1、生物体内药物分析方法及应用生物体内药物分析方法及应用1.1.简介简介2.2.体内药物分析方法设计与建立体内药物分析方法设计与建立3.3.方法学确认（评价、确证、考评）方法学确认（评价、确证、考评）11.1 1.1 生物样品分析是药代研究的必备手段：生物样品分析是药代研究的必备手段：分析化学是化学科学中的分析化学是化学科学中的“眼睛眼睛”“眼睛眼睛”是心灵的是心灵的“窗户窗户”透过透过“窗户窗户”获得大量的信息获得大量的信息定量分析定量分析定性分析（半定量）定性分析（半定量）1.1.简简 介介源于化学学科中的分析化学专业源于化学学科中的分析化学专业具有分析化学的基本概念和要求具有分析化学的基本概
2、念和要求不同于一般的药物分析不同于一般的药物分析同时具有生物学科的特点同时具有生物学科的特点2DistributionMetabolismAbsorptionExcretion生物样品中药物的分析测定是生物样品中药物的分析测定是定量描述药物体内过程定量描述药物体内过程、获得药代参数的重要手段之一。获得药代参数的重要手段之一。31.2 1.2 方法学类型及特点：方法学类型及特点：体内药物分析方法大致可归为主要的五类：体内药物分析方法大致可归为主要的五类：1.光谱分析法光谱分析法 2.色谱法色谱法 3.毛细管电泳法毛细管电泳法 4.免疫分析法免疫分析法 5.同位素法同位素法 （）传统分类方法传统分
3、类方法:集各种方法之长集各种方法之长,为我所用为我所用:HPLC-UV HPLC MRD4 体内药物分析方法特点：体内药物分析方法特点：灵敏度高：灵敏度高：受到给药剂量的限制受到给药剂量的限制 受到生物利用度的限制受到生物利用度的限制 浓度低浓度低:专一性好：专一性好：生物内源性物质的干扰生物内源性物质的干扰 体内新形成的代谢产物干扰体内新形成的代谢产物干扰 样品量少：样品量少：血液（血浆、血清、全血）血液（血浆、血清、全血）尿、胆汁、唾液、汗、乳汁、精液尿、胆汁、唾液、汗、乳汁、精液 粪便、组织器官粪便、组织器官5 方法快捷方法快捷：不是专门的方法学研究，不是专门的方法学研究，利用方法较快的
4、阐明药理学的问题。利用方法较快的阐明药理学的问题。可靠、重现性好：可靠、重现性好：药代实验的不可重复性。药代实验的不可重复性。药物类型多：药物类型多：需要多种仪器、技术手段的配套需要多种仪器、技术手段的配套61.2.1 光谱分析法光谱分析法 比色法比色法 紫外分光光度法紫外分光光度法:差示、导数、双波长、三波长差示、导数、双波长、三波长 荧光分光光度法荧光分光光度法1.2.2 色谱法色谱法:分离效率高分离效率高;专一性较高专一性较高 HPLC:适用范围广适用范围广;室温检测室温检测;样品预处理简单样品预处理简单;流动相选择范围广流动相选择范围广;仪器自动化程度高仪器自动化程度高 GC:化合物气
5、化；载气种类少；化合物气化；载气种类少；方法灵敏，但受到进样量的限制方法灵敏，但受到进样量的限制 TLC:检测条件受限制检测条件受限制 7 1.2.3 毛细管电泳法毛细管电泳法:分离效率高分离效率高;专一性较高专一性较高 毛细管区带电泳毛细管区带电泳 胶束电动毛细管色谱胶束电动毛细管色谱 毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳 毛细管等电聚焦毛细管等电聚焦 毛细管等速电泳毛细管等速电泳 毛细管电色谱法毛细管电色谱法进样量少，检测条件受限制。进样量少，检测条件受限制。8 1.2.5 同位素法同位素法:灵敏度高灵敏度高;专一性差专一性差 放射强度表示标记药物量放射强度表示标记药物量(eq.ng/ml)同位素
6、技术与其他分析法相结合以提高专一性同位素技术与其他分析法相结合以提高专一性 1.2.4 免疫分析法免疫分析法:放射免疫分析放射免疫分析 酶免疫分析酶免疫分析 荧光免疫分析荧光免疫分析9（二）、生物样本的药物测定方法（二）、生物样本的药物测定方法生物样品中生物样品中的药物的药物测定，免疫学和微生物学方法。应根据待测定，免疫学和微生物学方法。应根据待测药物的性质，选择特异性好、灵敏度高的测定方法。色谱测药物的性质，选择特异性好、灵敏度高的测定方法。色谱法包括高效液相色谱法（法包括高效液相色谱法（HPLC），气相色谱法（），气相色谱法（GC）和色）和色谱谱-质谱联用法。在需要同时测定生物样品中多种化
