1、第三章第三章 培养基的配制及灭菌培养基的配制及灭菌一、培养基及其作用：一、培养基及其作用：是向植物细胞提供营养是向植物细胞提供营养的场所。其作用是向植物细胞提供所需的各种的场所。其作用是向植物细胞提供所需的各种营养；调节渗透压、酸碱度；供给水分。固体营养；调节渗透压、酸碱度；供给水分。固体培养基还起着支撑作用。培养基还起着支撑作用。培养基多以命名人的名字命名。培养基多以命名人的名字命名。目前，比较流行的培养基有：目前，比较流行的培养基有：vMSMS培养基，其特点是无机盐和离子浓度较高；培养基，其特点是无机盐和离子浓度较高；vB5B5培养基，其特点是含有较低的铵；培养基，其特点是含有较低的铵；v
2、WhiteWhite培养基，其特点是无机盐低，适于生根；培养基，其特点是无机盐低，适于生根；vN6N6培养基，其特点是培养基，其特点是KNOKNO3 3和和(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4含量较高，适于花药培含量较高，适于花药培养；养；vKMKM8P8P培养基，其特点是有机成分较多，适于原生质体培养。培养基，其特点是有机成分较多，适于原生质体培养。二、培养基的成分：二、培养基的成分：主要可以分水、主要可以分水、无机盐、无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。类。1 1、水：、水：植物原生质体的组成成分，代谢过程的介质和溶媒。植物原
3、生质体的组成成分，代谢过程的介质和溶媒。大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，防止贮藏过程发霉变质。水，防止贮藏过程发霉变质。、无机元素：、无机元素：大量元素，指浓度大于大量元素，指浓度大于0.5mmol/l0.5mmol/l的元素，有的元素，有N N、P P、K K、CaCa、MgMg、S S等。其作用是：等。其作用是：(1)(1)氮：氮：是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分。供应的氮化物有硝酸铵、硫酸铵、硝酸钾碱等的组成成分。供应的氮化物有硝酸铵、硫酸铵、硝酸
4、钾等。有时，也添加氨基酸来补充氮素。等。有时，也添加氨基酸来补充氮素。(2)(2)磷：磷：是生物膜、核苷酸（是生物膜、核苷酸（如如ATPATP）、核酸的重要组成部）、核酸的重要组成部分。常用于培养基的磷化物有分。常用于培养基的磷化物有H H2 2POPO4 4或或aHaH2 2POPO4 4等。等。(3)(3)钾：钾：对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。制备培养基时，常以关系。制备培养基时，常以KClKCl、KNOKNO3 3等盐类提供。等盐类提供。(4)Mg(4)Mg、S S和和CaCa：MgMg是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；
5、是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；S S是含是含S S蛋白质的组成成分。它们常以蛋白质的组成成分。它们常以MgSOMgSO4 47H7H2 2O O提供。提供。CaCa是构成细胞壁的一种成分，是构成细胞壁的一种成分，CaCa对细胞分裂、保护质膜对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用，常以不受破坏有显著作用，常以CaClCaCl2 22H2H2 2O O提供。提供。(5)(5)微量元素：微量元素：指小于指小于0.5mmol/l0.5mmol/l的元素，的元素，FeFe、B B、MnMn、CuCu、MoMo、CoCo等。等。FeFe是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组是一些氧化酶、细
6、胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。在制做培养基时常用成成分。在制做培养基时常用FeSOFeSO4 47H7H2 2O O和和a a2 2-EDTAEDTA结合成螯合物使用。结合成螯合物使用。B B、MnMn、ZnZn、CuCu、MoMo、CoCo等，也是植物组织培养中不可等，也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长，分裂异常。缺少的元素，缺少这些物质会导致生长，分裂异常。这些整株植物生长所必需的营养元素，对这些整株植物生长所必需的营养元素，对于植物组织培养来说也是必需的。当某些营养元素供于植物组织培养来说也是必需的。当某些营养元素供应不足时，愈伤组织表现出一定的缺素症状。如
