1、园艺作物病虫害防治园艺作物病虫害防治学习情境1 蔬菜病虫害防治蔬菜病虫害防治子学习情境子学习情境2 2:侵染性病害防治侵染性病害防治 病原真菌的分离与培养病原真菌的分离与培养一、目的要求一、目的要求 掌握病原真菌分离培养的基本原理、学会消毒、灭菌、倒平板、病原掌握病原真菌分离培养的基本原理、学会消毒、灭菌、倒平板、病原真菌的组织分离和稀释分离的基本方法。真菌的组织分离和稀释分离的基本方法。二、材料、用具和药品二、材料、用具和药品 新鲜的真菌病害分离材料、新鲜的真菌病害分离材料、PDA的斜面与平板培养基、无菌室、超净的斜面与平板培养基、无菌室、超净工作台或无菌操作箱（接种箱）、恒温箱、紫外线灭菌
2、灯、酒精灯、火柴、工作台或无菌操作箱（接种箱）、恒温箱、紫外线灭菌灯、酒精灯、火柴、吸管、剪刀、镊子、接种环、接种针、福尔马林、吸管、剪刀、镊子、接种环、接种针、福尔马林、70%乙醇、乙醇、0.1%升汞、升汞、无菌水和记号笔等。无菌水和记号笔等。三、内容与方法三、内容与方法 分离是将病原物从发病组织上与其他微生物分开；培养是将分离是将病原物从发病组织上与其他微生物分开；培养是将分离的病原物移到可以让这种病原物正常生长的营养基质（培养分离的病原物移到可以让这种病原物正常生长的营养基质（培养基）上，从而获得其纯培养。基）上，从而获得其纯培养。（一）分离前的准备工作（一）分离前的准备工作 1.工作环
3、境和分离用具的清洁和消毒工作环境和分离用具的清洁和消毒（1）常用的消毒方法：）常用的消毒方法：常用消毒方法及其使用范围常用消毒方法及其使用范围方法方法操作操作使用范围使用范围湿热法湿热法常压蒸汽常压蒸汽不宜用高压蒸汽灭菌的不宜用高压蒸汽灭菌的培养基培养基煮沸煮沸玻璃器皿玻璃器皿辐射法辐射法用用30W、253.7nm波长的紫外灯照波长的紫外灯照射射20-30min.无菌室、无菌箱、衣物无菌室、无菌箱、衣物等空气及物体表面等空气及物体表面化学药品法化学药品法70%乙醇、乙醇、2%煤酚皂（来苏水）、煤酚皂（来苏水）、5%石碳酸液等喷雾石碳酸液等喷雾无菌室、无菌箱无菌室、无菌箱0.25%新洁尔灭、新洁
4、尔灭、0.5%次氯酸钙次氯酸钙（漂白粉）擦拭（漂白粉）擦拭玻璃器皿、金属和木质玻璃器皿、金属和木质器皿等器皿等70%乙醇、乙醇、0.1%新洁尔灭、新洁尔灭、0.1%升升汞浸泡、擦拭汞浸泡、擦拭手（不可用升汞），分手（不可用升汞），分离材料离材料（2）清洁和消毒工作环境）清洁和消毒工作环境 为了避免污染，分离工作要求在无菌条件下进行，无菌室、超净工作台或为了避免污染，分离工作要求在无菌条件下进行，无菌室、超净工作台或无菌操作箱（接种箱）是分离工作不可缺少的设施。在分离前，无菌室内用无菌操作箱（接种箱）是分离工作不可缺少的设施。在分离前，无菌室内用紫外灯照射紫外灯照射20-30min，以杀死室内空
5、气中的大多数细菌。无菌操作箱可在分，以杀死室内空气中的大多数细菌。无菌操作箱可在分离前用化学消毒剂清除箱内微生物。离前用化学消毒剂清除箱内微生物。若分离工作只能在普通房间进行时，必须对房间进行彻底清洁，关闭门窗，若分离工作只能在普通房间进行时，必须对房间进行彻底清洁，关闭门窗，避免空气流动，经过喷雾或在地上多洒些水，以除去空气及地面灰尘后进行避免空气流动，经过喷雾或在地上多洒些水，以除去空气及地面灰尘后进行操作，也可获得较好的结果。工作前擦净桌面，最好铺上湿毛巾自认清洁或操作，也可获得较好的结果。工作前擦净桌面，最好铺上湿毛巾自认清洁或纱布上，尽量避免工作过程中临时取物带来污染。工作人员要注意
6、清洁，工纱布上，尽量避免工作过程中临时取物带来污染。工作人员要注意清洁，工作前用肥皂洗手，分离前还要用作前用肥皂洗手，分离前还要用70%乙醇擦拭双手。乙醇擦拭双手。（3）消毒分离用具）消毒分离用具 凡是和分离材料接触的器皿和材料都要保持无菌。将分离用具凡是和分离材料接触的器皿和材料都要保持无菌。将分离用具浸于浸于70%乙醇中，使用时在灯焰上烧去乙醇灭菌，如此乙醇中，使用时在灯焰上烧去乙醇灭菌，如此3次（刀、次（刀、剪、镊等不宜烧时过长，以防退火），再次使用时必须重复灭菌。剪、镊等不宜烧时过长，以防退火），再次使用时必须重复灭菌。2、选择分离材料、选择分离材料 分离材料应尽量新鲜，减少腐生菌混入