7、合物的情质谱联用法。在需要同时测定生物样品中多种化合物的情况下，况下，LC-MS/MS和和GC-MS/MS联用法在特异性、灵敏度和联用法在特异性、灵敏度和分析速度方面有更多的优势。分析速度方面有更多的优势。应用放射性核素标记法测定血应用放射性核素标记法测定血药浓度应配合色法，以保证良好的检测特异性。如某些药物药浓度应配合色法，以保证良好的检测特异性。如某些药物难于用上述的检测方法，可选用免疫学或生物学方法，但要难于用上述的检测方法，可选用免疫学或生物学方法，但要保证其可靠性。保证其可靠性。放射免疫法和酶标免疫法具有一定特异性，放射免疫法和酶标免疫法具有一定特异性，灵敏度高，但原药与其代谢产物或
8、内源性物质常有交叉反应灵敏度高，但原药与其代谢产物或内源性物质常有交叉反应，需提供证据，说明其特异性。生物学方法（如微生物法），需提供证据，说明其特异性。生物学方法（如微生物法）常能反映药效学本质，但一般特异性较差，应尽可能用特异常能反映药效学本质，但一般特异性较差，应尽可能用特异性高的方法（如色谱法）进行平行检查。性高的方法（如色谱法）进行平行检查。摘自摘自:临床前药代动力学研究技术指导原则（第二稿）（草案）临床前药代动力学研究技术指导原则（第二稿）（草案）102.2.体内药物分析方法设计与建立体内药物分析方法设计与建立2.1 体内药物分析方法设计的主要依据体内药物分析方法设计的主要依据2.
9、1.1 明确分析方法设计的目的要求明确分析方法设计的目的要求 a.临床药物监护临床药物监护:简便、快速、批量测定简便、快速、批量测定 b.b.药代动力学研究药代动力学研究:是否要求原形药物与代谢物同时测定是否要求原形药物与代谢物同时测定 注意整个浓度变化的范围注意整个浓度变化的范围 样品量多样品量多,方法尽可能简便方法尽可能简便11 c.配合新药设计合成配合新药设计合成、药理药理、毒理毒理学的研究学的研究:药物是否吸收药物是否吸收?生物利用度如何生物利用度如何?T1/2?Tmax?Cmax?化合物药代的快速评价化合物药代的快速评价 要求方法学简单，快捷的提供实验数据。要求方法学简单，快捷的提供
10、实验数据。d.新药报批新药报批:参照参照SFDASFDA颁布的指导原则颁布的指导原则,按照按照SOPSOP进行试验进行试验.较快的获得信息较快的获得信息122.1.2 了解待测药物的特性了解待测药物的特性,调研文献调研文献 药物的结构、理化性质药物的结构、理化性质 检测方法检测方法?溶解度溶解度?稳定性稳定性?药物的药理和毒理作用机制药物的药理和毒理作用机制 生物样品生物样品:动物属性动物属性?组织器官组织器官?(同一类化合物的同一类化合物的)体内代谢情况体内代谢情况 药物的剂量药物的剂量 给药途径给药途径 干扰成分的多少干扰成分的多少 样品的预处理方法样品的预处理方法 132.1.3 仪器设
11、备与实验室条件仪器设备与实验室条件 文献资料的可参考性文献资料的可参考性?可重复性可重复性?别人可做的事情是否适合我们别人可做的事情是否适合我们?实验室硬件建设是否与研究课题相互匹配实验室硬件建设是否与研究课题相互匹配?药物就是药物！它不是一般的化合物。药物就是药物！它不是一般的化合物。应掌握和理解它的药效和毒性作用机制、理化性质、应掌握和理解它的药效和毒性作用机制、理化性质、将来的临床应用等等。将来的临床应用等等。只有对其加深理解才能进行深入的代谢研究，包括药只有对其加深理解才能进行深入的代谢研究，包括药物代谢研究所采用的方法技术。物代谢研究所采用的方法技术。142.2 体内药物分析方法设计
12、与建立的一般步骤体内药物分析方法设计与建立的一般步骤 总的原则：总的原则：根据被测药物的性质根据被测药物的性质药物浓度的大致范围药物浓度的大致范围(经验估计经验估计)仪器设备条件仪器设备条件对药物和研究目的的理解程度对药物和研究目的的理解程度灵敏灵敏 专一专一 简捷简捷 可行可行 初步分析方法的预试初步分析方法的预试优化优化确认确认15以以药物药物进行测定进行测定空白生物介质空白生物介质 +药物药物空白生物介质空白生物介质(杂质杂质)给药后给药后的生物样品的生物样品(有无有无药物药物?产物产物?)?)考虑考虑内标内标的选择的选择方法学的可行性验证评价方法学的可行性验证评价163.3.方法学确认
