1、123 1.1 宫颈癌的概况宫颈癌是目前威胁女性健康的主要疾病，在全世界范围内也是导致女性死亡的第二大癌症。世界上每2分钟就有一位妇女死于宫颈癌。我国宫颈癌两率很高，属于最严重的肿瘤之一。（每年有15万新发病例，每年约有10万名妇女死于宫颈癌）。发病年龄一般在4060岁。与公共卫生状况直接相关。上世纪70年代末，Harald zur Hausen首先提出人乳头瘤病毒(HPV)可能是宫颈癌的致癌病毒；1.2 宫颈癌与HPV的研究历程 1977年，Laverty在电镜中观察到宫颈癌活检组织中存在人乳头瘤病毒颗粒；1989年左右，Keerti Shah等发现99.7%99.7%的宫颈癌的宫颈癌与与H
2、PVHPV感染有关感染有关，证实了宫颈癌与HPV感染有直接关系；HPV的感染使宫颈癌的相对危险性增加250倍1995年 国际癌症研究机构(IARC)专题讨论会通过：HPV感染是宫颈癌的主要原因；2005年 IARC/WHO推荐HPV检测可以用于宫颈癌筛查；2008年10月6日公布Harald zur Hausen获诺贝尔生理学或医学奖。哈拉尔德楚尔豪森 1.3 宫颈癌的致病因素性接触传播：丈夫阴茎HPV的存在可使妻子宫颈受染的危险增加9倍；相同的HPV型别可以在性伴侣中检出；与此相反，处女通常是检测不到HPV感染。非性直接接触感染：通过接触病变部位及病人分泌物感染；间接接触：通过病人的衣物和用
3、品感染；母婴传播：在分娩过程中通过产道直接接触传播，还可以通过血液、羊水及胎盘传播，或者可能通过婴儿出生后与携带HPV的母亲密切接触传染。1.4 HPV的传播途径HPV感染潜伏期与发病期低危型HPV感染平均持续时间是4.8个月高危型HPV感染平均持续时间是8个月HPV感染的最常见的结局是没有明显的临床表现，绝大部分会被机体免疫力自动清除只有持续的高危型的HPV感染才会发生癌前病变或宫颈癌。一般平均8-24月可发生轻度、中度和重度的宫颈癌前病变（CIN1、CIN2和CIN3）；再平均5-10年才可发生浸润癌，只要早查早治，是完全可以避免死于宫颈癌的。唯一病因明确唯一病因明确唯一可以早期预防和治疗
4、唯一可以早期预防和治疗唯一可以彻底根除的癌症唯一可以彻底根除的癌症1.5 HPV病毒学知识小环状双链DNA病毒，约8Kb颗粒直径为5055nm，无包膜由72个病毒壳粒包被在自然界中稳定性好，广泛分布较高的种依赖性嗜上皮性，在基底层细胞中潜伏在鳞状上皮细胞中复制、转录和翻译、增殖HPV(human papillomavirus)是一组病毒的总称是一组病毒的总称 早期区(early region,E)含有E1、E2、E4、E5、E6、E7共6 个基因，是维持病毒复制、编码病毒蛋白、维持细胞内病毒的高拷贝数的基因 晚期区(late region,L)长控制区(long control region,
5、LCR)HPV16L1:主要衣壳蛋白，是疫苗研发的主要成分 L2:次要衣壳蛋白，是抗体的主要识别位点E4：结合并破坏中表层细胞角蛋白网，形成中表层细胞的挖空外观HPV 的主要致癌基因n E6 通过抑制p53而阻断凋亡n E7 通过抑制pRB使细胞周期失控E2：负性调节E6和E7，维持凋亡和细胞周期的调控病毒整合时会破坏E2基因的结构，导致失活Xp53 是一种核蛋白，负向调节细胞的生长和分化。是一种核蛋白，负向调节细胞的生长和分化。p53的的降解失活阻碍了细胞对降解失活阻碍了细胞对DNA损伤的反应，由此导致细胞遗损伤的反应，由此导致细胞遗传学性状改变的积累，进而产生恶变的基因型。传学性状改变的积
6、累，进而产生恶变的基因型。pRB是重要的抑癌基因，直接参与细胞周期的调控。是重要的抑癌基因，直接参与细胞周期的调控。pRB功能失效，改变了细胞生长周期的调控机制，使细功能失效，改变了细胞生长周期的调控机制，使细胞永生化，并对恶性病变的防御机制进一步影响。胞永生化，并对恶性病变的防御机制进一步影响。1.6 HPV的侵入、复制和释放侵入：侵入：病毒 微创口微创口 皮肤黏膜表层 感染感染（副）基底层细胞 附加体形式附加体形式 在宿主细胞核内复制复制：复制：依赖于上皮细胞的分化，在基底层上层细胞中开始复制释放：释放：在表皮细胞中完成装配并释放完整病毒颗粒。当表皮细胞脱落时，在皮肤表 面可发现病毒颗粒。