7、的机会。从受病组织分离材料应尽量新鲜，减少腐生菌混入的机会。从受病组织边缘靠近健全组织的部分分离，可减少污染，同时这部分病原生边缘靠近健全组织的部分分离，可减少污染，同时这部分病原生物处于较为活跃的状态，生长快，易分离成功。物处于较为活跃的状态，生长快，易分离成功。四、病原真菌的分离方法：四、病原真菌的分离方法：（一）组织分离法：（一）组织分离法：1.培养皿准备：培养皿准备：取灭菌培养皿一个，置于湿纱布上，在皿盖上注取灭菌培养皿一个，置于湿纱布上，在皿盖上注 明分离日期、材料和分离人姓名。明分离日期、材料和分离人姓名。2.培养皿平板制作：培养皿平板制作：无菌操作法向培养皿中加入无菌操作法向培养
8、皿中加入25%乳酸乳酸1-2滴滴 （减少细菌污染），然后将熔化而冷至（减少细菌污染），然后将熔化而冷至45左右的左右的马铃薯琼脂马铃薯琼脂 培养基培养基倒入培养皿中，轻轻摇成平面（分离细菌时则不能加乳倒入培养皿中，轻轻摇成平面（分离细菌时则不能加乳 酸）。酸）。马铃薯琼脂培养基（马铃薯琼脂培养基（PDA培养基）的制作：培养基）的制作：配方：土豆配方：土豆200g200g，葡萄糖，葡萄糖20g20g，琼脂，琼脂151520g20g，水，水1000mL1000mL，pHpH值自然。值自然。（1 1）称量和熬煮称量和熬煮：药品实际用量计算后，按培养基配方逐一称取去皮土豆。：药品实际用量计算后，按培养
9、基配方逐一称取去皮土豆。土豆切成小块放入锅中，加水土豆切成小块放入锅中，加水1000ml1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持，在加热器上加热至沸腾，维持202030min30min，用可用，用可用2 2层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取。滤液补充水分层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取。滤液补充水分到到1000ml1000ml。（2 2）加热溶解加热溶解：把滤液放入锅中，加入葡萄糖：把滤液放入锅中，加入葡萄糖20g20g，琼脂，琼脂151520g20g（提前搞（提前搞碎），然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，以防琼脂糊碎），然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，以防琼脂糊底或溢
10、出，待琼脂完全溶解后，再补充水分至所需量。底或溢出，待琼脂完全溶解后，再补充水分至所需量。（3 3）分装分装：按实验要求，将配制的培养基分装入试管或：按实验要求，将配制的培养基分装入试管或500ml500ml三角瓶内。三角瓶内。分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上造成污染。分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上造成污染。灭菌与消毒灭菌与消毒：任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。一般任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。一般培养基的灭菌采用培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。高压蒸汽灭菌。常用的灭菌的方法有：干热灭菌、高压蒸汽灭菌、常压蒸汽灭菌、常用
11、的灭菌的方法有：干热灭菌、高压蒸汽灭菌、常压蒸汽灭菌、常压间歇式灭菌、超高温灭菌、过滤除菌、辐射灭菌、化学药品灭菌等方常压间歇式灭菌、超高温灭菌、过滤除菌、辐射灭菌、化学药品灭菌等方法。法。本实验培养基的灭菌常使用的是本实验培养基的灭菌常使用的是高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌，它是利用高温湿热空，它是利用高温湿热空气气使菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的。使菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的。高压灭菌锅操作过程高压灭菌锅操作过程 加水加水装锅装锅盖盖盖盖加热加热当压力升为当压力升为0.5kg/cm0.5kg/cm2 2时排时排放冷空气放冷空气正式升压正式升压保压（保压（1.1kg/cm1.1kg/cm2 2
