1、 4.7 4.7 维生素的测定维生素的测定 l概述概述l脂溶性维生素脂溶性维生素A A、E E的测定的测定l水溶性维生素水溶性维生素 B B、C C的测定的测定4.7.1 4.7.1 概述概述（1 1）维生素的分类及生理功能）维生素的分类及生理功能（2 2）测定的目的和意义）测定的目的和意义（3 3）维生素的测定方法）维生素的测定方法（1 1）维生素的分类及生理功能）维生素的分类及生理功能功能功能：维生素是维持人体正常生命活动所必需的一类小分子有维生素是维持人体正常生命活动所必需的一类小分子有机化合物，结构复杂，种类多。目前已经确认的有机化合物，结构复杂，种类多。目前已经确认的有3030多多种
2、，其中有种，其中有2020种被认为与维持人体健康和促进生长发育种被认为与维持人体健康和促进生长发育是至关重要的。是至关重要的。主要是通过作为辅酶的成分调节代谢过程，人体对它的主要是通过作为辅酶的成分调节代谢过程，人体对它的需要量极少，但作用非常大。需要量极少，但作用非常大。一般在体内不能合成或合成量不能满足生理需要，必须一般在体内不能合成或合成量不能满足生理需要，必须经常从食物中摄取；长期缺乏任何一种维生素都会导致经常从食物中摄取；长期缺乏任何一种维生素都会导致相关新陈代谢的紊乱，出现各种特有的症状。相关新陈代谢的紊乱，出现各种特有的症状。分类：分类：按溶解性能可将它们分成两大类：按溶解性能可
3、将它们分成两大类：l一类是能溶在脂肪或脂溶性溶剂中的，叫脂溶性一类是能溶在脂肪或脂溶性溶剂中的，叫脂溶性维生素（如维生素（如A A、D D、E E、K K等）；等）；l另一类是能溶解在水中的，叫水溶性维生素（如另一类是能溶解在水中的，叫水溶性维生素（如B B1 1、B B2 2、B B6 6、C C、B B1212等）。等）。（2 2）测定的目的和意义）测定的目的和意义 可评价食品的营养价值；可评价食品的营养价值；开发利用富含维生素的食品；开发利用富含维生素的食品；多数维生素的性质不稳定，常常作为强化剂在食多数维生素的性质不稳定，常常作为强化剂在食品工业的某些产品中使用。可以研究食品在不同的品
4、工业的某些产品中使用。可以研究食品在不同的加工、储存条件下的稳定性，进而指导人们制定合加工、储存条件下的稳定性，进而指导人们制定合理的工艺条件，减少维生素的损失；理的工艺条件，减少维生素的损失；起到监督维生素强化食品的剂量，以防摄入过多起到监督维生素强化食品的剂量，以防摄入过多的维生素而引起中毒。的维生素而引起中毒。（3 3）维生素的测定方法）维生素的测定方法微生物法：微生物法：基于某种微生物生长需要特定的维生素，基于某种微生物生长需要特定的维生素，方法特异性强、灵敏度高、不需要特殊仪器，样品方法特异性强、灵敏度高、不需要特殊仪器，样品不需经特殊处理，但只能测定水溶性维生素。不需经特殊处理，但
5、只能测定水溶性维生素。化学法：化学法：比色法、滴定法比色法、滴定法仪器法：仪器法：色谱法、荧光法、酶法、免疫法等。特别色谱法、荧光法、酶法、免疫法等。特别是是HPLCHPLC可用于大多数维生素的测定，并且在某些可用于大多数维生素的测定，并且在某些条件下可同时分析几种维生素，但分析费用较高。条件下可同时分析几种维生素，但分析费用较高。应根据不同的食品基质和条件选择不同的分析方法应根据不同的食品基质和条件选择不同的分析方法重点讲解的方法：重点讲解的方法：l高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLCHPLC法）同时测定法）同时测定脂溶性维生素脂溶性维生素A A和维生素和维生素E El比色法测定维生素比
6、色法测定维生素A AlHPLCHPLC法测定胡萝卜素法测定胡萝卜素l滴定法和比色法测定维生素滴定法和比色法测定维生素C Cl荧光法测定荧光法测定 B1B1、B2B24.7.2 4.7.2 维生素维生素A A、E E的测定的测定HPLCHPLC法法 （GB/T 5009.82)GB/T 5009.82)以乳粉为样品演示样品的预处理和以乳粉为样品演示样品的预处理和HPLCHPLC的使用的使用VAVA的性质的性质：维生素维生素A A是是-紫罗酮环与一元醇所组成的一类化合物紫罗酮环与一元醇所组成的一类化合物及其衍生物的总称。通常所说的维生素及其衍生物的总称。通常所说的维生素A A是指视黄醇是指视黄醇或
7、视黄醇醋酸酯。或视黄醇醋酸酯。因有许多不饱和链，故见光易分解；因有许多不饱和链，故见光易分解；在缺氧情况下，对热较稳定，对光特别敏感。测定在缺氧情况下，对热较稳定，对光特别敏感。测定速度要快。速度要快。不溶于水，溶于有机溶剂，对碱稳定不溶于水，溶于有机溶剂，对碱稳定V VE E的性质的性质：又称生育酚，目前已经确认：又称生育酚，目前已经确认 的有的有8 8种异构体，最常见的有种异构体，最常见的有、-生育酚。生育酚。溶于脂溶性溶剂，对热稳定，酸性环境中比碱溶于脂溶性溶剂，对热稳定，酸性环境中比碱性环境中稳定，无氧条件下，对热、光及碱性性环境中稳定，无氧条件下，对热、光及碱性环境中也相对稳定。环境
