1、2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 人教版高中生物选修一 与题2 微生物的培养不应用 一、课题背景一、课题背景 （一） 筛选菌株 （二）统计菌落数目 （三）设置对照 二、研究思路二、研究思路 1、 科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶 启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环 境中去寻找。 筛选原因：因为热泉的70800C高温条件淘汰了绝大多数微生 物，使耐热的Taq细菌保留下来。 PCRPCR是是一种在体一种在体外外DNADNA复复制的技术，此项技术要求使用耐高温制的技术，此项技术要求使用耐高温 （93930 0C C）的的DNADNA聚合酶。聚合酶。 19661966年
2、，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热 的的TaqTaq细菌，并分离到耐高温的细菌，并分离到耐高温的DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶）。酶）。 （一）筛选菌株 耐高温的酶 耐高温生物体 高温环境（热泉、火山口） 寻找 寻找 土壤中分解尿素的细菌的 分离不计数所需培养基： 从物理性质看此培养基属于哪类？ 固体培养基 （一）筛选菌株 在此培养基中哪些作为碳源、氮源？ 碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素 该培养基选择分解尿素的细菌的原理？ 培养基中尿素为唯一氮源，只有能合成 脲酶的细菌才能分解并利用尿素。缺乏 脲酶的微生物由于丌能分解
3、尿素，缺乏 氮源而丌能生长发育繁殖，而受到抑制 人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时 抑制或阻止其他微生物生长。 2、实验室中微生物的筛选原理： 结果：培养一定时间后，目的菌数量上升，再通过稀释涂布平板等方 法对它进行纯化培养。 允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的 培养基，叫做选择培养基。 6 6、怎样证明此培养基具有选择性呢？、怎样证明此培养基具有选择性呢？ 以尿素为以尿素为 唯一氮源唯一氮源 的培养基的培养基 牛肉膏牛肉膏 蛋白胨蛋白胨 培养基培养基 是是 分离分离 尿素尿素 细菌细菌 判断该判断该 培养基培养基 有无选有无选 择性择性
4、 实验组实验组 对照组对照组 培养基类型培养基类型 是否是否 接种接种 目的目的 结果结果 只生长能分只生长能分 解尿素的细解尿素的细 菌菌 生长多种微生长多种微 生物生物 是是 （一） 筛选菌株 （二）统计菌落数目 （三）设置对照 二、研究思路二、研究思路 1、显微镜直接计数： 利用血球计数板(血细胞计数板），在显微镜下计算一定容积里 样品中微生物的数量。 丌能区分死菌不活菌（数值偏大）； 丌适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察； 缺点： （二）统计菌落数目 2.间接计数法（活菌计数法） （1）常用方法：常用方法：稀释涂布平板法稀释涂布平板法。 （2
5、）原理原理：在在稀释度足够高稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个时，微生物在固体培养基上所形成的一个 菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一一个菌落代表原先的一个细菌个细菌 （二）统计菌落数目 实验成功的关键：实验成功的关键： 稀释度要恰当，稀释度要恰当， 涂布操作要正确涂布操作要正确 选择菌落数在30- -300的平板上进 行计数 例题例题 某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平 均数为234，那么每克样品中的细菌数是（涂布平板时所用 稀释液的体积为0.1ml） ( ) A. 2.34108 B. 2.34109 C
6、. 234 D. 23.4 B 每克样品中的菌株数 =（CV）M C C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数。 V V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积：代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mLmL）。 M M：代表稀释倍数：代表稀释倍数。 第一位同学第一位同学：只涂一：只涂一 个平板，没有个平板，没有重复重复实实 验，验，因此不具有说服因此不具有说服 力。力。 第二第二位同学位同学：2121这个这个 数据小于数据小于3030，说明误，说明误 差较大，不应用于差较大，不应用于计计 算平均算平均值。值。 实验案例：实验案例： 注意事项 选择菌落数在30-
7、300的平板上进行计数。 用三个或三个以上的平板，计算出菌落平均数 （重复实验，减少误差）。 统计的细菌数往往比实际数目低。 因为当两个或多因为当两个或多 个细胞连在一起个细胞连在一起 时，繁殖后形成时，繁殖后形成 的还是一个菌落的还是一个菌落 （二）统计菌落数目 通通过这过这个实验案例可个实验案例可以看出，实验结果要有说服力，以看出，实验结果要有说服力， 对照的设置对照的设置是必不可少的。是必不可少的。 验证假设一：验证假设一：其其他同学用与他同学用与A A同学相同土同学相同土样进样进行实验行实验 验证假设二：验证假设二：将将A A同学配制的培养同学配制的培养基，在基，在不加土样不加土样的情