7、应不足时，愈伤组织表现出一定的缺素症状。如缺氮，缺氮，会表现出一种花色素苷的颜色，不能形成导管；会表现出一种花色素苷的颜色，不能形成导管；缺铁，缺铁，细胞停止分裂；细胞停止分裂；缺硫，缺硫，表现出非常明显的褪绿；表现出非常明显的褪绿；缺锰缺锰或钼，或钼，则影响细胞的伸长。则影响细胞的伸长。3 3、有机化合物：、有机化合物：培养基中若只含有大量元素与微量元培养基中若只含有大量元素与微量元素，常称为基本培养基。为不同的培养目的往往要加素，常称为基本培养基。为不同的培养目的往往要加入一些有机物以利于快速生长。常加入的有机成分主入一些有机物以利于快速生长。常加入的有机成分主要有以下几类：要有以下几类：
8、(1)(1)碳水化合物：碳水化合物：最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源，可支持许多组织很好的生长。也是较好的碳源，可支持许多组织很好的生长。(2)(2)维生素维生素(Vitamin)(Vitamin)：维生素类化合物在植物细胞里主要是维生素类化合物在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多项代谢活动，对生长、分化等有很以各种辅酶的形式参与多项代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。主要有：好的促进作用。主要有：VB1(VB1(盐酸硫胺素盐酸硫胺素)：对愈伤组织的产生和生活力有重要对愈伤组织的产生和生活力有重要作用。作用。VB6(VB6(盐酸吡哆醇盐酸
9、吡哆醇)：能促进根的生长。能促进根的生长。VPP(VPP(烟酸烟酸)：与植物代谢和胚的发育有一定关系。与植物代谢和胚的发育有一定关系。VC(VC(抗坏血酸抗坏血酸)：有防止组织变褐的作用。有防止组织变褐的作用。(3)(3)肌醇：肌醇：又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。用于构建细胞壁。使用肌醇能促进愈伤组要作用。用于构建细胞壁。使用肌醇能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、繁殖、分化有促进作用。分化有促进作用。(4)(4)氨基酸：氨基酸：是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收是很好的有机
10、氮源，可直接被细胞吸收利用。培养基中常用甘氨酸。有时用水解乳蛋白或利用。培养基中常用甘氨酸。有时用水解乳蛋白或水解酪蛋白，由于它们营养丰富，极易引起污染。水解酪蛋白，由于它们营养丰富，极易引起污染。如在培养中无特别需要，以不用为宜。如在培养中无特别需要，以不用为宜。(5)(5)天然复合物：天然复合物：其成分比较复杂，大多含氨基酸、激其成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用。分化有明显的促进作用。椰乳：椰乳：它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用香蕉：香蕉：主要在
11、兰花的组织培养中应用，对发育有促进主要在兰花的组织培养中应用，对发育有促进作用。作用。马铃薯：马铃薯：添加后可得到健壮的植株。添加后可得到健壮的植株。水解酪蛋白：水解酪蛋白：为蛋白质的水解物，主要成分为氨基酸。为蛋白质的水解物，主要成分为氨基酸。其它：其它：酵母提取液、麦芽提取液等。酵母提取液、麦芽提取液等。4 4、植物激素：、植物激素：在培养基的各成分中，植物激素是培养基的关在培养基的各成分中，植物激素是培养基的关键物质，键物质，对植物组织培养起着决定性作用。对植物组织培养起着决定性作用。(1)(1)生长素类：生长素类：在组织培养中，生长素主要被用于诱导愈伤组在组织培养中，生长素主要被用于诱
12、导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。IAA(IAA(吲哚乙酸吲哚乙酸)是天然存在的生长素，亦可人工合成，是天然存在的生长素，亦可人工合成，其活力较低其活力较低,是生长素中活力最弱的激素，是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副对器官形成的副作用小，高温高压易被破坏，也易被细胞中的作用小，高温高压易被破坏，也易被细胞中的IAAIAA分解酶降分解酶降解，受光也易分解。解，受光也易分解。NAA(NAA(萘乙酸萘乙酸)在组织培养中的起动能力要比在组织培养中的起动能力要比IAAIAA高出高出3 34 4倍，且由于可大批量人工合成，倍，且由于