8、中也相对稳定。V VE E广泛分布在各种粮食的广泛分布在各种粮食的胚和植物油中。胚和植物油中。l 测定原理：测定原理：（1 1）液相色谱的原理：）液相色谱的原理：液相色谱是采用液体为流动液相色谱是采用液体为流动相的一种色谱法。高效液相色谱仪由高压泵、进样相的一种色谱法。高效液相色谱仪由高压泵、进样装置、色谱柱、检测器、记录和数据处理装置等部装置、色谱柱、检测器、记录和数据处理装置等部分组成。高压泵以恒定的流量，从贮液容器吸取作分组成。高压泵以恒定的流量，从贮液容器吸取作为流动相的溶剂输送到色谱柱，试样由进样装置导为流动相的溶剂输送到色谱柱，试样由进样装置导入，随流动相在色谱柱内进行分离。分离后
9、的组分入，随流动相在色谱柱内进行分离。分离后的组分进入检测器检测，并用记录仪绘出色谱图，或与其进入检测器检测，并用记录仪绘出色谱图，或与其他数据处理装置相连，由数据处理系统进行数据处他数据处理装置相连，由数据处理系统进行数据处理理 色谱图：某一波长下各个不同时刻的吸光度值描点色谱图：某一波长下各个不同时刻的吸光度值描点作图。作图。l（2 2）高效液相色谱检测样）高效液相色谱检测样品中的维生素品中的维生素A A、E E的原理：的原理：样品中的维生素样品中的维生素E E及维生素及维生素A A经皂化提取处理后，将其经皂化提取处理后，将其从不皂化部分提取至有机溶从不皂化部分提取至有机溶剂中。用高效液相
10、色谱法剂中。用高效液相色谱法C C1818反相柱将维生反相柱将维生E E和维生素和维生素A A分离，经紫外检测器检测，分离，经紫外检测器检测，并用并用内标法内标法定量定量(3(3）什么是内标法？）什么是内标法？取标准被测成分，按依次增加或减少的已知阶段量，取标准被测成分，按依次增加或减少的已知阶段量，各自分别加入各单体所规定的定量内标准物质中，各自分别加入各单体所规定的定量内标准物质中，调制成标准溶液。分别取此标准液的一定量注入色调制成标准溶液。分别取此标准液的一定量注入色谱柱，根据色谱图取标准被测成分的峰面积或峰高谱柱，根据色谱图取标准被测成分的峰面积或峰高和内标物质的峰面积或峰高的比例为纵
11、坐标，取标和内标物质的峰面积或峰高的比例为纵坐标，取标准被测成分量和内标物质量之比或标准被测成分量准被测成分量和内标物质量之比或标准被测成分量为横坐标，制成标准曲线。为横坐标，制成标准曲线。然后按单体中所规定的方法调制试样液，调制试样然后按单体中所规定的方法调制试样液，调制试样液时，预先加入与调制标准溶液等量的内标物质，液时，预先加入与调制标准溶液等量的内标物质，然后按制作标准曲线时的同样条件下得出色谱图，然后按制作标准曲线时的同样条件下得出色谱图，求出被测成分的峰面积或峰高和内标物质的峰面积求出被测成分的峰面积或峰高和内标物质的峰面积或峰高之比，再按标准曲线来求出被测成分的含量。或峰高之比，
12、再按标准曲线来求出被测成分的含量。内标物的选取原则：内标物的选取原则：能与被测成分完全分离，能与被测成分完全分离，但其保留时间又尽可能接近被测成分的稳定的但其保留时间又尽可能接近被测成分的稳定的物质。物质。试剂试剂（1 1）无水乙醚：不含有过氧化物。）无水乙醚：不含有过氧化物。（2 2）无水乙醇：不得含有醛类物质。）无水乙醇：不得含有醛类物质。（3 3）无水硫酸钠。）无水硫酸钠。（4 4）甲醇：重蒸后使用。）甲醇：重蒸后使用。（5 5）重蒸水：水中加少量高锰酸钾，临用前蒸馏。）重蒸水：水中加少量高锰酸钾，临用前蒸馏。（6 6）抗坏血酸溶液（）抗坏血酸溶液（100100g gL L）：）：临用前
13、进行配制。临用前进行配制。（7 7）氢氧化钾溶液（）氢氧化钾溶液（5050g g100g100g）：）：取取5050g g氢氧化钾氢氧化钾,溶溶于于5050g g水中，混匀水中，混匀 标准溶液的配制标准溶液的配制（1 1）维生素维生素 A A标准液：视黄醇（纯度标准液：视黄醇（纯度8585）或视黄醇乙酸酯（纯度或视黄醇乙酸酯（纯度9090）经皂化处理后使用。）经皂化处理后使用。用脱醛乙醇溶解维生素用脱醛乙醇溶解维生素A A标准品，使其浓度大约为标准品，使其浓度大约为lmg/mLlmg/mL。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。（2 2）维生素）维生素E
