1、2023-6-111产物分离提纯技术产物分离提纯技术2023-6-12本部分内容本部分内容5.1 5.1 概述概述 5.2 发酵液预处理发酵液预处理5.3 细胞破碎的原理与技术细胞破碎的原理与技术5.4 5.4 发酵产物的分离纯化原理与技术发酵产物的分离纯化原理与技术5.1 概述n一、下游加工技术的重要性n二、下游加工技术的特点n三、发酵产物的分类n四、发酵产物提纯的步骤和方法n五、提取精制过程中应注意的问题n六、发酵工程下游加工过程的基本原理n七、发酵工程下游加工过程的一般程序 一、下游加工技术的重要性一、下游加工技术的重要性 a.a.产品分离纯化是最终获得商业产品的环节。产品分离纯化是最终
2、获得商业产品的环节。b.b.投资费用高（抗生素、乙醇、柠檬酸占投资费用高（抗生素、乙醇、柠檬酸占60%60%）。）。c.c.分离纯化技术落后会阻碍发酵工程技术的分离纯化技术落后会阻碍发酵工程技术的发展。发展。5.1 概述概述 几种产品在发酵液中的浓度几种产品在发酵液中的浓度n 产品产品 典型浓度（典型浓度（g/Lg/L）n 抗生素抗生素 2525n 氨基酸氨基酸 100100n 酒精酒精 100100n 有机酸有机酸 100100n 酶酶 2020n 蛋白质蛋白质 1010二、下游加工技术的特点二、下游加工技术的特点 a.a.发酵液的复杂性造成分离上的困难性。发酵液的复杂性造成分离上的困难性。
3、b.b.欲提取的产物通常浓度低且很不稳定。欲提取的产物通常浓度低且很不稳定。c.c.多为分批操作，各批发酵液不尽相同，多为分批操作，各批发酵液不尽相同，要求下游加工有一定弹性。要求下游加工有一定弹性。三、发酵产物的分类三、发酵产物的分类n 从工业发酵范畴来看，从发酵液中获得从工业发酵范畴来看，从发酵液中获得的发酵产物大致可分为三类的发酵产物大致可分为三类 ：n 菌体：菌体：n 酶：酶：n 代谢产物代谢产物四、发酵产物提炼的步骤和方法四、发酵产物提炼的步骤和方法n影响提炼方法的因素影响提炼方法的因素n 产物类型不同，提取、精制的方法不同。产物类型不同，提取、精制的方法不同。如：如：分离菌体胞内酶
4、与代谢产物的方法明显不同；分离菌体胞内酶与代谢产物的方法明显不同；n 产物类型相同，但结构不同，提取精制方法不产物类型相同，但结构不同，提取精制方法不同。同。n 产物酸碱性、水溶性等不同，方法不同。产物酸碱性、水溶性等不同，方法不同。如何着手对一种未知的发酵产品进行提取。如何着手对一种未知的发酵产品进行提取。n(1)(1)产品的类型，性质的研究。产品的类型，性质的研究。n可大致确定它是属于哪一类型；可大致确定它是属于哪一类型；n可了解它是一种成分还是几种成分的混合物。可了解它是一种成分还是几种成分的混合物。n(2)(2)稳定性研究。稳定性研究。n确定在哪一种条件下进行提取和精制不受破坏，确定在
5、哪一种条件下进行提取和精制不受破坏，即确定提取条件。即确定提取条件。发酵产物的提取和精制发酵产物的提取和精制浓缩纯化，浓缩纯化，四个步骤：个步骤：n(1)(1)预处理：改变发酵液物理性质。预处理：改变发酵液物理性质。n(2)(2)提取：分离出目的物及其性质相似物。提取：分离出目的物及其性质相似物。n(3)(3)精制：除去相似物，精炼目的。精制：除去相似物，精炼目的。n(4)(4)后加工：使用要求决定。后加工：使用要求决定。n常用提取方法：常用提取方法：n离子交换树脂法离子交换树脂法n膜分离法膜分离法n凝胶层离法凝胶层离法n沉淀法沉淀法n吸附法吸附法n溶媒萃取法溶媒萃取法n常用精制方法：常用精制
6、方法：除了上述几种外，还含浓缩、结晶、干燥、蒸馏等。其除了上述几种外，还含浓缩、结晶、干燥、蒸馏等。其方法的选择：取决于方法的选择：取决于醪特性、菌种、产物性质醪特性、菌种、产物性质。五、提取五、提取精制过程中要注意的问题：精制过程中要注意的问题：n防变性和降解；防变性和降解；n防辅基流失；防辅基流失；n防醪中所需产物被分解或挥发；防醪中所需产物被分解或挥发；基本原则基本原则:快速操作、低温环境、温和条件快速操作、低温环境、温和条件如如pHpH值选择在目标物质的稳定范围内，尽值选择在目标物质的稳定范围内，尽可能小的剪切作用和防止污染。可能小的剪切作用和防止污染。n生物物质的分离方法与一般化学方