13、可大批量人工合成，耐高温耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。IBA(IBA(吲哚丁酸吲哚丁酸)是促进发根能力较强的生长是促进发根能力较强的生长调节物质。调节物质。2,4-D2,4-D（2,42,4二氯苯氧乙酸）二氯苯氧乙酸）起动能力比起动能力比IAAIAA高高1010倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。生长素配制时可先用少量生长素配制时可先用少量9595酒精助溶。酒精助溶。2,4-D2,4-D可用可用0.1mol/l0.1mol/
14、l的的NaOHNaOH或或KOHKOH助溶。生长素常配助溶。生长素常配成成1mg/ml1mg/ml的溶液贮于冰箱中备用。的溶液贮于冰箱中备用。(2)(2)赤霉素赤霉素(GA)(GA)：培养基中添加的是培养基中添加的是GA3GA3，主要用于刺，主要用于刺激在培养中形成的不定胚发育成小植株，促进幼苗激在培养中形成的不定胚发育成小植株，促进幼苗茎的伸长生长。一般在器官形成后，添加赤霉素可茎的伸长生长。一般在器官形成后，添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。促进器官或胚状体的生长。赤霉素溶于酒精，配制时少量可用赤霉素溶于酒精，配制时少量可用9595酒精酒精助溶。赤霉素不耐热，高压灭菌后将有助溶。赤霉素不
15、耐热，高压灭菌后将有7070100100失失效，应当采用过滤灭菌法加入。效，应当采用过滤灭菌法加入。(3)(3)细胞分裂素类：细胞分裂素类：这类激素是腺嘌呤的衍生物，包这类激素是腺嘌呤的衍生物，包括括6-BA(66-BA(6苄基氨基嘌呤苄基氨基嘌呤)、Kt(Kt(激动素激动素)、ZT(ZT(玉米素玉米素)等。其中等。其中ZTZT活性最强，但非常昂贵。常用的是活性最强，但非常昂贵。常用的是6-BA6-BA。在培养基中添加细胞分裂素有三个作用：在培养基中添加细胞分裂素有三个作用：诱导芽的分化促进侧芽萌发生长。诱导芽的分化促进侧芽萌发生长。促进细胞分裂与扩大。促进细胞分裂与扩大。抑制根的分化。抑制根
16、的分化。因此，细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化、茎、因此，细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化、茎、苗的增殖，而避免在生根培养时使用。苗的增殖，而避免在生根培养时使用。5 5、培养材料的支持物、培养材料的支持物(1)(1)琼脂：琼脂：在固体培养时琼脂是最好的固化剂。固体培养在固体培养时琼脂是最好的固化剂。固体培养基利于组织置于培养基表面。琼脂是一种由海藻中提基利于组织置于培养基表面。琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。(2)(2)其它：其它：有玻璃纤维、滤纸桥、海绵等，总的要求是排有玻璃纤维、滤纸桥、海绵等，总的要求是排出的有
17、害物质对培养材料没有影响或影响较小。出的有害物质对培养材料没有影响或影响较小。、抗生物质：、抗生物质：抗生物质有青霉素、链霉素、庆大霉素等，抗生物质有青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在用量在5 520mg/l20mg/l之间。添加抗生物质可防止菌类污染。之间。添加抗生物质可防止菌类污染。7 7、抗氧化物：、抗氧化物：植物组织在切割时会溢泌一些酚类物质，植物组织在切割时会溢泌一些酚类物质，接触空气中的氧气后，自动氧化或由酶类催化氧化为接触空气中的氧气后，自动氧化或由酶类催化氧化为相应的醌类，产生可见的茶色、褐色以致黑色，这就相应的醌类，产生可见的茶色、褐色以致黑色，这就是酚污染。这些物质渗出细胞
18、外就造成自身中毒，使是酚污染。这些物质渗出细胞外就造成自身中毒，使培养的材料生长停顿，失去分化能力，最终变褐死亡。培养的材料生长停顿，失去分化能力，最终变褐死亡。v抗酚类氧化常用的药剂有半胱氨酸及抗酚类氧化常用的药剂有半胱氨酸及VcVc，可用，可用5050200mg/l200mg/l的浓度洗涤刚切割的外植体伤口表面，或过滤的浓度洗涤刚切割的外植体伤口表面，或过滤灭菌后加入固体培养基的表层。其它抗氧化剂有二硫灭菌后加入固体培养基的表层。其它抗氧化剂有二硫苏糖醇、谷胱甘肽、硫乙醇、抗坏血酸及二乙基二硫苏糖醇、谷胱甘肽、硫乙醇、抗坏血酸及二乙基二硫氨基甲酸酯等。氨基甲酸酯等。8 8、活性炭：、活性炭