14、E标准液：标准液：a a-生育酚（纯度生育酚（纯度9595），），-生育酚（纯生育酚（纯纯纯9595），），-生育酚（纯度生育酚（纯度9595）。用脱醛乙醇分别溶解）。用脱醛乙醇分别溶解以上三种维生素以上三种维生素E E标准品，使其浓度大约为标准品，使其浓度大约为lmg/mLlmg/mL,临用前临用前用紫外分光光度法分别标定此三种维生素用紫外分光光度法分别标定此三种维生素E E的准确浓度。的准确浓度。（3 3）内标溶液：称取苯并芘（纯度）内标溶液：称取苯并芘（纯度9898），用脱醛乙醇配制），用脱醛乙醇配制成成10ug/mL10ug/mL 的内标溶液。的内标溶液。仪器和设备仪器和设备（1 1）
15、高效液相色谱仪带紫外分光检测器。）高效液相色谱仪带紫外分光检测器。（2 2）旋转蒸发器。）旋转蒸发器。（3 3）高速离心机（带小塑料离心管）高速离心机（带小塑料离心管）（4 4）高纯氮气。）高纯氮气。（5 5）紫外分光光度计）紫外分光光度计。样品处理：样品处理：皂化皂化提取提取洗涤洗涤浓缩浓缩 定容定容（1 1）皂化：）皂化：称取适量样品于三角瓶中，加称取适量样品于三角瓶中，加3030mLmL无水乙醇，振无水乙醇，振摇使样品分散。加入摇使样品分散。加入 5mL100g/L5mL100g/L抗坏血酸溶液和抗坏血酸溶液和 2.2.0mL0mL苯并芘内标液，混匀，加苯并芘内标液，混匀，加 10 10
16、mLmL氢氧化钾溶氢氧化钾溶液，沸水回流液，沸水回流3030minmin，使皂化完全，皂化后立即放使皂化完全，皂化后立即放入冰水中冷却。入冰水中冷却。思考：皂化时加入思考：皂化时加入VcVc的作用是什么？的作用是什么？（2 2）提取：）提取：将皂化后的样品移入分液漏斗中，用将皂化后的样品移入分液漏斗中，用5050mLmL水分水分2-32-3次次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用100mL100mL无水乙醚无水乙醚分分2 2次洗皂化瓶及残渣，乙醚液并入分液漏斗中。轻次洗皂化瓶及残渣，乙醚液并入分液漏斗中。轻轻振摇轻振摇2 2minmin，静置分层，弃去水层。静置分层
17、，弃去水层。(3)(3)洗涤：洗涤：每次用约每次用约5050mLmL水将乙醚液洗至中性，需洗水将乙醚液洗至中性，需洗4545次次 （4 4）浓缩：）浓缩：将乙醚提取液经无水硫酸钠（约将乙醚提取液经无水硫酸钠（约5g5g）滤入滤入150150 mLmL旋转旋转蒸发瓶内，用约蒸发瓶内，用约1515mLmL乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠2 2次，并入蒸发瓶内，于次，并入蒸发瓶内，于5555水浴中减压蒸馏并回收乙水浴中减压蒸馏并回收乙醚，醚剩下约醚，醚剩下约2mL2mL时，取下蒸发瓶。时，取下蒸发瓶。（5 5）定容：）定容：用氮气吹干乙醚，随即加入用氮气吹干乙醚，随即加入2m
18、L2mL乙醇，充分混合，乙醇，充分混合，溶解提取物。溶解提取物。5000r/min5000r/min离心离心5min5min，上清液供色谱上清液供色谱分析用。分析用。液相色谱推荐条件：液相色谱推荐条件：l分析柱：分析柱：C18C18反相柱反相柱 5 5m m，4.6mm4.6mm25Cm25Cm；l流动相：甲醇：水流动相：甲醇：水=98=98：2 2，混匀，临用前脱气；，混匀，临用前脱气；l紫外检测器波长：紫外检测器波长：3 300nm;00nm;l进样量：进样量：20 20 L L；l流速：流速：1.701.70mLmL/min/min。标准曲线的制备标准曲线的制备（1 1）维生素）维生素A
19、 A和维生素和维生素E E标准溶液的标定标准溶液的标定：取上述配制的维生素取上述配制的维生素A A、E E的标准溶液按一定的倍数进的标准溶液按一定的倍数进行稀释，在下表要求的条件下测定其吸光度，根据其吸行稀释，在下表要求的条件下测定其吸光度，根据其吸光系数计算其准确浓度。光系数计算其准确浓度。标准比吸光系数E(1%,cm)测定波长（nm）视黄醇1835325-生育酚71294-生育酚92.8298a-生育酚91.2298标准溶液浓度计算：标准溶液浓度计算：p-p-某维生素浓度，某维生素浓度，mg/mg/mLmL；A-A-维生素的平均紫外吸光值；维生素的平均紫外吸光值；E-E-某种维生素某种维生
20、素l l比吸光系数比吸光系数;F-F-稀释倍数。稀释倍数。FEA10（2 2）标准曲线的制备）标准曲线的制备:本方法采用内标法定量。把高、低两个浓度的本方法采用内标法定量。把高、低两个浓度的 维生素维生素A A、-生育酚、生育酚、a a-生育酚、生育酚、-生育酚及内标苯生育酚及内标苯并芘液混合，（其内标苯并芘的浓度值相同）将二种并芘液混合，（其内标苯并芘的浓度值相同）将二种浓度的混合标准进行色谱分析，结果见色谱图。以维浓度的混合标准进行色谱分析，结果见色谱图。以维生素峰面积与内标物峰面积之比为纵坐标，维生素的生素峰面积与内标物峰面积之比为纵坐标，维生素的浓度浓度(ug/mLug/mL）为横坐标