7、1.7 宫颈组织与宫颈组织病变轻度不典型增生(CIN)：中度不典型增生(CIN)重度不典型增生(CIN):是一组病变的统称，包括宫颈不典型增生和原位癌，为宫颈浸润癌的癌前期病变。通常将CIN分为3级，以轻/中/重级不典型增生来区分正常宫颈正常宫颈感染感染清除清除HPV 感染感染演进演进消退消退癌前病变癌前病变癌癌浸润浸润 一过性一过性HPV感染感染持续性持续性HPV感染感染E7E6E2E6E7E2一过性一过性HPV感染感染持续性持续性HPV感染感染LSILHSILCIN CIN CIN Very mild/mild dysplasiaModerate dysplasiaS e v e r e
8、dysplasiaIn situ carcinomaI n v a s i v e carcinomaHPV温和轻微的激活宿主细胞的遗传学变化HPV严重的破坏宿主的遗传学平衡E6和E7低水平的表达，以维持病毒基因组的复制和宿主细胞的生长E6和E7高水平表达，宿主细胞凋亡被阻断，细胞周期失控，宿主细胞开始发生恶变E2负责E6、E7的负调控。保持宿主细胞的分化和成熟；确保能够产生完成的病毒颗粒E2基因在病毒DNA整合入宿主基因组时被破坏，导致失去对E6和E7的负调控的能力在上皮分化的终末阶段L1和L2基因开始表达并组装形成病毒衣壳完整的病毒颗粒从宿主细胞内释放出来大量E4 聚集溶解宿主细胞骨架蛋白
9、呈现挖空细胞的外观在宿主细胞发生恶变时细胞核的异形性：倍体的增多或非整倍体的出现细胞分裂活性：持续增生丧失分化能力：不同程度的细胞不成熟性1.8 HPV感染引起的疾病疾病疾病感染感染HPV型别型别扁平疣扁平疣 3、10、27、28、41寻常疣寻常疣1、2、4、7、27、29、40、54疣状表皮发育不良疣状表皮发育不良 5、8、12、14、15、17、19、25、38、46、47、49、50尖锐湿疣尖锐湿疣6、11、16、18、31、33、34、35、39、51宫颈上皮内瘤宫颈上皮内瘤6、11、16、18、31、33、35、43、44、51、56、58、61浸润性宫颈癌浸润性宫颈癌16、18、3
10、1、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68阴茎癌阴茎癌16、18女阴癌女阴癌16、18 2.1 乳头瘤病毒的分类依据主要以病毒基因组中L1区的DNA同源性作为分类依据：属：病毒全基因组DNA同源性23%43%；同时病毒基因 组L1区DNA同源性在60%以下；种：病毒基因组L1区DNA同源性介于60%70%；型：病毒基因组L1区DNA同源性介于71%89%；亚型及变异株：L1区DNA同源性在90%100%。HPV的型别目前已发现超过型别的人乳头瘤病毒（HPV）。依据与生殖道肿瘤相关性，将HPV分为：2.2 HPV分型检测的意义（1）预测受检者发病的风险度，确定筛查间隔女性感染
11、HPV16或18型患宫颈癌及癌前病变的风险 对丹麦哥本哈根11088名登记在册的妇女进行了为期数年的跟踪随访研究，对受检人群进行了宫颈细胞涂片检查、HPV检测和组织病理检查。该研究中假定连续两次HPV检测阴性的危险系数为1.0，各种持续感染情况的危险系数是其与1.0的比值。Susanne K Kjaer,et al.Type specific persistence of high risk human papillomavirus(HPV)as indicator of high grade cervical squamous intraepithelial lesions in young