13、（评价、确证、考评）方法学确认（评价、确证、考评）（validation）“生物样品测定的关键是方法学的确证。方法学确证是整个药生物样品测定的关键是方法学的确证。方法学确证是整个药代动力学研究的基础。这是药代动力学研究有别于其它药理毒代动力学研究的基础。这是药代动力学研究有别于其它药理毒理研究的特殊之处。所有药代动力学研究结果，都依赖于生物理研究的特殊之处。所有药代动力学研究结果，都依赖于生物样品的测定，只有可靠的方法才能得出可靠的结果。在通过特样品的测定，只有可靠的方法才能得出可靠的结果。在通过特异性、灵敏度、精密度、准确度、稳定性等研究建立了检测方异性、灵敏度、精密度、准确度、稳定性等研究
14、建立了检测方法学，得到了标准曲线后，在检测过程中还应进行方法学质控，法学，得到了标准曲线后，在检测过程中还应进行方法学质控，制备随行标准曲线并对质控样品进行测定，以确保检测方法的制备随行标准曲线并对质控样品进行测定，以确保检测方法的可靠性。可靠性。”摘自摘自:临床前药代动力学研究技术指导原则（第二稿）（草案）临床前药代动力学研究技术指导原则（第二稿）（草案）17生物介质：生物介质：一种生物来源物质，能够以可重复的方式采集和处理。一种生物来源物质，能够以可重复的方式采集和处理。例如全血、血浆、血清、尿、粪、例如全血、血浆、血清、尿、粪、各种组织等。各种组织等。准确度：准确度：在确定的分析条件下，
15、测得值与真实值的接近程度。在确定的分析条件下，测得值与真实值的接近程度。分析批：分析批：包括待测样品、适当数目的标准样品和包括待测样品、适当数目的标准样品和QCQC样品的完整样品的完整系列。一天内可以完成几个分析批，一个分析批也可系列。一天内可以完成几个分析批，一个分析批也可以持续几天完成。以持续几天完成。3.1 名词解释名词解释:18重现性：重现性：不同实验室间测定结果的分散程度，以及相同条件下分析不同实验室间测定结果的分散程度，以及相同条件下分析方法在间隔一段短时间后测定结果的分散程度。方法在间隔一段短时间后测定结果的分散程度。介质效应：介质效应：由于样品中存在干扰物质，对响应造成的直接或
16、间接的影由于样品中存在干扰物质，对响应造成的直接或间接的影响。响。稳定性：稳定性：一种分析物在确定条件下，一定时间内在给定介质中的化一种分析物在确定条件下，一定时间内在给定介质中的化学稳定性。学稳定性。精密度：精密度：在确定的分析条件下，相同介质中相同浓度样品的一在确定的分析条件下，相同介质中相同浓度样品的一系列测量值的分散程度。系列测量值的分散程度。19标准曲线：标准曲线：实验响应值与分析物浓度间的关系。应采用适当的加权实验响应值与分析物浓度间的关系。应采用适当的加权和统计检验，用简单的数学模型来最适当地描述。标准和统计检验，用简单的数学模型来最适当地描述。标准曲线应是连续的和可重现的，应以
17、回归计算结果的百分曲线应是连续的和可重现的，应以回归计算结果的百分偏差最小为基础。偏差最小为基础。质控样品：质控样品：即即QC样品，系指在生物介质中加入已知量分析物配制的样品，系指在生物介质中加入已知量分析物配制的样品，用于监测生物分析方法的重复性和评价每一分析样品，用于监测生物分析方法的重复性和评价每一分析批中未知样品分析结果的完整性和正确性。批中未知样品分析结果的完整性和正确性。标准样品：标准样品：在生物介质中加入已知量分析物配制的样品，用于建立在生物介质中加入已知量分析物配制的样品，用于建立标准曲线，计算质控样品和未知样品中分析物浓度。标准曲线，计算质控样品和未知样品中分析物浓度。20
18、定量范围：定量范围：包括定量上限包括定量上限（ULOQ）和定量下限和定量下限（LLOQ）的浓度范的浓度范 围，在此范围内采用浓度围，在此范围内采用浓度-响应关系能进行可靠的、可重响应关系能进行可靠的、可重 复的定量，其准确度和精密度可以接受。复的定量，其准确度和精密度可以接受。选择性：选择性：分析方法测量和区分共存组分中分析物的能力。这些共分析方法测量和区分共存组分中分析物的能力。这些共存组分可能包括代谢物、杂质、分解产物、介质组分等存组分可能包括代谢物、杂质、分解产物、介质组分等回收率：回收率：分析过程的提取效率，以样品提取和处理过程前后分析分析过程的提取效率，以样品提取和处理过程前后分析物
19、含量百分比表示。物含量百分比表示。21nominal concentration:真实浓度真实浓度 (浓度真值浓度真值;算术值算术值)如如:配置溶液配置溶液(1.3mg/ml);标曲或标曲或QC中的中的0.xng/mlfortified Samples:processed samples stock solution standard samples authentic samples:与试验物质完全相同的样品与试验物质完全相同的样品 (或根据试验样品复制的标准品或根据试验样品复制的标准品)223.2 体内药物分析方法的评价内容：体内药物分析方法的评价内容：1.Selectivity:SFDA