21、绘制标准曲线。为横坐标绘制标准曲线。样品分析：样品分析：l取样品处理液取样品处理液20 20 l l，用标准溶液同样的条件进行色谱用标准溶液同样的条件进行色谱分析，绘制色谱图。分析，绘制色谱图。l定性：定性：根据保留时间定性根据保留时间定性l定量定量：根据色谱图求出某种维生素的峰面积与内标物根据色谱图求出某种维生素的峰面积与内标物峰面积的比值，以此比值在标准曲线上查得待测维生峰面积的比值，以此比值在标准曲线上查得待测维生素的含量。素的含量。计算：计算：式中：式中：X-X-某种维生素的含量，某种维生素的含量，mg/100gmg/100g；P-P-由标准曲线上查到的某种维生素含量，由标准曲线上查到
22、的某种维生素含量，g/mLg/mL；V-V-样品浓缩后定容体积，样品浓缩后定容体积，mlml；m-m-样品质量，样品质量，g g。1000100mV说明及讨论说明及讨论 （1 1）维生素极易被光破坏，实验操作应在微弱光线）维生素极易被光破坏，实验操作应在微弱光线下进行，或使用棕色玻璃仪器。下进行，或使用棕色玻璃仪器。（2 2）乙醚为溶剂的萃取体系，易发生乳化现象。在）乙醚为溶剂的萃取体系，易发生乳化现象。在提取、洗涤操作中，不要用力过猛，若发生乳化，提取、洗涤操作中，不要用力过猛，若发生乳化，可加几滴乙醇破乳。可加几滴乙醇破乳。（3 3）本法是国家标准检验方法，适用于各种食物和）本法是国家标准
23、检验方法，适用于各种食物和饲料中维生素饲料中维生素A A和维生素和维生素E E的同时测定。的同时测定。（4 4）本法不能将）本法不能将-生育酚生育酚-生育酚分开，所以生育酚分开，所以-生育生育酚的色谱峰中含有酚的色谱峰中含有-生育酚。生育酚。IUIU（国际单位）与质量的换算（国际单位）与质量的换算l1IUVa=0.33g1IUVa=0.33gl1IU-1IU-胡萝卜素胡萝卜素=0.6g=0.6gl1Ug 1Ug VdVd=40IU 1IUVd=0.025g=40IU 1IUVd=0.025gl1IU1IU维生素维生素D=0.025ugD=0.025ug维生素维生素D3D3l1IU 1IU Ve
24、Ve=1mg=1mg Ve(DLVe(DL-a-a-生育酚醋酸酯生育酚醋酸酯)l1mgDL-a-1mgDL-a-生育酚生育酚=1.1IU=1.1IU VeVel1mgD-a-1mgD-a-生育酚生育酚=1.49 IU=1.49 IU VeVel1mgD-a-1mgD-a-生育酚醋酸酯生育酚醋酸酯=1.36 IU=1.36 IU VeVe 4.7.3 4.7.3 维生素维生素A A的测定（三氯化锑比色法）的测定（三氯化锑比色法）l 原理：原理：V VA A+三氯化锑三氯化锑蓝色物质，于蓝色物质，于620nm620nm测吸光度，与标测吸光度，与标准比较定量。准比较定量。l 试剂：试剂：无水无水Na
25、Na2 2SOSO4 4、乙酸酐：吸水乙酸酐：吸水 乙醚：抽提乙醚：抽提 乙醇、乙醇、KOHKOH：皂化反应皂化反应 三氯甲烷：溶剂三氯甲烷：溶剂 三氯化锑三氯化锑-三氯甲烷：反应试剂三氯甲烷：反应试剂 酚酞：用于鉴别洗涤液中有无碱酚酞：用于鉴别洗涤液中有无碱l步骤：步骤：（1 1）预处理：皂化、提取、洗涤、浓缩）预处理：皂化、提取、洗涤、浓缩（2 2）制备标准曲线：用）制备标准曲线：用V VA A标准液绘制，用标准液绘制，用CHClCHCl3 3调零。调零。注意在移入光路前，迅速加入三氯化锑，注意在移入光路前，迅速加入三氯化锑，6 6秒内秒内测定测定 (3)(3)样品测定：用样品溶液代替标准
26、液溶液。样品测定：用样品溶液代替标准液溶液。l说明说明 (1)(1)萃取时萃取时,不要用力过猛，避免发生乳化。不要用力过猛，避免发生乳化。（2 2）氯仿中必须无水，因三氯化锑遇水会出现沉淀，干）氯仿中必须无水，因三氯化锑遇水会出现沉淀，干扰比色测定。扰比色测定。（3 3）由于三氯化锑与）由于三氯化锑与VAVA所产生的兰色物质不稳定，注所产生的兰色物质不稳定，注意在移入光路前，迅速加入三氯化锑，意在移入光路前，迅速加入三氯化锑，6 6秒内秒内测定。测定。（4）三氯化锑腐蚀性强，且遇水生成白色沉淀，实验用三氯化锑腐蚀性强，且遇水生成白色沉淀，实验用过的仪器要先用稀盐酸浸泡后再清洗。过的仪器要先用稀
