1、海南大学农学院wss12023-6-27第七章第七章 亲和层析亲和层析Affinity chromatography海南大学农学院wss22023-6-27技术背景技术背景n各种大分子物质之间理化特性的差异性。各种大分子物质之间理化特性的差异性。n但如果这种差异性较小，纯化较麻烦，最终收得但如果这种差异性较小，纯化较麻烦，最终收得率很低。率很低。海南大学农学院wss32023-6-27内容提要内容提要第一节第一节 基本原理基本原理第二节第二节 操作操作第三节第三节 提高吸附剂的操作容量提高吸附剂的操作容量第四节第四节 应用实例应用实例海南大学农学院wss42023-6-27第一节第一节 基本原
2、理基本原理蛋白质蛋白质2 2与配体无与配体无生物学特异性生物学特异性L LMMS S海南大学农学院wss52023-6-27一、亲和层析的概念一、亲和层析的概念n亲和力亲和力n 根据生物体中高分子化合物能与之相对应的专一分根据生物体中高分子化合物能与之相对应的专一分子子特异识别和可逆结合特异识别和可逆结合的特征，将生物分子间的这种结的特征，将生物分子间的这种结合能力称为亲和力。合能力称为亲和力。海南大学农学院wss62023-6-27n亲和层析法亲和层析法n 利用生物大利用生物大分子和固定相表分子和固定相表面存在某种面存在某种特异特异性吸附性吸附而进行选而进行选择性分离的一种择性分离的一种生物
3、大分子分离生物大分子分离的层析方法。的层析方法。海南大学农学院wss92023-6-27海南大学农学院wss102023-6-27海南大学农学院wss112023-6-27 二、二、亲和层析法的作用机理亲和层析法的作用机理固相载体固相载体(1)(2)(3)ABSampleWashingElutionXB亲和基团亲和基团配体配体XBAA海南大学农学院wss122023-6-27海南大学农学院wss132023-6-27n特异性配体亲和层析法和特异性配体亲和层析法和通用性配体亲和通用性配体亲和层层析法：析法：方法方法配体配体性能性能特异性配体亲和特异性配体亲和层析法层析法复杂的生命大分子复杂的生命
4、大分子物质（如抗体、受物质（如抗体、受体和酶的类似底物体和酶的类似底物等）等）具有较强的吸附选具有较强的吸附选择性和较大的结合择性和较大的结合力力通用性配体亲和通用性配体亲和层析法层析法简单的小分子物质简单的小分子物质（如金属、染料、（如金属、染料、以及氨基酸等）以及氨基酸等）成本低廉，具有较成本低廉，具有较高的吸附容量，通高的吸附容量，通过改善吸附和脱附过改善吸附和脱附条件可提高层析的条件可提高层析的分辨率分辨率海南大学农学院wss142023-6-27三、亲和层析具备的三要素三、亲和层析具备的三要素n介质介质(基质基质)具有活化基团具有活化基团n间隔臂 连接介质与配体的分子n配体配体 具有
5、识别能力具有识别能力n反配体（分离物）反配体（分离物）与配体进行可逆结合与配体进行可逆结合海南大学农学院wss152023-6-27 四、四、亲和层析法的四要点亲和层析法的四要点(2)SpecificBindingSubstance(S)溶溶 解解Elution(4)配配 体体Ligand(L)偶合反应偶合反应 (3)Coupling Reaction杂杂 质质SSSS(1)Solid MatrixS海南大学农学院wss162023-6-27五、亲和层析的特点五、亲和层析的特点n条件温和：条件温和：不影响样品的生物活性，适合生物大不影响样品的生物活性，适合生物大分子的操作。分子的操作。n纯化效
