1、1第四节第四节 基因药物基因药物一、基因治疗的概念1、基因治疗的定义:(P632页)基因治疗是将人的正常基因或有治疗作用基因治疗是将人的正常基因或有治疗作用的基因导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或发的基因导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。而用于基因治疗的核酸等称为基因学新技术。而用于基因治疗的核酸等称为基因药物（药物（gene medicinesgene medicines）2 在未形成概念前，在未形成概念前，2020世纪世纪7070年代就开始年代就开始临床实验，由于实验未取得成果，而且没有临床实验，由于实
2、验未取得成果，而且没有得到得到NIHNIH的批准，广受抨击。的批准，广受抨击。8080年代，在动物身上进行了大量试验，为年代，在动物身上进行了大量试验，为其临床应用奠定了基础。其临床应用奠定了基础。19901990年年9 9月，临床实验正式开始。患者是月，临床实验正式开始。患者是一名患严重联合免疫缺陷症的年轻姑娘，她一名患严重联合免疫缺陷症的年轻姑娘，她从父母处各继承了一个缺陷的从父母处各继承了一个缺陷的adaada基因，造成基因，造成体内缺乏腺苷酸脱氨酶。体内缺乏腺苷酸脱氨酶。我国复旦大学的薛京伦研究小组，做了世我国复旦大学的薛京伦研究小组，做了世界上首例血友病界上首例血友病 基因治疗。基因
3、治疗。34 成功地对先天性重症免疫缺陷症进行基因治疗的法国基因治疗组组长艾伦费希尔博士（左）和成员玛丽娜卡巴甘那卡勃博士（右）。5 2002年10月,一名法国男孩在接受试验性基因治疗后罹患白血病，而基因治疗很可能是白血病发病的原因。Fisher说，他非常希望这种基因治疗方法从总体而言利大于弊。除基因治疗之外，治疗SCID的另一种治疗方法是近亲的骨髓移植。除非骨髓移植非常匹配，否则手术的失败率是25%。他强调说，这一失败率比现在接受基因治疗的11例患者的并发症发生率高2倍以上。6从基因角度：对缺陷的基因进行原位修复用正常有功能的基因置换有缺陷的基因增补缺陷基因（不需要去除异常基因，而是另外转入与
4、缺陷基因同源的有功能的基因来弥补缺陷的基因）7v从治疗角度导入基因以改变患者细胞的基因表达导入基因：v缺陷基因相对应的有功能的同源基因v缺陷基因无关的治疗基因8910基因治疗的两种形式体细胞基因治疗种系基因治疗v只限于某一体细胞的基因的改变v只限于某个体的当代v对缺陷的生殖细胞进行矫正v当代及子代112、基因治疗的方式v基因矫正或置换v基因增补v基因封闭v其他123、导入的方式v体外导入（ex vivo）体外将基因导入细胞内再将这种基因修饰过的细胞回输病人体内使这种带外源基因的细胞在体内表达达到治疗或预防的目的1314v体内导入（in vivo）外源基因直接导入体内有关的组织细胞使其进入相应的
5、细胞并表达15基因治疗的基本程序基因治疗的基本程序治疗性基因的选择治疗性基因的选择基因载体的选择基因载体的选择病毒载体病毒载体非病毒载体非病毒载体靶细胞的选择靶细胞的选择体细胞体细胞生殖细胞生殖细胞基因转移基因转移间接体内疗法间接体内疗法直接体内疗法直接体内疗法外源基因表达的筛选外源基因表达的筛选 利用载体中的标记基因利用载体中的标记基因回输体回输体内内16目前临床试验的治疗基因：合适的能达到治疗/预防的目的基因的cDNA v目的基因的cDNA的获得vcDNA文库中目的基因的克隆v人工合成基因片段vPCR法筛选扩增目的基因 二、治疗的基因的选择17三、载体系统-运送基因的工具v病毒载体v非病毒
6、载体v逆转录病毒载体逆转录病毒载体v腺病毒腺病毒v腺相关病毒腺相关病毒v单纯胞疹病毒单纯胞疹病毒v哺乳动物人工染色体哺乳动物人工染色体v脂质体脂质体v裸裸DNAv基因缝合线法基因缝合线法 18逆转录病毒载体1920逆转录病毒载体的构建目的基因标记基因 逆转录病毒基因组的一般结构重组逆转录病毒载体21假病毒颗粒的产生病毒复制需要的gag，pol，env基因已经预先整合进包装细胞的基因组222324腺病毒腺病毒DNA DNA 载体的特点载体的特点 基因重排低基因重排低 外源基因于病毒外源基因于病毒DNADNA重组后能稳定重组后能稳定复制几个周期复制几个周期 安全性能好安全性能好 不整合人的染色体不