27、盐酸浸泡后再清洗。植物油中植物油中V VE E的测定的测定（文献方法）（文献方法）l样品处理：准确称取样品处理：准确称取1g1g左右的样品用左右的样品用25mL25mL丙酮溶丙酮溶解。解。l仪器条件：流动相：乙腈仪器条件：流动相：乙腈+甲醇甲醇=80+20=80+20 流速：流速：1.2ml/min1.2ml/min 色谱柱：色谱柱：C18C18反相柱反相柱 波长：波长：298nm 298nm l此法可以同时测定此法可以同时测定-生育酚、生育酚、a a-生育酚、生育酚、-生育酚生育酚4.7.4-4.7.4-胡萝卜素的测定（胡萝卜素的测定（HPLCHPLC法）法）l试样中的试样中的-胡萝卜素，用
28、石油醚胡萝卜素，用石油醚+丙酮混合液提取，丙酮混合液提取，经三氧化铝柱纯化，然后以高效液相色谱法测定，经三氧化铝柱纯化，然后以高效液相色谱法测定，以保留时间定性，以峰高或峰面积定量。以保留时间定性，以峰高或峰面积定量。l注意：注意：浓缩提取液时，防止蒸干，避免胡萝卜素浓缩提取液时，防止蒸干，避免胡萝卜素在空气中氧化或因高温、紫外线直射等破坏。在空气中氧化或因高温、紫外线直射等破坏。4.7.5 维生素维生素B1的测定的测定荧光法荧光法(GB/T 5009.84)l原理：原理：硫胺素（硫胺素（V VB1B1）在碱性铁氰化钾溶液中被氧化）在碱性铁氰化钾溶液中被氧化为嘧噻色素，在紫外线照射下，嘧噻色素
29、发出荧光。为嘧噻色素，在紫外线照射下，嘧噻色素发出荧光。在给定条件下，以及没有其他荧光物质干扰时，荧光在给定条件下，以及没有其他荧光物质干扰时，荧光强度与嘧噻色素成正比，即与溶液中硫胺素量成正比。强度与嘧噻色素成正比，即与溶液中硫胺素量成正比。试样在硫酸作用下，加热提取试样在硫酸作用下，加热提取V VB1B1，冷却后用淀粉酶处冷却后用淀粉酶处理使理使V VB1B1分离分离，然后以所得溶液做测定。，然后以所得溶液做测定。l测定步骤：测定步骤：提取提取(水解、酶解）水解、酶解）净化净化氧化氧化测定测定l水解、酶解水解、酶解的作用的作用:使结合态使结合态V VB1B1变为游离态变为游离态V VB1B
30、1维生素维生素B1的测定的测定HPLC法法l维生素维生素B1通常采用反相键合相色谱法进行分离，通常采用反相键合相色谱法进行分离，利用紫外检测器或荧光检测器进行测定。利用荧利用紫外检测器或荧光检测器进行测定。利用荧光检测器检测时，应首先使从样品中提取的维生光检测器检测时，应首先使从样品中提取的维生素素B1氧化成硫色素，然后转入正丁醇或异丁醇中，氧化成硫色素，然后转入正丁醇或异丁醇中，再进行再进行HPLC分析。分析。4.7.6 维生素维生素B2的测定的测定荧光法荧光法l原理：原理：试样在稀盐酸中水解、酶解，调整试样在稀盐酸中水解、酶解，调整 PHPH值，值，过滤除去蛋白质等物质；试样溶液经高锰酸钾
31、氧化，过滤除去蛋白质等物质；试样溶液经高锰酸钾氧化，除去干扰物，再经硅镁吸附剂的柱层析，提纯的核除去干扰物，再经硅镁吸附剂的柱层析，提纯的核黄素在波长黄素在波长525525nmnm下发生黄绿色荧光，在稀溶液中下发生黄绿色荧光，在稀溶液中其荧光强度与核黄素的浓度成正比。再加入低亚硫其荧光强度与核黄素的浓度成正比。再加入低亚硫酸钠，将酸钠，将V VB2B2还原成无荧光的物质，然后再测定试液还原成无荧光的物质，然后再测定试液中残余荧光杂质的荧光，两者相差即为食品中核黄中残余荧光杂质的荧光，两者相差即为食品中核黄素所产生的荧光强度。素所产生的荧光强度。l测定核黄素的方法还有：测定核黄素的方法还有：微生
32、物法和微生物法和HPLCHPLC法。法。4.7.7 4.7.7 维生素维生素C C（抗坏血酸）的测定抗坏血酸）的测定 维生素维生素C C的生理功能及性质的生理功能及性质l维生素维生素C C是一种己糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所是一种己糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以又称作抗坏血酸。以又称作抗坏血酸。l维生素维生素C C具有较强的还原性具有较强的还原性，对光敏感，氧化后的产，对光敏感，氧化后的产物称为脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性。进一步物称为脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性。进一步水解则生成水解则生成2 2，3-3-二酮古乐糖酸，失去生理作用。二酮古乐糖酸，失去生理作用。l在食品中，这三种形式均