19、：活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉沫结构，活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉沫结构，它结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用，它结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用，它的颗粒大小决定着吸附能力、粒度越小，吸附能力它的颗粒大小决定着吸附能力、粒度越小，吸附能力越大。它可以吸附培养基中的有害物质，包括琼脂中越大。它可以吸附培养基中的有害物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物在培养过程中分泌的酚、醌类物所含的杂质，培养物在培养过程中分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的质以及蔗糖在高压消毒时产生的5 5羟甲基糖醛。羟甲基糖醛。v茎尖初代培养，加入适量活性炭，可以吸附外植体产茎尖初代培养，加
20、入适量活性炭，可以吸附外植体产生的致死性褐化物，其效力优于生的致死性褐化物，其效力优于VCVC和半胱氨酸。和半胱氨酸。v在新梢增殖阶段，活性炭可明显促进新梢的形成和伸在新梢增殖阶段，活性炭可明显促进新梢的形成和伸长。长。v活性炭在生根时有明显的促进作用，其机理一般认为活性炭在生根时有明显的促进作用，其机理一般认为与活性炭减弱光照有关。与活性炭减弱光照有关。v在使用活性炭时，要注意其吸附有害物质和吸附生长在使用活性炭时，要注意其吸附有害物质和吸附生长调节物的二重性，尤其是当较高的活性炭足以能抵消调节物的二重性，尤其是当较高的活性炭足以能抵消生长调节物的作用时，应注意调整好活性炭与生长调生长调节物
21、的作用时，应注意调整好活性炭与生长调节物等培养基成分的用量，使其皆能发挥作用。在使节物等培养基成分的用量，使其皆能发挥作用。在使用时要有其量的意识，使活性炭发挥其积极作用。用时要有其量的意识，使活性炭发挥其积极作用。二、母液的配制和保存二、母液的配制和保存1 1、所谓母液是欲配制液的浓缩液，这可保证各物质成分、所谓母液是欲配制液的浓缩液，这可保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取，并便于低温保藏。的准确性及配制时的快速移取，并便于低温保藏。一般配成比所需浓度高一般配成比所需浓度高1010100100倍的母液。倍的母液。母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、母液配制时可分别配成大量元素、微量
22、元素、铁盐、有机物和激素类等。铁盐、有机物和激素类等。v配制培养基时，为便于保存，提高效率，通常先配制配制培养基时，为便于保存，提高效率，通常先配制母液。即配成：母液。即配成：v大量元素大量元素1010倍液，定容至倍液，定容至1000ml1000ml；v微量元素微量元素100100倍液，定容至倍液，定容至1000ml1000ml；v铁盐铁盐100100倍液，定容至倍液，定容至1000ml1000ml；v维生素维生素1mg/l1mg/l，定容至，定容至100ml100ml；v激素激素1mg/l1mg/l，定容至，定容至5050100ml100ml。2 2、配制时注意一些离子之间易发生沉淀，如、配
23、制时注意一些离子之间易发生沉淀，如a a 2 2和和SOSO4 4 2 2 ，a a 2 2 、g g 2 2和和POPO4 4 3 3一起溶解后，会产生沉淀，一定要一起溶解后，会产生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中。配制母液时要用蒸馏水或重蒸馏水。充分溶解再放入母液中。配制母液时要用蒸馏水或重蒸馏水。药品应选取等级较高的化学纯或分析纯。药品的称量及定容药品应选取等级较高的化学纯或分析纯。药品的称量及定容都要准确。各种药品先以少量水让其充分溶解，然后依次混都要准确。各种药品先以少量水让其充分溶解，然后依次混合。合。3 3、一般配成大量元素、微量元素、铁盐、维生素等、一般配成大量元素、微量元素、
24、铁盐、维生素等母液，其中维生素、氨基酸类可以分别配制，也可母液，其中维生素、氨基酸类可以分别配制，也可以混在一起。母液配好后放入冰箱内低温保存，用以混在一起。母液配好后放入冰箱内低温保存，用时再按比例稀释。时再按比例稀释。1 1、MSMS培养基母液的制备培养基母液的制备 2 2、MSMS培养基的配制培养基的配制 上述内容见实验指导：实验二、实验三上述内容见实验指导：实验二、实验三三、三、MSMS培养基的分装与灭菌培养基的分装与灭菌 1 1、培养基分装到、培养基分装到100ml100ml的培养瓶中，用量一般为每瓶的培养瓶中，用量一般为每瓶303040ml40ml，过多造成浪费，过少则不利于植物的