20、/FDA2.Linear Range and Response Factor：S/F3.Inter-Day Precision and Accuracy:S/F4.Intra-Day Precision and Accuracy:S/F5.Dilution Integrity:F6.Sensitivity:S/F7.Recovery (Extraction Efficiency)S/F8.Matrix Effects:F9.Carryover Evaluation F10.Stability:S/F11.Relative Retention:F233.2.1 Selectivity:被测组分与
21、内源性物质被测组分与内源性物质、试剂中杂质试剂中杂质、代谢产物代谢产物以及其它干扰物质有良好的分离以及其它干扰物质有良好的分离;必须证明所测定的物质是预期的分析物，内源性必须证明所测定的物质是预期的分析物，内源性物质和其他代谢物不得干扰样品的测定。对于色物质和其他代谢物不得干扰样品的测定。对于色谱法至少要考察谱法至少要考察6 6个不同来源空白生物样品色谱图、个不同来源空白生物样品色谱图、空白生物样品外加对照物质色谱图（注明浓度）空白生物样品外加对照物质色谱图（注明浓度）及用药后的生物样品色谱图。对于质谱法则应着及用药后的生物样品色谱图。对于质谱法则应着重考察分析过程中的介质效应重考察分析过程中
22、的介质效应。241.被试验药物标准样品的色谱图被试验药物标准样品的色谱图2.正常生物样品正常生物样品（空白）的色谱图（空白）的色谱图3.空白生物样品空白生物样品外加被试药物的色谱图外加被试药物的色谱图4.给药后的生物样品的色谱图给药后的生物样品的色谱图试验报告试验报告(论文论文)中应提供中应提供:253.2.2 Linear Range and Response Factor：必须用至少必须用至少6 6个浓度建立标准曲线个浓度建立标准曲线(n=/5););应使用与待测样品相同的生物介质应使用与待测样品相同的生物介质;定量范围要能覆盖全部待测浓度定量范围要能覆盖全部待测浓度;不允许将定量范围外推
23、求算未知样品的浓度。不允许将定量范围外推求算未知样品的浓度。建立标准曲线时应随行空白生物样品，但计算建立标准曲线时应随行空白生物样品，但计算时不包括该点。时不包括该点。26 1.标准曲线标准曲线2.标准曲线线性范围标准曲线线性范围3.标准曲线的相关系数标准曲线的相关系数试验报告试验报告(论文论文)中应提供中应提供:5.空白生物样品外加被试药物空白生物样品外加被试药物(低低,中中,高三个高三个浓度浓度;n5)经标准曲线的反算经标准曲线的反算(back-calculated)测定浓度测定浓度4.标准曲线线性范围最低和最高浓度样品的标准曲线线性范围最低和最高浓度样品的色谱图色谱图27TabX.Sta
24、ndard Curve Readback Concentrations for XX 药物药物 -20%0.80 -15%1.70 4.25 17.0 85.0 425 850 +20%1.20 +15%2.30 5.75 23.0 115 575 1150 Nominal Concentrations(ng/ml)1.00 2.0 5.00 20.0 100 500 1000 1.07 1.98 4.67 18.3 97.4 483 1002 0.921 2.10 5.17 20.1 106 511 1063 1.04 2.10 4.69 20.4 102 486 991 1.05 2.21
25、 5.20 (a)102 491 1038 0.946 2.21 5.20 19.9 102 495 1073 平均值平均值:A B C E F G H SD I J K L M N O RSD%P Q R S T U V%RE W X Y Z A B C n n1 n2 n3 n4 n5 n6 n7Acceptance Criteria283.2.3 Inter-Day Precision and Accuracy:3.2.4 Intra-Day Precision and Accuracy:Precision of the method,defined by the percent rel