33、有存在，但主要是前两者，在食品中，这三种形式均有存在，但主要是前两者，故许多国家的食品成分表均以抗坏血酸和脱氢抗坏故许多国家的食品成分表均以抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量表示。血酸的总量表示。l还原型维生素还原型维生素 C C有强还原性，有抑制多酚氧化酶作有强还原性，有抑制多酚氧化酶作用，故常添加于啤酒、果汁等用，故常添加于啤酒、果汁等食品中作抗氧化剂食品中作抗氧化剂。l在新鲜的水果蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、猕猴在新鲜的水果蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、猕猴桃、柑橘等食品中含量尤为丰富。桃、柑橘等食品中含量尤为丰富。维生素维生素C C 的测定方法的测定方法l2 2，6 6二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴
34、定法l2 2，4 4二硝基苯肼比色法二硝基苯肼比色法l荧光法荧光法l高效液相色谱法高效液相色谱法（1 1）2 2，6 6二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法l测定的是还原型抗坏血酸的含量测定的是还原型抗坏血酸的含量 该方法简便、灵敏，该方法简便、灵敏，但特异性差，样品中的其他但特异性差，样品中的其他还原性物质（如铁离子、铜离子等）会干扰测定，还原性物质（如铁离子、铜离子等）会干扰测定，使结果偏高，对色深样液的滴定终点不易辨别。使结果偏高，对色深样液的滴定终点不易辨别。（2 2）2 2，4 4二硝基苯肼比色法和荧光法二硝基苯肼比色法和荧光法l测得的是抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。测得的是抗坏血酸和脱氢抗
35、坏血酸的总量。苯肼法操作复杂，特异性差，易受共存物质的苯肼法操作复杂，特异性差，易受共存物质的影响；影响；荧光法受干扰的影响较小，结果较准确，重现荧光法受干扰的影响较小，结果较准确，重现性好，但操作复杂。性好，但操作复杂。（3 3）高效液相色谱法）高效液相色谱法l可以同时测得抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的含量。可以同时测得抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的含量。具有干扰少，准确度高，重现性好，灵敏、简便、具有干扰少，准确度高，重现性好，灵敏、简便、快速等优点，是上述几种方法中最先进、可靠的快速等优点，是上述几种方法中最先进、可靠的方法。但分析成本较高。方法。但分析成本较高。l主要介绍维生素主要介绍维生素C C
36、常用的测定方法常用的测定方法2 2，6 6二氯靛酚二氯靛酚滴定法、苯肼比色法滴定法、苯肼比色法（一）（一）2 2，6-6-二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法以新鲜果蔬为样品进行讲解和演示以新鲜果蔬为样品进行讲解和演示原理：原理：还原型抗坏血酸可以还原染料还原型抗坏血酸可以还原染料2 2，6 6二氯靛酚。该二氯靛酚。该染料在酸性溶液中是粉红色（在中性或碱性溶液中染料在酸性溶液中是粉红色（在中性或碱性溶液中呈蓝色），被还原后颜色消失；还原型抗坏血酸还呈蓝色），被还原后颜色消失；还原型抗坏血酸还原染料后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。在没有杂原染料后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。在没有杂质干扰时，一定量的样品提
37、取液还原标准染料液的质干扰时，一定量的样品提取液还原标准染料液的量，与样品中抗坏血酸含量成正比。量，与样品中抗坏血酸含量成正比。试剂试剂 1%1%草酸溶液草酸溶液 2%2%草酸溶液草酸溶液 抗坏血酸标准溶液抗坏血酸标准溶液 2 2，6 6二氯靛酚溶液二氯靛酚溶液 0.001 0.001mol/Lmol/L碘酸钾标准溶液碘酸钾标准溶液:精确称取干燥的碘酸钾精确称取干燥的碘酸钾0.35670.3567g g，用水稀释至用水稀释至100100mlml，取出取出1ml1ml，用水稀至用水稀至100100mlml，此溶液此溶液1ml1ml相当于抗坏血酸相当于抗坏血酸0.0880.088mgmg。1%1%