25、生长。过多造成浪费，过少则不利于植物的生长。2 2、培养基的灭菌：、培养基的灭菌：（1 1）灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内）灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。消毒是指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不消毒是指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用，显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌的厚再发生危害作用，显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死，即消毒后的环境里、物品上还有活垣孢子等不会完全杀死，即消毒后的环境里、物品上还有活着的微生物
26、。着的微生物。v这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其它微生物。它微生物。菌的特点是：极小，肉眼看不见。菌的特点是：极小，肉眼看不见。无处不无处不在，无时不有，无孔不入。在，无时不有，无孔不入。在自然条件下忍耐力强，在自然条件下忍耐力强，生活条件要求简单，繁殖力极强，条件适宜时便可大生活条件要求简单，繁殖力极强，条件适宜时便可大量滋生。量滋生。v无菌的范畴是：无菌的范畴是：v经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体。经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体。v经其它物理的或化学的灭菌方法处理后的物体经其它物理的或化学的灭菌方法处理后的物体(当然这些方当
27、然这些方法必须已经证明是有效的法必须已经证明是有效的)。v高层大气、岩石内部。高层大气、岩石内部。v健康的动、植物的不与外部接触的组织内部。健康的动、植物的不与外部接触的组织内部。v强酸强碱，化学元素灭菌剂等表面和内部等等都是无菌的。强酸强碱，化学元素灭菌剂等表面和内部等等都是无菌的。从以上可以看出：在地球表面无菌世界要比有菌世界小得从以上可以看出：在地球表面无菌世界要比有菌世界小得多。多。2 2、常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类：、常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类：物理方法如干热物理方法如干热(烘烧和灼烧烘烧和灼烧)、湿热、湿热(常压或高压常压或高压蒸煮蒸煮)、射线处理、射线处理
28、(超声波、微波超声波、微波)、过滤、清洗和大量无菌、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施。水冲洗等措施。化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。适当选用。1 1、培养基用湿热灭菌：培养基在制备后的、培养基用湿热灭菌：培养基在制备后的24h24h内完成灭菌内完成灭菌工序。工序。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力
29、上升到力上升到0.05MPa0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到上升达到0.1MPa0.1MPa时，开始计时，维持压力时，开始计时，维持压力0.10.10.15MPa 0.15MPa 2020分钟。分钟。v对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种用具，可以延长灭菌时间或提高压力。而培养基接种用具，可以延长灭菌时间或提高压力。而培养基要严格遵守保压时间，既要保压彻底，又要防止培养要严格遵守保压时间
30、，既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间。基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间。v对于一些布制品，如实验服、口罩等也可用高压灭菌。对于一些布制品，如实验服、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌202030min30min。v高压灭菌前后的培养基，其高压灭菌前后的培养基，其pHpH值下降值下降0.20.20.3 0.3 单位。单位。v高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖，从而改高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖，从而改变培养基的渗透压。变培养基的渗透压。在在8 82020蔗糖范围内，高压灭