12、 women:population based prospective follow up study.BMJ VOLUME 325 14 SEPTEMBER 2002（2）区分持续（重复）感染与一过性感染）区分持续（重复）感染与一过性感染HPV持续感染的危险性评定持续感染情况（相隔2年）致非典型鳞状上皮细胞的危险系数致宫颈低度病变的危险系数致宫颈高度病变的危险系数连续两次检测都为阴性1.01.01.0第一次第二次都为阳性，但感染型别不同16.873.2192.7第一次第二次都为阳性，感染型别至少有一种相同没有病例117.9813.0对巴西1611名妇女在4个月间隔2次检测HPV，HPV16、
13、18持续阳性致HSIL风险性大于其他高危型HPV持续阳性。（Nicolas F.Schlecht,et.al.JAMA.2001;286(24):3106-3114.）宫颈癌的必要条件高危型的HPV感染HPV持续感染（3）区分单一感染和多重感染早期的文献报道，HPV的多重感染与宫颈癌直接相关。现在越来越多的报道发现，HPV的多重感染与宫颈癌之间，不存在显著性的关系。例如：一个病人的HPV检测结果是18、51的多重感染，但随访后18型被免疫清除了，只有51型，由于51型的风险低，那么继续随访并给予相应的干预即可。如果采用定量的方法，两次结果的载量都很高，没有型别的辅助，很容易就会判读为高危亚型持
14、续感染而给予过度的治疗。（4）针对不同型别的感染采取不同的处理方案据统计约有70%以上的生育年龄的妇女都曾有HPV感染90%以上妇女能自动清除HPV感染宫颈癌是一种常见感染的罕见结局相同细胞及组织学类型HPV阳性与阴性要区别对待不同HPV感染型别要区别对待 例如：建议HPV16,18型的患者直接进行阴道镜检查；而对于其他型别的感染，要结合细胞学诊断，一般不需要采取任何治疗方法，但需要按时随访。2.3 HPV分型检测的应用筛查筛查阴道镜适应症阴道镜适应症ASCUS分流分流宫颈病变随访宫颈病变随访指导疫苗的使用指导疫苗的使用（1）筛查从癌前病变发展到宫颈癌需要多年的时间(58年以上)，而且病情的发
15、展具有可逆性。如果筛查和治疗的及时、彻底，病变就会消失，身体恢复健康。反之，就会朝癌症发展。HPV+细胞学阴道镜检查组织学诊断 宫颈病变的三阶梯诊断技术是在国内广泛推行的针对宫颈癌及宫颈癌前病变的规范化诊治流程。由HPV检测、宫颈细胞学、阴道镜与组织病理学组成:宫颈病变的三阶梯诊断宫颈病变的三阶梯诊断筛查方法：敏感性差、假阴性率高（2%50%）、假阳性率高、漏诊多。可重复性差，受阅片人主观影响。敏感度、准确性有所提高 用途广泛 没有改变传统的阅片方式，与人为主观因素直接相关。灵敏度高、特异性强（均高于95%）可预测宫颈癌的风险阴性预测值高（99.9%）HPV和细胞学检测在子宫颈癌筛查中的对比对
16、比项目对比项目HPV DNA检测检测细胞学（巴氏细胞学（巴氏/液基）检测液基）检测检测方法检测方法分子生物学形态学检测病变程度检测病变程度HPV潜伏期、感染期、亚临床期、临床症状期、癌症相关期临床症状期、癌症相关期敏感度敏感度98以上，可以检查出在PAP检测中表现为假阴性的妇女专家水平为80-85阴性预测值阴性预测值99以上，一次检测阴性可3-5年内处于安全期低准确度准确度高低客观性客观性客观的检测方法，不受人为因素的影响，结果可靠。主观检测方法，无法避免主观的人为因素的干扰，结果有一定的可疑性。重复性重复性目前重复性最好的HPV检测因取材、制片、阅片等客观因素的影响，重复性差。经济效益经济效
17、益阴性者不用多次重复检查，因此是最经济的检测。需多次重复检查，经济与心理负担过重检测风险检测风险低，给医生可靠的依据，给患者安心的答复高面临医疗纠纷最佳筛查方案一般筛查方案2006/11 第18届FIGO会议正式提出：现在的各种细胞学技术与巴氏涂片相比并没有提高宫颈癌的早期检出率；在WHO的协调下，南非和美国的研究提示，有条件的地区应以为首选。HPV-DNA检测检测阴性阴性阳性阳性筛查筛查 1次次/35年年液基细胞学检查液基细胞学检查筛查，筛查，1次次/6月月1年年正常正常异常异常阴道镜阴道镜/组织学检查组织学检查16+/18+2006 consensus guidelines for man