26、ative standard deviation(%RSD=（standard deviation）（mean）100)，was determined from the interpolated QC sample concentrations.Accuracy of the method,defined by the percent relative error (%RE=（standard observed concentrationnominal concentration）（nominal concentration）100)Precision and Accuracy29Precis
27、ion:10ng/ml10ng/mlAccuracy30 要求选择要求选择3个浓度的质控样品同时进行方法的精密度和准个浓度的质控样品同时进行方法的精密度和准确度考察。确度考察。低浓度低浓度选择在定量下限（选择在定量下限（LLOQ）附近，其浓度在）附近，其浓度在LLOQ的的3倍以内；倍以内；高浓度高浓度接近于标准曲线的上限；接近于标准曲线的上限；中间中间选一个浓度。每一浓度每批至少测定选一个浓度。每一浓度每批至少测定5个样品，为获个样品，为获得批间精密度应至少连续测定得批间精密度应至少连续测定3个分析批。个分析批。精密度精密度用质控样品的批内和批间相对标准差（用质控样品的批内和批间相对标准差（R
28、SD）表）表示，示，RSD一般应小于一般应小于15%，在，在LLOQ附近附近RSD应小于应小于20%。准确度准确度一般应在一般应在85%115%范围内，在范围内，在LLOQ附近应在附近应在80%120%范围内。范围内。31空白生物样品外加被试药物空白生物样品外加被试药物(低低,中中,高三个浓度高三个浓度;n5)的日内、日间精密度和准确度的日内、日间精密度和准确度Inter-Day 和和 Intra-Day Precision and Accuracy:国内一般做法：国内一般做法：1.00 n=5 10.0+血浆血浆 n=5 50.0 n=5同同一一天天日内日内1次次/日；日；连测连测5天天日间
29、日间5个平行样品合为个平行样品合为一体；分一体；分5次进样次进样32浓度浓度 样品管样品管 测定结果测定结果 1.0 1 2 3 4 5 10 1 2 3 4 5 100 1 2 3 4 5 合为一起合为一起日内分日内分5次测定次测定合为一起合为一起日内分日内分5次测定次测定合为一起合为一起日内分日内分5次测定次测定若每日测定若每日测定1 1次次,连续测定连续测定5 5次，得日间结果次，得日间结果数数据据处处理理33Nominal Concentrations(ng/ml)3.00 75.0 750 3.46 73.5 711 平均值平均值:A B C SD I J K RSD%P Q R%R
30、E W X Y n 6 6 6TabX.Quality Control Sample Concentration for XX 药物药物 3.23 75.6 733 平均值平均值:A B C SD I J K RSD%P Q R%RE W X Y n 6 6 61234Inter-Day Statistics 平均值平均值:A B C SD I J K RSD%P Q R%RE W X Y n 30 29 30 3.23 75.6 733 平均值平均值:A B C SD I J K RSD%P Q R%RE W X Y n 6 6 635353.2.5 Dilution Integrity:如
31、何测定超出线性范围的样品如何测定超出线性范围的样品?Range:10200ng/ml对大于对大于200ng/ml的样品要进行稀释的样品要进行稀释:500ng/ml 50ng/ml10X所处理和测定的结果是否符合要求所处理和测定的结果是否符合要求:50ng/ml的可信限之内的可信限之内(50 ng/ml)36 表表xx.xx.Dilution Integrity for xxDrug Acceptance Criteria -15%42500 +15%57500 Nominal Concentrations(ng/ml)Acceptance 50000 Ratio 47478 49950 477