31、蔗糖范围内，高压灭菌后的培养基约升高菌后的培养基约升高0.430.43倍。倍。v培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，可使培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，可使15152525的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。培养基的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。培养基pHpH值小于值小于5.55.5，其水解量更多，培养基中添加，其水解量更多，培养基中添加0.10.1活活性碳时，高压下蔗糖水解大大增强，添加性碳时，高压下蔗糖水解大大增强，添加1 1活性碳，活性碳，蔗糖水解率可达蔗糖水解率可达5 5。为防止高压灭菌产生的上述一些变化可用下列方法：为防止高压灭菌产生的上述一些变化可用下列方法：(1)(1)经常注意搜集有
32、关高压灭菌影响培养基成分的资料，以经常注意搜集有关高压灭菌影响培养基成分的资料，以便及时采取有效措施。便及时采取有效措施。(2)(2)设计培养基配方时尽量采用效果类似的稳定试剂并准确设计培养基配方时尽量采用效果类似的稳定试剂并准确掌握剂量。如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇，以掌握剂量。如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇，以IBAIBA代替代替IAAIAA，控制活性炭的用量，控制活性炭的用量(在在0.10.1以下以下)注意注意pHpH值对高值对高压灭菌下培养基中成分的影响等。压灭菌下培养基中成分的影响等。(3)(3)配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序。配制培养基时应注意成分的适当分组与加
33、入的顺序。如将磷、钙和铁放在最后加入。如将磷、钙和铁放在最后加入。(4)(4)注意高压灭菌后培养基注意高压灭菌后培养基pHpH的变化及回复动态。如高压的变化及回复动态。如高压灭菌后的灭菌后的pHpH值常由值常由5.805.80升高至升高至6.486.48。而。而96h96h后又回降至后又回降至5.85.8左右。这样在实验中就可以根据这一规律加以掌握。左右。这样在实验中就可以根据这一规律加以掌握。2 2、用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌、用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌3 3、玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌、玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌4 4、不耐热的物质采用过滤灭菌、不耐热的物质采用过滤灭菌5
34、5、空间采用紫外线和熏蒸灭菌、空间采用紫外线和熏蒸灭菌实验二实验二 培养基（培养基（MSMS）母液的配制）母液的配制【目的】【目的】(5(5分分)了解培养基母液的配制方法和注意事项；掌了解培养基母液的配制方法和注意事项；掌握培养基的配制及灭菌方法，为植物愈伤组织诱导准握培养基的配制及灭菌方法，为植物愈伤组织诱导准备培养基。备培养基。【原理】【原理】(15(15分分)对植物外植体进行离体培养时，培养基提对植物外植体进行离体培养时，培养基提供生长所需的营养成分等。培养基的主要成分包括无供生长所需的营养成分等。培养基的主要成分包括无机营养物、碳源、维生素、植物生长物质和有机附加机营养物、碳源、维生素
35、、植物生长物质和有机附加物等。物等。配制培养基通常都按配方浓度的若干倍配制培养基通常都按配方浓度的若干倍称量，配制成一系列的母液置于冰箱保存，使用时称量，配制成一系列的母液置于冰箱保存，使用时按比例稀释。一般要配下列母液：大量元素母液、按比例稀释。一般要配下列母液：大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、植物生长物质母液、有微量元素母液、铁盐母液、植物生长物质母液、有机化合物母液。机化合物母液。【实验用品】【实验用品】(10(10分分)1 1器具：电子天平、冰箱、器具：电子天平、冰箱、pHpH试纸、烧杯、量筒、试剂瓶、试纸、烧杯、量筒、试剂瓶、三角瓶、洗耳球、刻度吸管、洗瓶。三角瓶、洗耳球、刻度