6、率高：纯化效率高：一步法分离和纯化混合物中的样品，一步法分离和纯化混合物中的样品，提纯达几千倍提纯达几千倍,得到高纯度样品。得到高纯度样品。n选择性强：选择性强：依据生物学特异性，而非物理化学性依据生物学特异性，而非物理化学性质分离原理。故特异的层析图为质分离原理。故特异的层析图为2 2个峰，第个峰，第1 1个为个为杂峰，第杂峰，第2 2峰为纯品。峰为纯品。海南大学农学院wss172023-6-27Activity 典型的亲和层析操作：典型的亲和层析操作：Elution volumeProteinpH 2.05*海南大学农学院wss182023-6-27五、亲和层析的特点五、亲和层析的特点n柱
7、层析柱小柱层析柱小 VtVt1 11.5ml1.5ml。上样量大。上样量大,达达 1/2Vt1/2Vt体积并对样品的浓度与纯度要求不高。体积并对样品的浓度与纯度要求不高。n操作简单，时间快速。操作简单，时间快速。n柱子填充载体昂贵，配体的特异性，有时找不柱子填充载体昂贵，配体的特异性，有时找不到适宜的配体，不适合所有生物大分子样品。到适宜的配体，不适合所有生物大分子样品。PriboFast黄曲霉毒黄曲霉毒素素B1免疫免疫层析亲和柱层析亲和柱 海南大学农学院wss192023-6-27内容提要内容提要第一节第一节 基本原理基本原理第二节第二节 操作操作第三节第三节 提高吸附剂的操作容量提高吸附剂
8、的操作容量第四节第四节 应用实例应用实例海南大学农学院wss202023-6-27二、配基（配体）的选择二、配基（配体）的选择第二节第二节 操作操作 一、理想基质的性质一、理想基质的性质n优良的配体必须具备两个条件：优良的配体必须具备两个条件：n配体与生物大分子具有合适的亲和力；配体与生物大分子具有合适的亲和力；n配体具有与载体牢固地结合，又不影响与生配体具有与载体牢固地结合，又不影响与生物大分子之间的亲和力。物大分子之间的亲和力。海南大学农学院wss212023-6-27常用配体常用配体分离对象分离对象酶蛋白酶蛋白基质类似物、抑制剂、辅酶、底物、产物等基质类似物、抑制剂、辅酶、底物、产物等抗
9、抗 体体抗原、病毒、细胞抗原、病毒、细胞外源凝集素外源凝集素多糖、糖蛋白、细胞表面受体、结合蛋白多糖、糖蛋白、细胞表面受体、结合蛋白核核 酸酸互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶、结合互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶、结合蛋白蛋白激素及维生素激素及维生素受体、载体蛋白受体、载体蛋白细细 胞胞细胞表面特异性蛋白、外源凝集素细胞表面特异性蛋白、外源凝集素专一性结合的生物体系专一性结合的生物体系海南大学农学院wss222023-6-27配体配体待纯化的蛋白质待纯化的蛋白质配体配体待纯化的蛋白质待纯化的蛋白质抗原抗原特定单克隆抗体或多特定单克隆抗体或多克隆抗体克隆抗体肝素肝素凝聚因子、脂酶、结凝聚因子、脂
10、酶、结缔组织蛋白酶、缔组织蛋白酶、DNADNA聚聚合酶合酶单克隆抗体单克隆抗体特定抗原特定抗原胆固醇胆固醇胆固醇受体、胆固醇胆固醇受体、胆固醇结合蛋白结合蛋白蛋白质蛋白质A/A/蛋白蛋白质质G G免疫球蛋白免疫球蛋白脂肪酸脂肪酸脂肪酸结合蛋白、白脂肪酸结合蛋白、白蛋白蛋白蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂蛋白酶蛋白酶核苷酸核苷酸核苷酸结合蛋白、需核苷酸结合蛋白、需核苷酸的酶核苷酸的酶磷酸磷酸磷酸酶磷酸酶苯基硼酸苯基硼酸盐盐糖蛋白糖蛋白三嗪染料三嗪染料脱氢酶、激酶、聚合脱氢酶、激酶、聚合酶、限制酶、干扰素酶、限制酶、干扰素凝集素凝集素糖蛋白糖蛋白抗生物素蛋白抗生物素蛋白含生物素的酶含生物素的酶糖糖凝集素、