32、94 6/6 51204 49265 53459 平均值平均值:49858 SD 2239%RSD 4.49%RE -0.284 n 6Acceptance Ratio:在在“Acceptance Criteria”允许范围内允许范围内 的的 样品数目除以分析的样品总数样品数目除以分析的样品总数37对小于对小于10ng/ml的样品如何处理的样品如何处理:10ng/ml 20ng/mlRange:10200ng/mlx2所处理和测定的结果是否符合要求所处理和测定的结果是否符合要求:10ng/ml的可信限之内的可信限之内(10 ng/ml)383.2.6 Sensitivity:定量下限是标准曲线
33、上的最低浓度点，要求至少能满足定量下限是标准曲线上的最低浓度点，要求至少能满足测定测定35个半衰期时样品中的药物浓度，或个半衰期时样品中的药物浓度，或Cmax的的1/101/20时的药物浓度，其准确度应在真实浓度的时的药物浓度，其准确度应在真实浓度的80%120%范围内，范围内，RSD应小于应小于20%。应由至少。应由至少5个标个标准样品测试结果证明。准样品测试结果证明。最低检测浓度最低检测浓度(X/ml)最低检测量最低检测量(X)最低定量下限最低定量下限(LLOQ)39 表表xx.xx.Sensitivity for xxDrug Nominal Concentrations(ng/ml)R
34、un (1.00)1 0.842 0.985 0.891 0.913 1.15 0.888 2 1.01 0.783 0.976 0.942 1.00 0.880平均值平均值:0.938 SD 0.0951%RSD 10.1%RE -6.02 n 12标准曲线试验表明：标准曲线试验表明：LLOQ为为1ng/ml；该浓度的精密度为该浓度的精密度为10.1%；该浓度的准确度为该浓度的准确度为-6.02 403.2.7 Recovery (Extraction Efficiency)提取回收率提取回收率:应考察高、中、低应考察高、中、低3 3个浓度的提取回收率，其个浓度的提取回收率，其结果应当一致、
35、精密和可重现。结果应当一致、精密和可重现。低低、中中、高高(3(3个浓度个浓度):):回收率不低于回收率不低于70%(原规定原规定)回收率不低于回收率不低于50%(改为改为)41萃取回收率萃取回收率:Mean MeanConc.Peak Area Peak Area Peak Area Percent Percent SD(ng/ml)Fortified Fortified Processed Recovery Recovery Samples Samples SamplesL.A1 A B1 B1/A C D A2 B2 B2/A A3 B3 B3/A A4 B4 B4/A B5 B5/A
36、M.E1 E F1 F1/E G H E2 F2 F2/E E3 F3 F3/E E4 F4 F4/E F5 F5/E H.I1 I J1 J1/I K L I2 J2 J2/I I3 J3 J3/I I4 J4 J4/I J5 J5/I 42方法回收率方法回收率:低低 中中 高高(3 3个浓度个浓度)的加入量与检出量的比较的加入量与检出量的比较.L.M.H.Conc.测定量测定量 加入量加入量 回收率回收率 回收率回收率(ng/ml)(ng/ml)(ng/ml)(%)(平均平均)123456789101112131415L.M.H.212223242526272829303132333435
37、ABC433.2.8 Matrix Effects:在采用质谱方法进行体内药物定量检测时在采用质谱方法进行体内药物定量检测时,应进行基质应进行基质效应试验效应试验,观察基质对药物测定的影响观察基质对药物测定的影响.基质（基质（matrix）尚无统一的解释，曾称为尚无统一的解释，曾称为“一种分一种分析物（析物（analyte）的环境（）的环境（milieu）”，即指标本中除分析，即指标本中除分析物以外的一切组成。物以外的一切组成。以血清胆固醇（以血清胆固醇（Chol）测定而言，就是指）测定而言，就是指Chol以外以外血清中的一切成分及其物理、化学性质。血清中的一切成分及其物理、化学性质。基质效应