36、吸管、洗瓶。2 2试剂：硝酸钾、硝酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、试剂：硝酸钾、硝酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸锰、硫酸锌、硼酸、碘化钾、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、硫酸锰、硫酸锌、硼酸、碘化钾、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁、甘氮酸、盐酸硫胺素、盐酸乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁、甘氮酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素、肌醇、吡哆素、肌醇、2,4-D2,4-D、6-BA6-BA、1 mol1 molL L盐酸、盐酸、1 mol1 molL L氢氢氧化钠。氧化钠。【实验方法】【实验方法】(30(30分，含操作过程分，含操作过程)1 1MSMS培养基母液配制培养基母液配制1 1）、
37、大量元素母液配制）、大量元素母液配制(1)(1)按培养基配方按培养基配方(表表2-1)2-1)所列大量元素成分所列大量元素成分(NH4N03(NH4N03、KN03KN03、KH2PO4KH2PO4、MgSO47H2OMgSO47H2O和和CaCl22H2O)CaCl22H2O)，取相应，取相应的分析纯化学试剂。的分析纯化学试剂。(2)(2)将将1 L1 L培养基所需各种大量元素扩大培养基所需各种大量元素扩大1010倍，分别用倍，分别用100 mL100 mL烧杯，在电子天平上进行实际称量。烧杯，在电子天平上进行实际称量。(3)(3)在盛有在盛有1 1种元素的烧杯中，加入约种元素的烧杯中，加入
38、约10mL10mL蒸馏水，放置蒸馏水，放置在磁力搅拌器上充分溶解后转至另一烧杯中。按同样在磁力搅拌器上充分溶解后转至另一烧杯中。按同样步骤分别溶解各种大量元素后，与第步骤分别溶解各种大量元素后，与第1 1种大量元素溶液种大量元素溶液混合。混合。(4)(4)混合液倒人混合液倒人1000 mL1000 mL容量瓶中定容后，转入试剂瓶中，容量瓶中定容后，转入试剂瓶中，贴上标签贴上标签(注明配制时间、扩大培数、配制人员姓名注明配制时间、扩大培数、配制人员姓名)，母液贮存于母液贮存于2 244的冰箱中。的冰箱中。微量元素母液、铁盐母液、植物生长物质母微量元素母液、铁盐母液、植物生长物质母液、有机化合物母
39、液的配制由老师负责。液、有机化合物母液的配制由老师负责。【思考题】【思考题】1 1、目前，常用的培养基有哪些？各有什么特点？、目前，常用的培养基有哪些？各有什么特点？(10(10分分)2 2、培养基包括哪些成分？各有什么作用和适宜浓度范围？、培养基包括哪些成分？各有什么作用和适宜浓度范围？(10(10分分)3 3、配制培养基母液时应注意什么问题？、配制培养基母液时应注意什么问题？(10(10分分)4 4、怎样进行培养基的湿热灭菌？、怎样进行培养基的湿热灭菌？(10(10分分)实验三实验三 培养基（培养基（MSMS）配制与灭菌）配制与灭菌【目的】（【目的】（2 2分）分）学习培养基配制与灭菌方法
40、学习培养基配制与灭菌方法【原理】【原理】（1515分）分）凡是暴露在凡是暴露在(未经处理的未经处理的)空气中的物体，曾经接触空气中的物体，曾经接触过自然水源的物体都是有菌的。培养基中含有大量的有机物，过自然水源的物体都是有菌的。培养基中含有大量的有机物，特别是含糖量较高，是微生物滋生、繁殖的极好场所。而接特别是含糖量较高，是微生物滋生、繁殖的极好场所。而接种材料需要在无菌得件下培养很长的时间，如果培养基被微种材料需要在无菌得件下培养很长的时间，如果培养基被微生物所污染，便达不到培养的预期结果。生物所污染，便达不到培养的预期结果。因此，培养基的灭菌，是植物组织培养中十分重因此，培养基的灭菌，是植
41、物组织培养中十分重要的环节。培养基灭菌的方法有多种，本实验田采用高要的环节。培养基灭菌的方法有多种，本实验田采用高压蒸气灭菌法（即湿热灭菌。原理是：在密闭的蒸锅内，压蒸气灭菌法（即湿热灭菌。原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在提高，从而锅内温度也随之增加。在0.10MPa0.10MPa的压力下，的压力下，锅内温度达锅内温度达121121。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。细菌及其高度耐热的芽孢。【实验用品】【实验用品】（3