12、，121121，保持，保持20-30min20-30min）停止加热停止加热自然降压至零自然降压至零排放余汽排放余汽开盖开盖取出灭菌物品取出灭菌物品趁热摆斜面趁热摆斜面检验灭菌效果。检验灭菌效果。约约5050倒平板倒平板灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染3.3.切取病组织小块（叶斑病类）切取病组织小块（叶斑病类）：取真菌叶斑病的新鲜病叶取真菌叶斑病的新鲜病叶(或其他分离或其他分离材料材料)，选择典型的单个病斑，用解剖刀从病斑边缘，选择典型的单个病斑，用解剖刀从病斑边缘(病健交界处病健交
13、界处)切取切取小块小块(边长边长3-4mm)3-4mm)病组织数块。病组织数块。提示：选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入提示：选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入的机会。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此，的机会。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此，一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离。一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离。4.4.表面消毒：表面消毒：将病组织放人将病组织放人7070酒精中浸酒精中浸35s35s后，按无菌操作法将病组后，按无菌操作法将病组织移人织移人0 01 1升汞液中分别表面消毒升汞液中分别表面消毒0 05
14、 5、1 1、2 2、3 3、5 5minmin(也可使用也可使用其他表面消毒剂其他表面消毒剂,如漂白粉精片如漂白粉精片1-21-2片，研磨后加灭菌水片，研磨后加灭菌水20mL20mL，消毒，消毒5-5-10min10min。)，如植物组织柔嫩，则表面消毒时间宜短；反之则可长些。，如植物组织柔嫩，则表面消毒时间宜短；反之则可长些。然后放入灭菌水中连续漂洗三次，除去残留的消毒剂。然后放入灭菌水中连续漂洗三次，除去残留的消毒剂。果实、块茎和枝杆等组织内部的病原菌可用脱脂棉蘸果实、块茎和枝杆等组织内部的病原菌可用脱脂棉蘸70%70%酒精涂拭病酒精涂拭病部表面，通过火焰烧去表面酒精，重复进行部表面，通
15、过火焰烧去表面酒精，重复进行2-32-3次，达到表面消毒。次，达到表面消毒。提示：先用提示：先用7070的酒精浸的酒精浸2 2、3s3s是为了消除寄主表面的气泡，减少表是为了消除寄主表面的气泡，减少表面张面张 力，力，7070的酒精亦用于表面消毒，处理的时间较短的酒精亦用于表面消毒，处理的时间较短(一般数秒一般数秒lmin)lmin)。升汞溶液消毒的时间因材料而异，可自升汞溶液消毒的时间因材料而异，可自30s30s至至30min30min不等，一般情况下，不等，一般情况下，需时间需时间3 3，5min5min。5.5.接种：接种：用无菌操作法将病组织移至平板培养基上，每皿内放用无菌操作法将病组
16、织移至平板培养基上，每皿内放4-64-6块。块。提示：在将病组织小块移放到平板表面之前，应将其在无菌吸水纸上提示：在将病组织小块移放到平板表面之前，应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水，以大大减少病组织附近出现细菌污染。吸去多余的水，以大大减少病组织附近出现细菌污染。(6)(6)培养：培养：将培养皿倒置放人将培养皿倒置放人26-2826-28左右恒温箱内培养。一般左右恒温箱内培养。一般34d34d后后 观察待分离菌生长结果。观察待分离菌生长结果。（7 7）制片观察：制片观察：用无菌操作法自培养皿中选择菌落，挑取少许菌丝及孢用无菌操作法自培养皿中选择菌落，挑取少许菌丝及孢 子，在显微镜下观察。若病组
17、织小块上均长出较为一致的菌落，则子，在显微镜下观察。若病组织小块上均长出较为一致的菌落，则 多半为要分离的病原菌。在无菌条件下，用接种针多半为要分离的病原菌。在无菌条件下，用接种针(铲铲)自菌落边缘自菌落边缘 挑取小块移入斜面培养基挑取小块移入斜面培养基上，在上，在2525左右恒温箱内培养，数日后，左右恒温箱内培养，数日后，观察菌落生长情况，如无杂菌生长，即得该分离病菌纯菌种，便可观察菌落生长情况，如无杂菌生长，即得该分离病菌纯菌种，便可 置于冰箱中保存。置于冰箱中保存。（二）稀释分离法（二）稀释分离法 稀释分离法主要用于在病组织上产生大量孢子的病原菌物。先将待分稀释分离法主要用于在病组织上产