38、淀粉溶液淀粉溶液 6%6%碘化钾溶液碘化钾溶液l抗坏血酸标准溶液的配制及标定：抗坏血酸标准溶液的配制及标定：配制配制：准确称取准确称取2020mgmg抗坏血酸，溶于抗坏血酸，溶于1 1的草酸中，的草酸中，并稀释至并稀释至100100mlml，置冰箱中保存。用时取出置冰箱中保存。用时取出5ml5ml，置于置于5050mlml容量瓶中，用容量瓶中，用1 1草酸溶液定容，配成草酸溶液定容，配成0.020.02mg/mlmg/ml的抗坏血酸标准溶液。的抗坏血酸标准溶液。标定：标定：吸取标准使用液吸取标准使用液 5ml5ml于三角瓶中，加入于三角瓶中，加入 6 6碘碘化钾溶液化钾溶液0.50.5mlml
39、、1 1淀粉溶液淀粉溶液3 3滴，以滴，以0.000.00lmollmol/L/L碘酸碘酸钾标准溶液滴定，终点为淡蓝色。钾标准溶液滴定，终点为淡蓝色。C-抗坏血酸标准溶液的浓度，抗坏血酸标准溶液的浓度，mg/mg/mLmL；V V1 1-滴定时消耗滴定时消耗 0.001 0.001mol/Lmol/L碘酸钾标准溶液的体积，碘酸钾标准溶液的体积，mLmL；V V2 2-滴定时所取抗坏血酸的体积，滴定时所取抗坏血酸的体积，mLmL；0.0880.088-lmL0.001mollmL0.001mol碘酸钾标准溶液相当于抗坏血酸碘酸钾标准溶液相当于抗坏血酸的量，的量，mg/mg/mLmL21088.0
40、VVCl2 2，6-6-二氯靛酚溶液的配制和标定二氯靛酚溶液的配制和标定 配制：配制：称取称取2 2，6 6二氯靛酚二氯靛酚5050mgmg，溶于溶于200200mLmL含有含有5252mgmg碳酸氢钠的热水中，待冷，置于冰箱中过夜。碳酸氢钠的热水中，待冷，置于冰箱中过夜。次日过滤于次日过滤于250250mLmL棕色容量瓶中，定容，在冰箱中保棕色容量瓶中，定容，在冰箱中保存。每星期标定存。每星期标定1 1次。次。标定：标定：取取5 5mlml已知浓度的抗坏血酸标准溶液，加入已知浓度的抗坏血酸标准溶液，加入1 1草酸溶液草酸溶液5ml5ml，摇匀，用摇匀，用2 2，6 6二氯靛酚溶液滴定至二氯靛
41、酚溶液滴定至溶液呈粉红色，在溶液呈粉红色，在1515s s不褪色为终点。不褪色为终点。计算计算:式中：式中：T-T-每毫升染料溶液相当于抗坏血酸的毫克数，每毫升染料溶液相当于抗坏血酸的毫克数，mg/mg/mLmL；C-C-抗坏血酸的浓度，抗坏血酸的浓度，mg/mg/mLmL；V V1 1-抗坏血酸标准溶液的体积，抗坏血酸标准溶液的体积，mlml；V V2 2-消耗消耗 2 2，6-6-二氯靛酚的体积，二氯靛酚的体积，mlml21VVCT测定步骤测定步骤 提取提取:鲜样的制备鲜样的制备:称称100100g g鲜样，加等量的鲜样，加等量的2 2草酸溶液，于组草酸溶液，于组织捣碎机中打成匀浆。取织捣
42、碎机中打成匀浆。取10104040g g匀浆于匀浆于100100mlml 容量瓶内，容量瓶内，用用1 1草酸稀释至刻度，混合均匀。草酸稀释至刻度，混合均匀。干样的制备干样的制备:称称1 14 4g g干样放入乳钵内加干样放入乳钵内加 l l草酸溶液磨成草酸溶液磨成匀浆，倒入匀浆，倒入100100mlml容量瓶中，用容量瓶中，用 1 1草酸稀释至刻度。过草酸稀释至刻度。过滤上述样液，不易过滤的可用离心机沉淀后，倾出上清滤上述样液，不易过滤的可用离心机沉淀后，倾出上清液过滤备用液过滤备用。滴定：滴定：吸取吸取 5 51010mlml滤液，快速用滤液，快速用 2,6-2,6-二氯靛酚溶液滴定，二氯靛
43、酚溶液滴定，直到红色不能立即消失，而后再尽快地一滴一滴的直到红色不能立即消失，而后再尽快地一滴一滴的加入（样品中可能存在其他还原性杂质，但一般杂加入（样品中可能存在其他还原性杂质，但一般杂质还原染料的速度均比抗坏血酸慢），以呈现的粉质还原染料的速度均比抗坏血酸慢），以呈现的粉红色在红色在1515s s内不消失为终点。同时做空白。内不消失为终点。同时做空白。结果计算结果计算式中：式中：x-x-样品中抗坏血酸含量，样品中抗坏血酸含量，mg/100gmg/100g；T-1mL T-1mL染料溶液相当于抗坏血酸标准溶液的量，染料溶液相当于抗坏血酸标准溶液的量，mg/mg/mLmL；V-V-滴定样液时消
44、耗染料的体积，滴定样液时消耗染料的体积，mLmL；V V0 0-滴定空白时消耗染料的体积，滴定空白时消耗染料的体积，mLmL；m-m-滴定时所取滤液中样品的质量，滴定时所取滤液中样品的质量，g g。100)(0mTVVX说明说明 所有试剂最好用重蒸馏水配制。所有试剂最好用重蒸馏水配制。样品采取后，应浸泡在已知量的样品采取后，应浸泡在已知量的2%2%草酸溶液中，以防草酸溶液中，以防止维生素止维生素C C氧化损失。操作过程要迅速，防止抗坏血酸氧化损失。操作过程要迅速，防止抗坏血酸被氧化。被氧化。若测动物性样品，须用若测动物性样品，须用10%10%三氯乙酸代替三氯乙酸代替2%2%草酸溶液草酸溶液提取