8、况的情况 下进行培养，作为下进行培养，作为空白对照空白对照，以证明培养基是否受到污染。，以证明培养基是否受到污染。 如如果结果与果结果与A A同学一致，则证明同学一致，则证明A A无误无误； 如如果结果不同，则证明果结果不同，则证明A A同学存在操作失误或培养同学存在操作失误或培养基污染。基污染。 判断培养基中是否有杂菌污染： 将未接种的培养基同时进行培养。 判断选择培养基是否具有筛选作用： 完全培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）接种后培养观察菌落数目。 主要目的是排除实验组中非测试因素（无关变量）对实验 结果的影响，提高实验结果的可信度。 （三）设置对照 实验的基本原则实验的基本原则 平行重复原则
9、平行重复原则 对照原则对照原则 第一变量原则第一变量原则 实验流程：实验流程： 土壤取样土壤取样 三、实验设计三、实验设计 样品稀释涂布平板样品稀释涂布平板 微生物的培养与观察微生物的培养与观察 菌落计数菌落计数 制备培养基制备培养基 从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。先铲去表层土3 cm 左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 “微生物的天然培养基” 数量最大、种类最多 大约70%90%是细菌 取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。 三、实验设计三、实验设计 （一）土壤取样 准备选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。 每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基。
10、 在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目，应明显多亍选择培养基。 因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否 起到了选择作用。 三、实验设计三、实验设计 （二）制备培养基 三、实验设计三、实验设计 （三）样品的稀释 稀释倍数稀释倍数 目的目的 细菌细菌 10104 4、10105 5、10106 6 保证获得菌落数保证获得菌落数 在在3030300300之间、之间、 适于计数的平板适于计数的平板 放线菌放线菌 10103 3、10104 4、10105 5 真菌真菌 10102 2、10103 3、10104 4 分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度
11、 原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同 实验时要对培养皿作好标记。 三、实验设计三、实验设计 （四）涂布 注明：培养基类型、稀释度、 培养时间、培养物等。 在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间丌足而导致 遗漏菌落的数目。 培养丌同微生物往往需要丌同培养温度。 细菌：3037培养12d 放线菌：2528培养57d 霉菌：2528的温度下培养34d。 三、实验设计三、实验设计 （五）微生物的培养与观察 菌落的形状、大小、隆起程度、颜色 三、实验设计三、实验设计 （五）微生物的培养与观察 一无菌操作 1、取土用的小
12、铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。 2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥 形瓶中，塞好棉塞。 3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。 二做好标记 注明培养基种类、培养日期、平板培养样品 的稀释度等。 三制定计划 四、操作提示四、操作提示 五、结果分析与五、结果分析与评价评价 1 1、结合结合对照对照，分析培养物中是否有分析培养物中是否有杂菌污染杂菌污染以及选择以及选择 培养基是否培养基是否筛选出筛选出一些菌落一些菌落。 2 2、是否获得了某一稀释度下是否获得了某一稀释度下，菌落数目在菌落数目在3030300300 的平板的平板。在这稀释度下在这稀释度下，是否至
13、少有两个平板的菌落是否至少有两个平板的菌落 数相近数相近？ 3 3、你统计的每克土壤中含有能分解尿素的细菌的你统计的每克土壤中含有能分解尿素的细菌的菌落菌落 数数是多少是多少？与其他同学的结果接近吗与其他同学的结果接近吗？如果差异很大如果差异很大， 可能是什么原因引起的可能是什么原因引起的？ 鉴定：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某 种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解 尿素。 六、六、课课题延伸题延伸 思考：在以尿素作为唯一氮源的培养基中分离出的 微生物都是能分解尿素的吗？ 不一定。因为有些微生物可以利用其他微生物的代谢 产物进行生长繁殖。 CO(NH2)
14、2 脲酶 + H2O + CO2 2NH3 六、六、课课题延伸题延伸 选择培养基 特殊成分 加入某种化学物质 目的 抑制其他微生物生长， 促进目的微生物的生长 用途 举例 鉴别培养基 加入某种指示剂 发生特定颜色反应 分离出特定微生物 鉴别不同的微生物 用尿素作唯一氮源的培 养基来筛选尿素分解菌 伊红美蓝培养基 鉴定大肠杆菌 选择培养基和鉴别培养基 测测定饮水中大肠杆菌数量的方定饮水中大肠杆菌数量的方法：法： 是是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红伊红- -美蓝美蓝 培养基培养基 上培养，上培养，大肠杆菌大肠杆菌菌落呈现菌落呈现黑色黑色，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。 六、六、课课题延伸题延伸 本课题知识小结本课题知识小结: :