38、（基质效应（matrix effect）对临床化学分析的影响越）对临床化学分析的影响越来越受到人们的重视。最早是在酶动力测定中用人工制备来越受到人们的重视。最早是在酶动力测定中用人工制备的参考物质时发现的的参考物质时发现的。44基质效应（基质效应（matrix effect）按按NCCLS文件的定义，指文件的定义，指:（1）标本中除分析物以外的其他成分对分析物测定值）标本中除分析物以外的其他成分对分析物测定值 的影响。的影响。（2）基质对分析方法准确测定分析物的能力的干扰。）基质对分析方法准确测定分析物的能力的干扰。广义说来，基质效应也应包括已知的干扰物（如广义说来，基质效应也应包括已知的干扰
39、物（如Chol测测 定中胆红素、血红蛋白、抗坏血酸等都是干扰物），但定中胆红素、血红蛋白、抗坏血酸等都是干扰物），但 目前只将基质效应限于生物材料中未知或未定性的物质目前只将基质效应限于生物材料中未知或未定性的物质 或因素（如粘度、或因素（如粘度、pH等）的影响。等）的影响。45减少基质效应的研究方向，至今仍有参考价值：减少基质效应的研究方向，至今仍有参考价值：改进室内质控样品；改进室内质控样品；改进仪器设计及试剂组成；改进仪器设计及试剂组成；选择方法及方法学参数，使其适应性更强且易于掌握，选择方法及方法学参数，使其适应性更强且易于掌握，对制备物（如标准液，室间质控样品与质控物）基质的确对制备
40、物（如标准液，室间质控样品与质控物）基质的确切性不敏感。切性不敏感。46Matrix Factor(MF;基质因子基质因子):peak area(fortified samples)peak area(analytical samples)fortified samples:生物介质生物介质 样品处理样品处理 加入待测药物加入待测药物 测定测定analytical samples:标准样品标准样品 测定测定 (两种测定方式的药物浓度相等两种测定方式的药物浓度相等)47IS adjusted Matrix Factor(内标校正的基质因子内标校正的基质因子):基质因子基质因子是是采用色谱峰面积采
41、用色谱峰面积峰面积峰面积计算计算.内标校正的基质因子内标校正的基质因子是是采用色谱峰面积的采用色谱峰面积的比值比值计算计算.ratios of peak area(Drug/IS)(fortified samples)ratio of peak area(Drug/IS)(analytical samples)(两种测定方式的药物浓度相等两种测定方式的药物浓度相等)基质因子为基质因子为1,表明药物的测定无基质效应影响表明药物的测定无基质效应影响.基质效应影响范围基质效应影响范围(基质因子基质因子;内标校正的基质因子内标校正的基质因子)在某一在某一个区间可被接受个区间可被接受.(0.8-1.2)
42、48Drug 峰面积峰面积 IS 峰面积峰面积 PAR MF IS校正后校正后MF Mean Mean （A）（B）（A/B）（A/C）（A/B）/D MF IS校正后校正后MF 11404 39416 0.289 0.968 1.06 1.02 0.988 10658 51296 0.258 0.905 0.945 10557 39457 0.268 0.896 0.982 0.923 1.03 Mean 0.967 0.997SD 0.053 0.017%RSD 5.47 1.72N 6 6Tabxx.Matrix Effects for xx drugDrug 峰面积峰面积 IS 峰面积
43、峰面积 PAR Drug 峰面积均峰面积均 值值 Mean PAR （A）（B）（A/B）（C）(D)(D)10831 40240 0.269 11778 0.273 analytical samples fortified samples run1run2run3run4run5run6493.2.9 Carryover Evaluation在方法评价中，线性的最高浓度（如在方法评价中，线性的最高浓度（如1000ng/ml1000ng/ml）被测试之）被测试之后，必须测试试剂空白样品来评价后，必须测试试剂空白样品来评价Carryover。在样品出峰的时间（在样品出峰的时间（RTRT）,试剂空
44、白样品可能会出现一个相试剂空白样品可能会出现一个相应的信号，应的信号，这个信号是这个信号是LLOQ的百分之几（的百分之几（LLOQ%）?LLOQ:1.0 ng/ml;Acceptance:0.8-1.2 ng/ml,(1.0 ng/ml 的的 20%);在进样高浓度样品时，在分析系统中会产生在进样高浓度样品时，在分析系统中会产生“携带污染携带污染”；“污染污染”到什么程度时，分析方法可以接受；什么程度时，到什么程度时，分析方法可以接受；什么程度时，分析方法不可以接受；分析方法不可以接受；50Carryover可允许接受的范围可允许接受的范围“20%of LLOQ”如果：如果：方法学的方法学的
