溶源性），周质内组装，经细胞膜分泌，噬菌斑的形成不是由于菌体裂解而是由于细胞生长力减弱所致，因此噬菌斑是浑浊的而不是清亮的，用有-互补的宿主菌在含 Xgal/IPTG的平板上可呈 蓝斑。由于 M13噬菌体在增殖期间不裂解宿主菌。简化了噬菌体纯化步骤，只用简单的 PEG沉淀方法就足以将噬菌体与其他所有污染的细胞蛋白分开。而其他用于噬菌体展示的噬菌体如：T7,T4和 Lambda噬菌体均为裂解性噬菌体，每轮淘选之间都需要花时间进行纯化，以避免淘选扩增的噬菌体污染有细胞蛋白（如：有些蛋白酶类物质会在淘选时将靶分子降解掉）。NEB的噬菌体文
39、库能展示cDNA文库吗？不适合于 cDNA文库展示，因为这种表达需要使目的蛋白序列在前导序列（蛋白分泌所需要的）和噬菌体包膜蛋白 pIII或 pVIII的 N端序列之间保持读码框架一致，这样产生的 M13 cDNA文库中，能有效表达的克隆会非常少。Novagen的 T7 Select 噬菌体展示系统可以将 cDNA插入片段融合在包膜蛋白的 C末端，但是该系统利用的是裂解性噬菌体 T7而不是溶源性噬菌体 M13，淘选扩增的噬菌体可能会污染有细胞蛋白，故需要化更多的时间进行噬菌体的纯化。货号产品名称规格价格E8100SPh.D.-7噬菌体表面展示试剂盒10次淘选E8110SPh.D.-12噬菌体表
40、面展示试剂盒10次淘选E8120SPh.D.-C7C噬菌体表面展示试剂盒10次淘选E8101SPh.D.多肽展示克隆系统20 gNEB提供的三种随机肽库Recombinant PhageAntibody system用于克隆、表达和检测小鼠抗体基因噬菌质粒-Helper phage系统抗体片段克隆于噬菌质粒与pIII蛋白融合展示在M13噬菌体表面Helper phage-M13KO7T7Select Phage Display Systemfrom NovagenNovagen 提供：Display VectorPre-Made LibrariesT7 噬菌体结构Structure of th
41、e T7 phage particle(Source:Novagen)裂解型噬菌体，含有双链DNA(40 kb,55 gene,3 classes)。Life cycle 30 min at 30C头部：20面体（icosahedral)，衣壳蛋白有415拷贝（capsidprotein,gene 10)，分别由60个6聚体和11个5聚体组成。尾部：连接头尾的颈圈（connector)、1个短小的圆锥型尾部和6个尾丝。Genetic map of T7衣壳蛋白表达受以下因素的调控：T7 RNA聚合酶启动子10(promoter)终止子T（terminator)翻译起始因子s10（transla
42、tion initiation signals)衣壳蛋白有两种形式：10A(344aa)和10B（397aa）T7Select载体：10BT7Select vector featuresT7Select 415-1b:衣壳蛋白基因含有野生型的调控信号：10 promoter,Tterminator,and s10 translation initiation signals。T7Select10-3b：The s10 translation initiation signal(ribosome bindingsite)was modified to produce the mid-copy v
43、ector。T7Select1-2:10 and s10 were removed to further reduce capsid geneexpression。噬菌体展示系统Phage on display噬菌体展示原理噬菌体展示应用商业化噬菌体展示系统测序模板的快速纯化1.噬 菌 斑 扩 增，在 第 一 步 离 心 后，将 500 l含 噬 菌 体 上 清 转 入 一新鲜离心管。2.加 200 l PEG/NaCl，颠倒混匀，室温放置 10 min。3.离心 10 min，弃上清液。4.短暂离心，小心吸去残余上清。5.沉 淀 物 彻 底 重 悬 于 100 l碘化物缓冲液中，加入 250
44、 l乙醇。室 温 温 育 10 min。短 时 间 的室 温 温 育 使 单 链 噬 菌 体 DNA沉 淀 而 大多数噬菌体蛋白保持在溶液中。6.离心 10 min，弃上清。用 70%的 乙 醇洗沉淀，短暂真空干燥。7.沉淀重悬于 30 l TE 中。8.测序。根据测序方法的不同,适当增减模板用量。本方法非常快速，无需酚或层析，可以产生足够纯的模板进行自动双脱氧测序。pIII蛋白展示和pVIII蛋白展示有什么不同?丝状噬菌体展示系统一般是在包膜蛋白 pIII或 pVIII的 N端融合外源多肽。每个病毒子含个拷贝的 pIII蛋白，这五个蛋白都可以融合短肽而不影响噬菌体的感染力。而对主要包膜蛋白
45、pVIII来说，每个病毒子含 2700个拷贝之多，其中约 10%能有效地融合外源多肽或蛋白。这样，以 pIII融合子方式表达的多肽便是低价的（每个病毒子 15个拷贝），而以 pVIII融合子方式表达的多肽则是高价的（每个病毒子200个拷贝）。这种高价 pVIII展示所增加的亲和性有利于筛选到亲和力非常低的配体，而低价 pIII展示则将筛选限制在具有较高亲和力的配体上。所有 Ph.D.文库都是 pIII融合方式（每个病毒子展示 5个拷贝的外源多肽）。噬菌体展示筛选与其他文库筛选方法相比有什么优点？能对较大库容量的文库进行快速筛选。同时由于被筛选的噬菌体库还可以在大肠杆菌中进行再扩增，从而可以进行
46、连续多轮的迭代选择，得到高亲和力的序列。简化的遗传密码表文库的随机序列区域仅用32个密码子编码所有20种氨基酸。这使单密码子氨 基酸的 出现频 率相对 较高，同时排除了三个终止密码子中的两个。在构建该文库的菌株中，琥珀终止子TAG(*)可被Gln抑制。淘选程序D1：靶分子包被聚苯乙烯培养板D2：将已稀释的噬菌体库加到培养板上，结合，清洗，洗脱。扩增，滴定。D3：完成扩增噬菌体。D4&D5：第二轮淘选，扩增噬菌体。D6：第三轮淘选，测序Ph.D.文库中的氨基酸分布由原始文库中随机挑选 70个单插入克隆测序。所有测序的 490个密码子（70个克隆 7个随机密码子）中氨基酸分布如下：*预期频率=该氨
47、基酸的密码子数 32个密码子 100%展示肽序列中的精氨酸会干扰 pIII蛋白的分泌；因此七肽序列中含精氨酸的克隆 很难选到。在文库增殖菌株中终止密码子 TAG被的抑制，可以接受 Gln残基。M13无需体外包装电转化 效率高,库容量大 2.8 109M13噬菌体纯化步骤简单，可加速淘选进程可避免细胞蛋白的污染Any ligand(natural orsynthetic)随机肽库体内 筛选器官特异性多肽噬菌体表面展示肽库优缺点优点：缺点：仅适合展示小的多肽（=20 氨基酸）载体容量 1 kb；且有序列依赖性不能筛选 Natural ligand(T7 cDNA文库)不能筛选 DNA-,RNA-结合肽（用 T7载体文库可以）Landmarks of M13 phage display1985 第一次发表噬菌体展示技术；展示多肽1988 噬菌质粒系统1990 抗体片段的展示1993 展示cDNA 文库1994/1995 研发了 phage two-hybrid 技术1996 首次体内 in vivo 淘选试验1998 噬菌体展示载体作为基因导入载体1999 Combination of phage display with high-density arrays2001 Automated phage display selection