18、agement of women with abnormal cervical cancer screening tests www.AJOG.ORG推荐的子宫颈癌筛查方案适合筛查的人群任何有三年以上性行为或21岁以上有性行为的妇女均为筛查对象（因为21岁以下子宫颈癌患者极为罕见，而且从HPV感染到CIN需要3-8年时间)高危人群：有多个性伴侣、性生活过早、HIV/HPV感染、免疫功能低下、卫生条件差/性保健知识缺乏的妇女对决定妊娠的妇女，在妊娠前应进行HPV检查（2）阴道镜适应症波特兰的一项研究表明，30岁细胞学阴性的女性中，HPV16或18阳性的女性在10年随访中出现CIN3的比率分别为2
19、1%和18%。与此相比，其他高危型HPV阳性的女性中，CIN3的风险性仅1.5%。不同型别致CIN3的风险不同。2009年，美国阴道镜和宫颈病理学会（简称年，美国阴道镜和宫颈病理学会（简称ASCCP）发布了发布了HPV 基因分型检测指南，明确指出基因分型检测指南，明确指出:30妇女，妇女，细胞学未见上皮内病变和恶性细胞，细胞学未见上皮内病变和恶性细胞，HPV16，18建议建议阴道镜；其他阴道镜；其他HPV高危型，则在高危型，则在12个月后重复个月后重复HPV DNA检测和细胞学检查。（检测和细胞学检查。（American Society for Colposcopy and Cervical
20、Pathology,2009）（3）ASCUS分流（atypical squamous cells of unknown significance诊断意义不明的不典型鳞状上皮细胞）直接阴道镜检查或多点病理活检，引起创伤和过度诊治（40-60%）重复细胞学检查，有25%失访率，此外复检会增加病人经济及精神负担457例细胞学诊断为ASCUS/LSIL，进行HPV检测和活检：LSIL且高危HPV阳性者，22.7%为CIN II/III；LSIL但高危HPV阴性者，仅1%为CIN II/III。Lee Nak-Woo,et al.,Is the Human Papillomavirus Test in
21、 Combination With the Papanicolaou Test Useful for Management of Patients With Diagnoses of Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance/Low-Grade Squamous Intraepithelial Lesions?Arch Pathol Lab Med,2001,125:1453 HPV检测为目前的检测为目前的最优方法最优方法。HPV检测阴性，可列入常规筛查人群；检测阴性，可列入常规筛查人群；HPV检测阳性，则考虑配合阴道镜检查。检测
22、阳性，则考虑配合阴道镜检查。（4）宫颈病变随访据瑞典的一项研究，针对完成宫颈锥切术后，术后随访结果有26例CIN复发；22例未复发。术后3个月用PCR方法检测宫颈细胞涂片HPV，其中：26例复发者：25例为HPV阳性 22例对照组：全部为HPV阴性实验说明：宫颈病变治疗后检测HPV-DNA，可预测残余病变、估计疗效。Chua,K.L.,Hjerpe,A.Human papillomavirus analysis as a prognostic marker following conization of the cervix uteri.Gynecol Oncol,1997,66(1):108