45、LLOQ=1ng/ml (1ng/ml X)20%那么：那么：X 0.2ng/ml 51假定：在假定：在validation试验中，观察到试验中，观察到1000ng/ml（线性范围的（线性范围的 最高浓度）样品引起最高浓度）样品引起 50%of Carryover (残留量残留量)，指的是指的是LLOQLLOQ的的50%;50%;(1ng/ml(1ng/ml的的50%=0.5ng/ml)50%=0.5ng/ml)1000ng/ml1000ng/ml的残留率：的残留率：(0.5ng/mlng/ml1000ng/ml=0.05%1000ng/ml=0.05%）“cut-off”浓度浓度(残留量在残
46、留量在20%20%的的LLOQLLOQ以下的药物浓度以下的药物浓度)：1000ng/ml 0.5ng/ml=X 0.2ng/ml X=400ng/ml（1000ng/ml的残留量为的残留量为0.5ng/ml,多大浓度的残留量为多大浓度的残留量为20%的的LLOQ？解解“一元一次方程一元一次方程”所得到的浓度就是分析方法所分析的最大浓度。所得到的浓度就是分析方法所分析的最大浓度。）521000ng/ml的样品所引起的残留为的样品所引起的残留为 0.5ng/ml；残留率为；残留率为0.05%。若要求所引起的残留为若要求所引起的残留为LLOQ（1ng/ml）的）的20%(0.2ng/ml)，那那么该
47、样品的浓度应么该样品的浓度应400ng/ml。若某一个样品的浓度若某一个样品的浓度 400ng/ml，那么所操作的下一个样品就要，那么所操作的下一个样品就要求重新进行验证。求重新进行验证。533.2.10 Stability:(1)(1)生物样品在处理前生物样品在处理前,室温放置室温放置的稳定性的稳定性(Benchtop Stability).(2)(2)生物样品在处理前生物样品在处理前,44放置放置的稳定性的稳定性低低(n=5)中中(n=5)高高(n=5)放置一定时间放置一定时间 处理处理 测定测定稳定性试验应从实验过程的实际情况出发稳定性试验应从实验过程的实际情况出发,如观察时间如观察时间
48、,存放温度等存放温度等.54 表表xx.xx.XXXX介质中介质中XXXX药物在药物在XXXX条件下的稳定性试验条件下的稳定性试验 Acceptance Criteria -15%0.99 12.8 85.0 +15%1.02 17.3 115 Nominal Concentrations(ng/ml)Acceptance 1.00 15.0 100 Ratio 0.99 13.0 87.8 8/9 1.01 16.7 98.0 1.05 17.1 114.8 平均值平均值:A B C SD E F G RSD%H I J n 3 3 3Acceptance Ratio:在在“Acceptan
49、ce Criteria”允许范围内允许范围内 的的 样品数目除以分析的样品总数样品数目除以分析的样品总数55(3)Freeze/Thaw Stability:观察生物样品经反复多次冻观察生物样品经反复多次冻-融后的稳定性融后的稳定性;低、中、高三个浓度低、中、高三个浓度;(;(或低、高二个浓度或低、高二个浓度););标明冻存条件的温度标明冻存条件的温度(如如:-20:-20或或-70-70等等););标明融化后样品所处的温度标明融化后样品所处的温度(如如:20:20或或2525或室温等或室温等););Freeze/Thaw的周期数的周期数.56 表表xx.xx.XX介质中介质中XX药物经药物经
50、4次冻次冻(-20)融融(25)后的稳定性试验后的稳定性试验 Acceptance Criteria -15%0.99 12.8 85.0 +15%1.02 17.3 115 Nominal Concentrations(ng/ml)Acceptance 1.00 15.0 100 Ratio 0.99 13.0 87.8 12/12 1.01 16.7 98.0 1.00 17.1 114.8 0.99 1.70 103.3 平均值平均值:A B C SD E F G RSD%H I J n 4 4 4 Acceptance Ratio:在在“Acceptance Criteria”允许范围