45、。提取。若样品滤液颜色较深，影响滴定终点观察，可加入白若样品滤液颜色较深，影响滴定终点观察，可加入白陶土再过滤，过滤后要迅速滴定。陶土再过滤，过滤后要迅速滴定。若样品中含有若样品中含有FeFe2+2+、CuCu2+2+、SnSn2+2+、亚硫酸盐、硫代硫酸亚硫酸盐、硫代硫酸盐等还原性杂质时，会使结果偏高。盐等还原性杂质时，会使结果偏高。（二）（二）2 2，4 4二硝基苯肼比色法二硝基苯肼比色法原理原理 总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸，总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸，样品中还原型抗血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，样品中还原型抗血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再与再与2 2
46、，4-4-二硝基苯肼生成红色的脎，在浓硫酸的脱二硝基苯肼生成红色的脎，在浓硫酸的脱水作用下，可转变为桔红色的无水化合物水作用下，可转变为桔红色的无水化合物双双-2-2，4-4-二硝基苯肼，在浓硫酸中显色稳定，吸光度的大二硝基苯肼，在浓硫酸中显色稳定，吸光度的大小与总抗坏血酸含量成比，进行比色定量。小与总抗坏血酸含量成比，进行比色定量。操作过程：操作过程：样品处理样品处理氧化氧化 呈色呈色 硫酸处理硫酸处理 比色比色 数据处理数据处理 （1 1）样品制备：）样品制备：同同2 2，6-6-二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法 （2 2）氧化处理：）氧化处理：取取 25 25mLmL上述滤液，加入上述滤液，
47、加入 2g2g活性炭，振活性炭，振摇摇 lminlmin，过滤，弃去最初数毫升滤液。取过滤，弃去最初数毫升滤液。取1010mLmL此氧化此氧化提取液，加入提取液，加入 10 10mLmL 20g/L 20g/L的硫脲溶液，混匀。的硫脲溶液，混匀。（3 3）呈色反应：）呈色反应：于三个试管中各加入于三个试管中各加入4 4mLmL经氧化的样品稀释液经氧化的样品稀释液,一个试一个试管作为空白，在其余试管中加入管作为空白，在其余试管中加入1.01.0mLmL 20g/L 2 20g/L 2，4-4-二硝基苯肼溶液，将所有试管放入（二硝基苯肼溶液，将所有试管放入（3737士士0.50.5）恒温箱或水浴中
48、，保温恒温箱或水浴中，保温3 3h h。3h3h后取出，除空后取出，除空白管外，将所有试管放入冰水中。空白管冷到室温，白管外，将所有试管放入冰水中。空白管冷到室温，然后加入然后加入 1.0 1.0mLmL 20g/L 2,4-20g/L 2,4-二硝基苯肼溶液，在室温二硝基苯肼溶液，在室温中放置中放置10101515minmin后放入冰水内。其余步骤同样品。后放入冰水内。其余步骤同样品。（4 4）硫酸（）硫酸（9 91 1）处理）处理 当试管放入冰水后，向每一试管中加入当试管放入冰水后，向每一试管中加入5mL5mL硫酸（硫酸（9 9十十1 1）滴加时间至少需要）滴加时间至少需要1min1min
49、，（，（防止溶液温度升高而使防止溶液温度升高而使部分有机物分解着色，影响空白值），需边加边摇动部分有机物分解着色，影响空白值），需边加边摇动试管。将试管自冰水中取出，在室温放置试管。将试管自冰水中取出，在室温放置3030minmin后比色。后比色。（5 5）比色）比色 用用1cm1cm比色杯，以空白液调零点，于比色杯，以空白液调零点，于500500nmnm波长测吸光波长测吸光值。值。(6)(6)标准曲线绘制标准曲线绘制加加 2g2g活性炭于活性炭于 50 50mlml标准溶液（标准溶液（1 1mg/mg/mLmL）中，摇动中，摇动 1min1min，过滤。过滤。取取1010mLmL滤液放入滤液
50、放入500500mlml容量瓶中，加容量瓶中，加 5.0 5.0g g硫脲，用硫脲，用 1010g/Lg/L的草酸溶液稀释至刻度，抗坏血酸浓度的草酸溶液稀释至刻度，抗坏血酸浓度2020g/mLg/mL。取取5 5、1010、2020、2525、4040、5050、6060mlml稀释液，分别放入稀释液，分别放入7 7个个100100mlml容量瓶中，用容量瓶中，用 10 10g/Lg/L硫脲溶液稀释至刻度，使最硫脲溶液稀释至刻度，使最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为1 1、2 2、4 4、5 5、8 8、1010、12 12 g/g/mLmL。按样品测定步骤进行显色