11、糖苷酶凝集素、糖苷酶蛋白质亲和层析中的合适配体蛋白质亲和层析中的合适配体海南大学农学院wss232023-6-27三、亲和吸附剂的制备三、亲和吸附剂的制备n载体的活化载体的活化（CNBrCNBr）n配体的偶联配体的偶联n结合能力的测定结合能力的测定用溴化氰活化载体用溴化氰活化载体海南大学农学院wss242023-6-27海南大学农学院wss252023-6-27四、四、特异性吸附特异性吸附 欲分离物质与亲和吸附剂结合，当结合力较欲分离物质与亲和吸附剂结合，当结合力较强时，配体与有效成分紧密结合，随着样品的加强时，配体与有效成分紧密结合，随着样品的加入，亲和成分恒定增加并不断地吸附上柱，形成入，
12、亲和成分恒定增加并不断地吸附上柱，形成致密的复合物带，使吸附容量增至最大，达到饱致密的复合物带，使吸附容量增至最大，达到饱和。影响吸附容量除亲和力外和还与和。影响吸附容量除亲和力外和还与pHpH、离子强、离子强度有关。度有关。复合物带复合物带 海南大学农学院wss262023-6-27 样品中有效成分样品中有效成分在亲和吸附剂上的在亲和吸附剂上的吸附量，除了与它吸附量，除了与它们之间的亲和力有们之间的亲和力有密切关系外，还与密切关系外，还与样品的样品的pHpH值和离子值和离子强度强度有关系。有关系。海南大学农学院wss272023-6-27五、层析步骤五、层析步骤n样品制备样品制备 结合步骤结
13、合步骤 装柱操作装柱操作n流速控制流速控制 洗脱方法洗脱方法 淋洗淋洗n洗脱目标样品洗脱目标样品 柱子再生柱子再生选择配体选择配体凝胶与配体偶联凝胶与配体偶联柱子平衡柱子平衡海南大学农学院wss282023-6-27洗脱方法洗脱方法海南大学农学院wss292023-6-27A.特异性洗脱：特异性洗脱：凡是能与配体竞争酶的游离配体，都十分强烈凡是能与配体竞争酶的游离配体，都十分强烈地影响着结合酶的洗脱过程。游离配体浓度若与地影响着结合酶的洗脱过程。游离配体浓度若与配体浓度相同，则可直接从基质上洗脱小结合的配体浓度相同，则可直接从基质上洗脱小结合的酶。同时应根据酶与配体亲和力的大小确定洗脱酶。同时
14、应根据酶与配体亲和力的大小确定洗脱液的浓度。液的浓度。B.非特异性洗脱：非特异性洗脱：通过改变洗脱液的条件（通过改变洗脱液的条件（pHpH、离子强度、温度、离子强度、温度和介电常数），即能改变蛋白质的构象，降低蛋和介电常数），即能改变蛋白质的构象，降低蛋白质与配体的亲和力、不损害蛋白质与吸附剂的白质与配体的亲和力、不损害蛋白质与吸附剂的稳定性。稳定性。海南大学农学院wss302023-6-27内容提要内容提要第一节第一节 基本原理基本原理第二节第二节 操作操作第三节第三节 提高吸附剂的操作容量提高吸附剂的操作容量第四节第四节 应用实例应用实例海南大学农学院wss312023-6-27第三节第三
15、节 提高吸附剂的操作容量提高吸附剂的操作容量亲和吸附剂的操作容量，受以下因素的影响：亲和吸附剂的操作容量，受以下因素的影响：l 配体性质配体性质l 配体在吸附剂中的含量配体在吸附剂中的含量l 配体与吸附物结合时的位阻效应大小配体与吸附物结合时的位阻效应大小l 基质的多孔性基质的多孔性l 操作条件等操作条件等海南大学农学院wss322023-6-27一、引入间隔手臂一、引入间隔手臂小分子配体直接连接于琼脂糖上会产生无效吸附，小分子配体直接连接于琼脂糖上会产生无效吸附，其原因是由于载体的空间位阻关系，使大分子化合其原因是由于载体的空间位阻关系，使大分子化合物（亲和物）不物（亲和物）不能直接接触到配