42、3分）分）1 1器具：台秤、烧杯、量筒、三角瓶、移液管、玻璃漏器具：台秤、烧杯、量筒、三角瓶、移液管、玻璃漏斗、玻璃棒、玻璃铅笔、斗、玻璃棒、玻璃铅笔、pHpH值试纸、洗耳球、线绳、值试纸、洗耳球、线绳、包头纸、石棉网、洗瓶。包头纸、石棉网、洗瓶。2 2试剂：蔗糖、琼脂、试剂：蔗糖、琼脂、1N NaOH1N NaOH、1N HCl1N HCl、各种培养基母、各种培养基母液。液。【实验方法】【实验方法】（5050分，含操作）分，含操作）1 1培养基配制培养基配制本实验以本实验以6 6人为一大组，按人为一大组，按500ml500ml容量一组配制培养基容量一组配制培养基 。(1)(1)首先洗净盛装培
43、养基的容器，烘干或自然晾干；首先洗净盛装培养基的容器，烘干或自然晾干；(2)(2)按照下面公式，计算需配制培养基的量，然后根按照下面公式，计算需配制培养基的量，然后根据各种母液扩大的倍数，计算从母液中吸取的毫升据各种母液扩大的倍数，计算从母液中吸取的毫升量。量。吸取量吸取量(mL)=(mL)=需要配制培养基的体积需要配制培养基的体积(mL)(mL)需要配制需要配制浓度浓度(mg(mgL)L)母液浓度母液浓度(mg(mgL)L)(3)(3)用用1 1个个100 mL100 mL烧杯，分别从各种母液吸取用量，加入蔗糖烧杯，分别从各种母液吸取用量，加入蔗糖15g15g。(4)(4)称取琼脂称取琼脂5
44、 g5 g，置于，置于1 1个个1000 mL1000 mL烧杯中，加蒸馏水烧杯中，加蒸馏水100 mL100 mL，在电炉上加热溶解。在电炉上加热溶解。(5)(5)将将100 mL100 mL的琼脂溶化液和的琼脂溶化液和100 mL100 mL培养基成分充分混合，培养基成分充分混合，定容至定容至500 mL500 mL，1N NaOH1N NaOH或或1N HCl1N HCl将将pHpH值调至值调至5.85.8，以，以40 mL40 mL瓶分装至培养瓶中。瓶分装至培养瓶中。(6)(6)封好瓶，在标签上写明培养基代号。封好瓶，在标签上写明培养基代号。2 2培养基的灭菌培养基的灭菌 高压蒸汽灭菌
45、法：把分装好的培养基及所需灭高压蒸汽灭菌法：把分装好的培养基及所需灭菌的各种用具、蒸馏水等，放入高压灭菌锅的消毒桶内，菌的各种用具、蒸馏水等，放入高压灭菌锅的消毒桶内，加水至高水位。盖好锅盖，上好螺丝，关闭放气阀。通加水至高水位。盖好锅盖，上好螺丝，关闭放气阀。通电后，待压力上升到电后，待压力上升到0.05MPa0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到压力表上升达到0.1MPa0.1MPa时，在时，在122124122124下保持下保持1520 1520 mi
46、nmin，即可达到消毒目的。，即可达到消毒目的。高压蒸气灭菌注意事项：高压蒸气灭菌注意事项：（1 1）锅内冷空气必须排尽，否则压力表指针虽然达到一定压）锅内冷空气必须排尽，否则压力表指针虽然达到一定压力，但由于锅内冷空气的存在并达不到应有的温度，因而影力，但由于锅内冷空气的存在并达不到应有的温度，因而影响灭菌效果。在实际操作过程中常压力上升到响灭菌效果。在实际操作过程中常压力上升到0.05MPa0.05MPa时排时排2 2次气次气（2 2）当达到一定压力后，注意在保持压力过程中，严格遵守）当达到一定压力后，注意在保持压力过程中，严格遵守时间，时间过长会使一些化学物质遭到破坏，影响培养基成时间，
47、时间过长会使一些化学物质遭到破坏，影响培养基成分，时间短则达不到灭菌效果。分，时间短则达不到灭菌效果。（3 3）培养瓶中的液体不超过总体积的）培养瓶中的液体不超过总体积的70%70%，否则当温度超过，否则当温度超过100100时，培养基会喷溢，造成培养基瓶壁和包头纸的污染。时，培养基会喷溢，造成培养基瓶壁和包头纸的污染。制备好的培养基应保存在制备好的培养基应保存在225225避光的环避光的环境，有条件置冰箱境，有条件置冰箱4848冷藏储存较好。培养基若保冷藏储存较好。培养基若保存于非密闭容器中，应在三周内使用；若保存于密存于非密闭容器中，应在三周内使用；若保存于密闭容器中，可在一年内使用。闭容器中，可在一年内使用。【思考题】【思考题】（3030分）分）1 1、灭菌和消毒有无差别？为什么？、灭菌和消毒有无差别？为什么？2 2、常用的灭菌方法各有哪些优缺点？、常用的灭菌方法各有哪些优缺点？3 3、采用高压蒸汽锅高压灭菌时，应注意哪些事项？、采用高压蒸汽锅高压灭菌时，应注意哪些事项？