7、法虽然有许多不同特点，但在原理上又有许多是相同的n根据混合物中不同组分分配率的差异，将其分配于可用机械方法分离的两个或几个物相中(如溶剂提取、盐析、结晶等)，或将混合物置于某一物相中(主要是液相)，外加一定的作用力，使各组分分配于不同区域，而达到分离纯化的目的(如电泳、超离心、超滤等)。七、发酵产物提取与精制的一般流程七、发酵产物提取与精制的一般流程四大阶段四大阶段：预处理和固液分离阶段、初步提取分：预处理和固液分离阶段、初步提取分离阶段、纯化精致阶段、成品加工阶段离阶段、纯化精致阶段、成品加工阶段5.2 发酵液的预处理三、固液分离 固液分离是将悬浮液中的固体和液体分离的过程，如将发酵液中的细
8、胞、菌体、细胞碎片以及蛋白质沉淀物等物质分离。常规的固液分离技术主要有过滤和离心分离等。5.3细胞破碎的原理与技术三、破碎率测定n1、直接测定：染色、细胞计数n2、目的产物测定：与完全破碎率的得率比较。n3、导电率测定。四、破碎技术发展n1、多种方法结合n2、与菌种和发酵过程结合：包涵体的形成、引入噬菌体基因、耐高温产品等。n3、与下游分离过程结合。权衡点：高的产物释放率、低的能耗和便于后步提取权衡点：高的产物释放率、低的能耗和便于后步提取5.4 5.4 发酵产物的分离纯化原理与技术发酵产物的分离纯化原理与技术一、沉淀分离技术二、萃取分离技术三、吸附分离技术四、膜分离技术五、离子交换分离技术六
9、、层析分离技术七、成品加工2023-6-125n沉淀是指溶液中的溶质在适当条件下由液相变成固相而析出的过程。n分离过程中采用沉淀技术，其目的有两个：一是通过沉淀使目标成分达到浓缩和去除杂质的目的；二是通过沉淀可将已纯化的产品由液态变成固态，有利于保存和进一步的加工处理。一、一、沉淀分离技术沉淀分离技术 5.4 5.4 发酵产物的分离纯化原理与技术发酵产物的分离纯化原理与技术当盐浓度增加到一定程度时，在盐离子的作用下，水活度大大降低，同时蛋白质表面的电荷被大量中和，使蛋白质分子之间电排斥作用减弱电排斥作用减弱而相互聚集；而且，中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而破坏破坏蛋白质分子外表
10、的水化膜水化膜，暴露出疏水区域，由于疏水区域的相互作用而使蛋白沉淀析出，即盐析。1、盐析法常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、磷酸钠、磷酸钾、氯化钾、醋酸钠、硫氰化钾等。在蛋白质的盐析中，以硫酸铵应用最广。盐析的操作：pH蛋白质、酶等经过盐析沉淀分离后，产品夹带有盐分，需脱盐处理。常用的方法有透析法、电渗析法和葡聚糖凝胶过滤法等与无机沉淀剂相比，有机沉淀剂的优点在于：（1）选择性比较高，即一定浓度的有机沉淀剂只沉淀分离某一种或某一类溶质组分；（2）沉淀后所得产品不需脱盐，残留的沉淀剂通过挥发而易于去除。n有机沉淀剂的缺点是对有些生物大分子如酶类有失活作用，因而常需在低温下操作。2、有机溶剂沉
11、淀分离法机理：（1）有机溶剂改变了溶液的介电常数。加入有机溶剂后，降低了溶液介电常数，因而增强了溶质分子间的静电作用力，降低了溶质分子与溶剂分子间的相互作用，导致溶质分子间发生聚合而析出。（2）脱水作用。由于有机溶剂必须溶解在水溶液中，这样就减少了溶质与水的作用，因而使溶质脱水而相互聚集沉淀。3、等电点沉淀法 4、变性沉淀分离法 加热、加有机酸、调pH 二、萃取分离技术 n利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法称为萃取。2023-6-135三、吸附分离技术 n吸附是溶质从液相或气相转移到固相的现象。吸附分离法是利用不同组分（溶质）在吸附剂表面吸附和解吸能力的差异
12、进行分离的方法。吸附剂一般为多孔微粒，具有很大的比表面积。四、膜分离技术n1、膜分离技术原理 n 用天然或人工合成的高分子膜，以外加压力或化学位差为推动力，对双组分或多组分的溶液进行分离、分级、提纯和富集的方法，统称为膜分离法 。五、离子交换分离技术 n离子交换分离法是利用溶液中的溶质离子与离子交换树脂的活性离子交换时结合力大小不同而进行分离的一类方法，在发酵工程中，离子交换法广泛应用于水的处理和小分子产物如氨基酸、有机酸的提取。2023-6-148六、层析分离技术 层析技术也称为色谱或色层技术，是基于物质溶解度、蒸气压、吸附能力、立体结构或离子交换等物理化学性质的微小差异，使其在流动相和固定相之间的分配系数不同，而当两相作相对运动时，组分在两相间进行连续多次分配，从而达到彼此分离。七、成品加工 n1、浓缩 n浓缩方法的选择应视目的产物的热稳定性而定。对于热稳定热稳定的目的产物可用常规的水浴常压蒸发、减压蒸发等。中小规模的生产用旋转蒸发仪浓缩，生产规模较大时可用降膜式薄膜蒸发器浓缩。n对于热不稳定热不稳定的生物大分子通常采用超滤法浓缩、冷冻浓缩法和吸收浓缩法。