16、能直接接触到配体。因此，通过在体。因此，通过在载体与配体之间引载体与配体之间引入适当长度的入适当长度的“手手臂臂”减少载体的空减少载体的空间位阻，增加配间位阻，增加配体的活动度。体的活动度。海南大学农学院wss332023-6-27对氨基苯对氨基苯-硫代吡喃半乳糖苷硫代吡喃半乳糖苷氨乙基乙酰胺氨乙基乙酰胺常见的间隔臂是常见的间隔臂是6 68 8个碳原子的碳氢链，基质到配个碳原子的碳氢链，基质到配体的长度为体的长度为0.50.51nm1nm；或用长达；或用长达1717个碳原子。个碳原子。间隔臂间隔臂:不同长度的间隔臂不同长度的间隔臂（B B1nm1nm），），(C=2.1nm)(C=2.1nm)
17、对对靶酶的亲和力的差异。靶酶的亲和力的差异。海南大学农学院wss342023-6-27二、增加配体取代的程度二、增加配体取代的程度n基质的活性基团增多，配体结合量增加，操作容量基质的活性基团增多，配体结合量增加，操作容量亦大；由于位阻效应而影响配体的偶联量，故控制亦大；由于位阻效应而影响配体的偶联量，故控制偶联反应偶联反应的条件可增的条件可增加配体的偶加配体的偶联数量。联数量。海南大学农学院wss352023-6-27三、减少结合键增加配体与蛋白质的互补效三、减少结合键增加配体与蛋白质的互补效应应n以蛋白质与多肽为配体时，以最少的共价键连接至以蛋白质与多肽为配体时，以最少的共价键连接至载体，利
18、于保护蛋白质的高级结构及生物活性；载体，利于保护蛋白质的高级结构及生物活性；n控制偶联反应的控制偶联反应的pHpH，减少蛋白质分子与基质连接的，减少蛋白质分子与基质连接的键；位点的减少，可以结合更多的蛋白质，提高结键；位点的减少，可以结合更多的蛋白质，提高结合容量。合容量。四、残留活化基团的封闭四、残留活化基团的封闭n封闭多余的活化基团，避免非封闭多余的活化基团，避免非特异性吸附。特异性吸附。海南大学农学院wss362023-6-27内容提要内容提要第一节第一节 基本原理基本原理第二节第二节 操作操作第三节第三节 提高吸附剂的操作容量提高吸附剂的操作容量第四节第四节 应用实例应用实例海南大学农
19、学院wss372023-6-27第四节第四节 应用应用A.A.不保留峰不保留峰B.B.脱附峰脱附峰纵坐标示吸收值纵坐标示吸收值横坐标示洗脱体积横坐标示洗脱体积n亲和层析的基础是对蛋白质进行选择性的吸附亲和层析的基础是对蛋白质进行选择性的吸附脱附，一般的结果是层析图谱上出现二个层析峰，脱附，一般的结果是层析图谱上出现二个层析峰，不保留峰与脱附峰，脱附动力学一般较慢，脱附不保留峰与脱附峰，脱附动力学一般较慢，脱附的层析峰宽而拖尾。的层析峰宽而拖尾。VeVeA280A280海南大学农学院wss382023-6-27亲和层析应用亲和层析应用一、纯化特异性生物分子一、纯化特异性生物分子1.1.纯化抗原、
20、抗体及其结合物；纯化抗原、抗体及其结合物；2.2.分离糖蛋白、各种凝集素；分离糖蛋白、各种凝集素；3.3.含巯基蛋白质的分离；含巯基蛋白质的分离；4.4.用寡聚核苷酸分离核酸；用寡聚核苷酸分离核酸；5.5.凝集素配体结合膜蛋白的分离技术。凝集素配体结合膜蛋白的分离技术。海南大学农学院wss392023-6-27亲和吸附剂：基质亲和吸附剂：基质-间隔臂间隔臂-抗体抗体(抗原抗原)组组成，用于鉴定、分离、纯化样品中的抗原成，用于鉴定、分离、纯化样品中的抗原(抗体抗体)1.1.抗原、抗抗原、抗体的纯化体的纯化海南大学农学院wss402023-6-27Protein AProtein A对对IgGIg