18、生大量孢子的病原菌物。先将待分离的孢子进行梯度稀释后，进行分离培养。离的孢子进行梯度稀释后，进行分离培养。1.1.涂布平板法涂布平板法（1 1）梯度稀释菌悬液：将待分离病原菌配制成菌悬液，再用无菌水作倍比）梯度稀释菌悬液：将待分离病原菌配制成菌悬液，再用无菌水作倍比 稀释。方法：用稀释。方法：用1mL1mL无菌吸管吸取无菌吸管吸取1mL1mL菌悬液注入盛有菌悬液注入盛有9mL9mL无菌水的试管无菌水的试管 中，吹吸中，吹吸3 3次，使充分混匀。然后再用一支次，使充分混匀。然后再用一支1mL1mL无菌吸管从此试管中吸取无菌吸管从此试管中吸取 1mL 1mL注入另一盛有注入另一盛有9mL9mL无菌
19、水的试管中，依此类推，制成无菌水的试管中，依此类推，制成1010-1-1、1010-2-2、1010-3-3、10 10-4-4等稀释度的菌悬液。一般稀释等稀释度的菌悬液。一般稀释3-63-6个梯度。个梯度。（2）涂布：分别用无菌吸管从最后）涂布：分别用无菌吸管从最后3种稀释度的试管中吸取种稀释度的试管中吸取0.1mL菌悬液菌悬液 对号放入平板上，用无菌涂布棒在培养基表面均匀涂布。对号放入平板上，用无菌涂布棒在培养基表面均匀涂布。（3）标记：在培养皿底面标记菌悬液稀释度、分离日期和分离人姓名。）标记：在培养皿底面标记菌悬液稀释度、分离日期和分离人姓名。（4）培养：将培养基平板倒置于）培养：将培
20、养基平板倒置于28恒温箱中培养，一般需要恒温箱中培养，一般需要3-5d3-5d。（5）纯化：观察菌落生长情况，将培养后长出的单个菌落分别移入斜面培纯化：观察菌落生长情况，将培养后长出的单个菌落分别移入斜面培 养基上，纯化步骤同组织分离法。养基上，纯化步骤同组织分离法。2.2.倾注平板法倾注平板法（1 1）取灭菌培养皿）取灭菌培养皿3 3个，平放在湿纱布上，分别编号（个，平放在湿纱布上，分别编号（1 1、2 2、3 3、），并、），并 注明日期、分离材料及分离者姓名。注明日期、分离材料及分离者姓名。（2 2）用灭菌吸管吸取灭菌水，在每一培养皿中分别注入）用灭菌吸管吸取灭菌水，在每一培养皿中分别注
21、入0.5-1.0mL0.5-1.0mL灭菌水。灭菌水。（3 3）用灭菌接种饵从病斑上刮取病菌孢子，放入培养皿内的水滴中，配成）用灭菌接种饵从病斑上刮取病菌孢子，放入培养皿内的水滴中，配成 孢子悬浮液。孢子悬浮液。（4 4）用接种饵蘸一饵孢子悬浮液，与第一个培养皿中的灭菌水混合，再从）用接种饵蘸一饵孢子悬浮液，与第一个培养皿中的灭菌水混合，再从 第一个培养皿移第一个培养皿移3 3饵孢子悬浮液到第二个培养皿中，混合后再移饵孢子悬浮液到第二个培养皿中，混合后再移3 3饵孢饵孢 子悬浮液到第三个培养皿中。每次移菌前，接种饵均需在酒精灯火焰子悬浮液到第三个培养皿中。每次移菌前，接种饵均需在酒精灯火焰 上
22、烧过。上烧过。（5 5）将熔化并冷却到）将熔化并冷却到4545左右的培养基，分别倒在左右的培养基，分别倒在3 3个培养皿中，摇动个培养皿中，摇动 使培养基与稀释的菌落充分混匀，平置冷却凝固。使培养基与稀释的菌落充分混匀，平置冷却凝固。（6 6）将培养皿翻转后放入恒温箱）将培养皿翻转后放入恒温箱26-2826-28中培养，中培养，3-4d3-4d后观察菌落生长情况。后观察菌落生长情况。（7 7）获纯培养后，从菌落边缘挑取菌丝块移入斜面培养）获纯培养后，从菌落边缘挑取菌丝块移入斜面培养3-4d3-4d后，放入冰箱保存。后，放入冰箱保存。（8 8）要获得纯净培养，一般需经）要获得纯净培养，一般需经3 3次稀释分离（重复次稀释分离（重复3 3次），当培养物高度一致次），当培养物高度一致 时才能作为纯培养的菌种保存。时才能作为纯培养的菌种保存。（9 9）真菌的培养。病原真菌多为好气性真菌，在有丰富营养的培养基上能很好）真菌的培养。病原真菌多为好气性真菌，在有丰富营养的培养基上能很好 地生长，但他们对温度的要求差异较大。多数在地生长，但他们对温度的要求差异较大。多数在25-3025-30正常生长，少数正常生长，少数 在在15-2015-20才能正常生长，少数必须在才能正常生长，少数必须在55左右的低温才能萌发。左右的低温才能萌发。