23、-113术后术后HPV-DNA检测检测阴性阴性阳性阳性病灶切除干净或病灶切除干净或没有再次感染没有再次感染相同基因型相同基因型新的新的HPV感染感染有残留病灶或有残留病灶或重复感染重复感染不同基因型不同基因型宫颈病变治疗后的随访宫颈病变治疗后的随访（5）指导疫苗的使用 HPV感染后可以激发机体产生特异性体液免疫和细胞免疫 针对衣壳蛋白（L1）的IgG和IgA中和抗体在病毒感染的早期较为重要-预防性疫苗 针对早期蛋白（E6E7）的细胞免疫反应对最终清除病毒可能更为重要-治疗性疫苗默沙东：Gardasil（6、11、16、18）43.94%葛兰素史克：Cervarix（16、18）26.47%约约
24、200种种HPV中国HPV数据库的目的和意义v 收集积累HPV不同型别感染数据和中国HPV基因研究资料，形成具有中国特色的开放数据平台。v 应用网络信息技术，对HPV流行趋势开展长期监测。v 积极探索HPV与宿主、基因多态性及与肿瘤的发生发展演变的关系。v 解决宫颈癌的发生、发展、转瘤等重大科学问题。v 指导适合中国人群HPV治疗性和预防性疫苗的研制。v 为制定宫颈癌相关的公共卫生政策提供理论基础。属于分子医学范畴，是。具有高灵敏度、高特异性的特点。3.1 实验原理将PCR和低密度基因芯片技术结合成综合工作平台，具有高效、快速、灵敏、准确的特点。3.2 宫颈细胞样本的采集月经期不可采集标本。（
25、减少给受检者的损伤）月经正常妇女，在月经来潮后1018天为最佳检查时间不可在碘试验和醋酸试验之后采集样本。（可能会抑制PCR反应）检查前48小时内不要作阴道冲洗，不要用避孕药膏等阴道内用药物。（可能会抑制PCR反应）检查前48小时最好不要行性生活。（一过性假阳性）样本采集后，注意避免交叉污染。u子宫颈的鳞状上皮细胞与柱状上皮细胞的连接处（转化带，Transformation Zone）是HPV的易感部位。uHPV-DNA检测样本是子子宫颈转化带的脱落细胞宫颈转化带的脱落细胞。被检者脱掉裤子，然后按医生指示仰卧于一张检查床上。由医生以窥阴器或阴道张开器暴露宫颈。然后使用专用的置于宫颈口采集标本。
26、（最好在取样前先用棉签擦去宫颈分泌物）将专用宫颈刷置于宫颈口，轻轻搓动宫颈刷使其旋转5圈。慢慢取出宫颈刷，将其放入标有病人编号的取样管中，取样管内已加有专用细胞保存液，折断其刷头入管中，拧紧瓶盖。样品收集中注意事项：取样管上标签的名称须与患者一一对应。使用凯普专用取样器及保存液，可抑制细菌生长，保持DNA完整性。宫颈保存系统包装打开后，必须立即进行采样，并连同刷头置于取样管中。样本收集中为保留足够的宫颈细胞标本，注意切勿将宫颈刷头丢弃。宫颈刷头折断、试验取样时，请小心操作，切忌大力震荡取样管，造成试剂及样本溅出影响检测结果或造成污染。取样后，切记拧紧取样管管盖。样本保存样本一经采集，则应尽可能
27、快的送至检测实验室。如若不能马上送检样本，请于4保存，并在2个星期之内进行检测。3.3 实验步骤（以21分型为例）生物素点生物素点：主要监控所采用的杂交杂交体系是否有效；IC点：点：排除由于PCR抑制抑制导致的假阴性实验结果。2）阶段性结果（至2011年6月底共筛查了54185例）HPV感染率：感染率最高分布在4044岁。HPV6（1.38%）HPV11（1.09%）HPV16（17.60%）HPV18（7.06%），四者合起来的感染率为27.1%，不到三成。单纯感染率（65.4%），多重感染率（34.6%），其中三重以上感染率为（7.98%）。双重感染以16/52更为常见，所有的型别都检测到
28、，每一个型别都存在合并感染。全市感染率（7.80%），感染亚型前五位分别是：HPV52、16、58、68、33。各区县感染型别的排列顺序略有不同。在不同年龄组中HPV感染率不同，4044岁感染率最高（22.77%）；不同年龄组感染的不同HPV型别的比例也略有差异。结果参照毛玲芝教授潮州宫颈癌筛查模式经验总结 HPV52为感染率最高的亚型，但致癌性不强，在CIN2以上的病变中不常见；而16、18型在CIN3以上病变中更为常见。在CIN2以上病变中，以单一感染为主，多重感染并不常见。高危型HPV检测相对于细胞学检测，有更高的灵敏度和特异度；液基细胞学检测相对于巴氏涂片细胞学检测有更高的灵敏度和更好的制片效果。结果参照毛玲芝教授潮州宫颈癌筛查模式经验总结