21、G类物质有较大的束缚力，加之免疫球蛋白被类物质有较大的束缚力，加之免疫球蛋白被束缚之后仍保留了束缚之后仍保留了IgGIgG束缚抗原的特性。所以利用结合束缚抗原的特性。所以利用结合IgGIgG的的Protein A-Sepharose CL-4BProtein A-Sepharose CL-4B吸附剂还可分离特异性的抗原。吸附剂还可分离特异性的抗原。海南大学农学院wss412023-6-272.2.纯化糖类分子纯化糖类分子n配体为外源凝集素的配体为外源凝集素的Sepharose 6BSepharose 6B的亲和层析介质，的亲和层析介质，特异地结合碳水化合物的糖类特异地结合碳水化合物的糖类残基或
22、糖化细胞膜组分、细胞、残基或糖化细胞膜组分、细胞、亚细胞结构及糖蛋白等。亚细胞结构及糖蛋白等。海南大学农学院wss422023-6-27凝集素和糖蛋白的亲和层析分离凝集素和糖蛋白的亲和层析分离n 凝集素凝集素是在自然界广泛存在的一大类糖结合蛋白。是在自然界广泛存在的一大类糖结合蛋白。它们它们具有不同的糖结合专一性具有不同的糖结合专一性。利用天然存在的一些。利用天然存在的一些多糖和被固定化的不同糖链结构的糖蛋白，可以有效多糖和被固定化的不同糖链结构的糖蛋白，可以有效地分离纯化不同型的凝集素，也可应用固定化的凝集地分离纯化不同型的凝集素，也可应用固定化的凝集素分离纯化各种糖蛋白。素分离纯化各种糖蛋
23、白。海南大学农学院wss432023-6-27n 不同的糖蛋白具有不同的单相组分和糖链结构，不同的糖蛋白具有不同的单相组分和糖链结构，它们和不同的凝集素呈现出不同的结合能力。它们和不同的凝集素呈现出不同的结合能力。n常用的凝集素常用的凝集素 ：n Con A Con A、LCA LCA 对甘露糖专一对甘露糖专一n WGA WGA 对对N-N-乙酰氨基葡萄糖专一乙酰氨基葡萄糖专一海南大学农学院wss442023-6-27AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA带带PolyU(T)的亲和吸附剂的亲和吸附剂分离含分离含PolyA
24、尾巴的尾巴的mRNA3.3.分离核酸分离核酸海南大学农学院wss452023-6-27海南大学农学院wss462023-6-27SDS-PAGE4.4.以亲和层析法纯化以亲和层析法纯化 TrypsinTrypsin：CHOMTrypsinA B C&D Disc-PAGEA B C =D以凝胶电泳鉴定亲和层析以凝胶电泳鉴定亲和层析操作过程各步骤的样本操作过程各步骤的样本Chitin海南大学农学院wss472023-6-275.5.受体蛋白的纯化受体蛋白的纯化n由于受体蛋白在激素与其由于受体蛋白在激素与其互补的膜结合中的重要作互补的膜结合中的重要作用，同时其含量极低，使用，同时其含量极低，使研究
25、受阻。利用亲和层析研究受阻。利用亲和层析法分离受体蛋白成为可能。法分离受体蛋白成为可能。n例：胰岛素受体蛋白的纯例：胰岛素受体蛋白的纯化：将胰岛素偶联到溴化化：将胰岛素偶联到溴化氰活化的琼脂糖凝胶，结氰活化的琼脂糖凝胶，结合受体蛋白，特异性洗脱，合受体蛋白，特异性洗脱，释放出目标蛋白质。释放出目标蛋白质。海南大学农学院wss482023-6-27n6.6.重组蛋白重组蛋白n 用基因工程的方法引入用基因工程的方法引入特特殊结合位点殊结合位点（如金属结合位（如金属结合位点），将其加在重组目的蛋白点），将其加在重组目的蛋白的的氨基端或羧基端氨基端或羧基端 。n 紧邻结合位点的位置加入紧邻结合位点的位
26、置加入蛋白酶切割位点蛋白酶切割位点，以便在用，以便在用亲和层析纯化之后，将多余的亲和层析纯化之后，将多余的蛋白质片段去掉蛋白质片段去掉 。海南大学农学院wss492023-6-27金属螯合层析金属螯合层析n 基于蛋白质的基于蛋白质的组氨酸咪唑基组氨酸咪唑基和和半胱氨酸巯基半胱氨酸巯基能能与与铜铜、锌锌、镍离子镍离子间形成稳定的间形成稳定的螯合物螯合物而进行分离而进行分离的。的。海南大学农学院wss502023-6-277.7.含有辅酶的酶类的亲和层析含有辅酶的酶类的亲和层析 n 很多的酶中都含有不同类型的辅酶，最为常很多的酶中都含有不同类型的辅酶，最为常见的是氧化还原酶和脱氢酶含有见的是氧化还
27、原酶和脱氢酶含有NADNAD。为此用固定。为此用固定化的化的NADNAD可以分离不同类型的氧还酶和脱氢酶，或可以分离不同类型的氧还酶和脱氢酶，或激酶。激酶。固定化固定化NAD柱柱 海南大学农学院wss512023-6-278.8.染料配体的层析染料配体的层析 n染料树脂染料树脂n 不专一的亲和介质不专一的亲和介质n优点优点:n 稳定、和许多类型的酶结合，但又不被酶稳定、和许多类型的酶结合，但又不被酶所作用、价格低廉。所作用、价格低廉。n n eg.Cibacroneg.Cibacron蓝蓝F3GAF3GA。海南大学农学院wss522023-6-27u碱性磷酸单酯酶的分离碱性磷酸单酯酶的分离 小
28、牛小肠粘膜抽提液用DEAE离子交换纤维素除去部分杂蛋白酶活性的级分再上平衡的活性染料艳蓝K-GRS和交联琼脂糖4B偶联的染料层析柱平衡液洗除杂蛋白含有0.1mol/L磷酸盐的缓冲液可洗脱碱性磷酸单酯酶再吸附在活性染料Procion红HE-33与交联葡聚糖凝胶G-100偶联的基质柱上用含有0.1mol/L磷酸盐的缓冲液对缓冲液梯度洗脱，酶活性出现在5m mol/L磷酸盐浓度时回收率回收率6262回收率回收率9696 海南大学农学院wss532023-6-27原理：原理：利用酶的活性中心具有利用酶的活性中心具有结合配体的功能，可直接结合配体的功能，可直接检验酶的活力；失活的酶检验酶的活力；失活的酶
29、虽然在其它方法中仍然可虽然在其它方法中仍然可检测到蛋白质的存在，但检测到蛋白质的存在，但对于其活性不能判断，图对于其活性不能判断，图A A，无活性则不能与亲和，无活性则不能与亲和吸附剂结合时，从亲和柱吸附剂结合时，从亲和柱中穿流而出；活性部分因中穿流而出；活性部分因结合，通过洗脱得到分离，结合，通过洗脱得到分离，图图B B。A280具有结合能力具有结合能力及催化活性及催化活性亲和层析亲和层析A280穿流峰穿流峰洗脱峰洗脱峰图图A图图B B二、研究酶的结构与功二、研究酶的结构与功能能海南大学农学院wss542023-6-27思考题思考题n在亲和层析时，为什么床休积比较小？为在亲和层析时，为什么床
30、休积比较小？为什么无亲和力的物质只能产生一个层析峰？什么无亲和力的物质只能产生一个层析峰？n简述亲和层析的分辨率比一般吸附层析高简述亲和层析的分辨率比一般吸附层析高的原因。的原因。n配体应具备哪些条件？配体应具备哪些条件？海南大学农学院wss552023-6-274.4.在操作及应用方面，亲和层析与吸附层析、在操作及应用方面，亲和层析与吸附层析、离子交换层析、凝胶层析有哪些异同点？离子交换层析、凝胶层析有哪些异同点？5.5.在含在含A A、B B、C C、D D四种蛋白质组分的混合液四种蛋白质组分的混合液中，中，A A和和B B均为含有葡萄糖链的糖蛋白，其均为含有葡萄糖链的糖蛋白，其pIpI分别为分别为5.05.0和和5.55.5，而，而C C和和D D分子量分别是分子量分别是4000040000和和5000050000，试设计用层析法分离它们，试设计用层析法分离它们的方案。的方案。