7、整合人的染色体DNADNA，不会导致，不会导致恶性肿瘤恶性肿瘤 宿主范围广宿主范围广 对受体细胞是否处于分裂期要求不对受体细胞是否处于分裂期要求不严格严格 使用效果好使用效果好 外源基因在载体上容易高效表达外源基因在载体上容易高效表达 253 3、腺相关病毒（、腺相关病毒（adeno associated virusadeno associated virus，AAVAAV）属于细小病毒科，其成熟病毒颗粒属于细小病毒科，其成熟病毒颗粒中有的含正链中有的含正链DNADNA，有的含负链，有的含负链DNADNA。不能独立繁殖，其繁殖依赖于辅助病毒不能独立繁殖，其繁殖依赖于辅助病毒（腺病毒或疱疹病毒）
8、。基因组仅（腺病毒或疱疹病毒）。基因组仅5kb5kb，有两个有两个ORFORF，55和和33端各有一个由端各有一个由145145个氨基酸组成的反向重复序列个氨基酸组成的反向重复序列（ITRITR），对病毒的复制、整合、包装），对病毒的复制、整合、包装等有重要调控作用。等有重要调控作用。26优点：优点：1)1)、反向末端重复序列中没有转录调控元件，、反向末端重复序列中没有转录调控元件，减少激活原癌基因的可能性减少激活原癌基因的可能性2 2）、宿主广，只能形成慢性感染）、宿主广，只能形成慢性感染3 3）、可发生位点特异性整合，有利于表达）、可发生位点特异性整合，有利于表达4 4）、热稳定性好，而作
9、为辅助病毒的腺病）、热稳定性好，而作为辅助病毒的腺病毒在毒在6060即被灭活即被灭活5 5）、安全性较好，本身不致病）、安全性较好，本身不致病274 4、单纯疱疹病毒（、单纯疱疹病毒（herpes simple virusherpes simple virus，HSVHSV）双链双链DNADNA病毒，基因组大小病毒，基因组大小152kb152kb，可缺失多，可缺失多个基因仍保持复制能力。个基因仍保持复制能力。特点：特点：1 1）、序列清楚）、序列清楚 2 2）、可容纳至少）、可容纳至少30kb30kb外源基因外源基因3 3）、宿主广，可侵染脊椎动物各种细胞）、宿主广，可侵染脊椎动物各种细胞4
10、4）、重组病毒培养过程中易得到较高滴度）、重组病毒培养过程中易得到较高滴度5 5）、从外周进入神经系统，不影响神经元功能）、从外周进入神经系统，不影响神经元功能 但表达产物对多种类型宿主有毒性，且可引但表达产物对多种类型宿主有毒性，且可引起严重免疫反应，要进入临床仍需改进起严重免疫反应，要进入临床仍需改进285、痘病毒载体 痘苗病毒为线形双链的有包膜病毒,其核心颗粒不依赖宿主细胞而独立引进转录和复制,宿主范围广泛，易于培养；痘苗病毒基因组中大量非必需基因的缺乏并不影响其在宿主细胞的复制能力,可允许在同一或不同非必需区插入多个基因 痘苗病毒缺点是载体对细胞的毒性,同时病毒能被人体的补体系统灭活并
11、降解29表表 常用病毒载体得特征和适用范围常用病毒载体得特征和适用范围病毒载体病毒载体生物学特性生物学特性适用范围适用范围反转录病毒载体反转录病毒载体可感染分裂细胞；可感染分裂细胞；整合到染色体中整合到染色体中表达时间长表达时间长有致癌的危险有致癌的危险Ex vivo基因治疗基因治疗肿瘤基因治疗肿瘤基因治疗 腺病毒载体腺病毒载体可感染分裂和非分裂细胞可感染分裂和非分裂细胞不整合到染色体中不整合到染色体中外源基因表达水平高外源基因表达水平高表达时间较短表达时间较短免疫原性强免疫原性强In vivo基因治疗基因治疗肿瘤基因治疗肿瘤基因治疗疫苗疫苗 AAV病毒载体病毒载体可感染分裂和非分裂细胞可感染
12、分裂和非分裂细胞整合到染色体中整合到染色体中无致病性；免疫原性弱；无致病性；免疫原性弱；可长期表达外源基因可长期表达外源基因在骨骼肌、心肌、肝脏、视网膜在骨骼肌、心肌、肝脏、视网膜等组织中表达水平较高等组织中表达水平较高In vivo 基因治疗基因治疗Ex vivo基因治疗基因治疗遗传疾病的治疗遗传疾病的治疗获得性慢性疾病的基因治获得性慢性疾病的基因治疗疗 HSV病毒载体病毒载体具嗜神经性，可逆轴突传递具嗜神经性，可逆轴突传递可潜伏感染，容量大可潜伏感染，容量大可感染分裂和非分裂细胞可感染分裂和非分裂细胞神经系统疾病的基因治疗神经系统疾病的基因治疗肿瘤的基因治疗肿瘤的基因治疗3031四、靶细胞
13、四、靶细胞1 1、造血细胞、造血细胞 常用反转录病毒，体外基因转移，弥散的组常用反转录病毒，体外基因转移，弥散的组织多，分散广。对转入外源基因的细胞可检织多，分散广。对转入外源基因的细胞可检验，考虑安全性及有效性。验，考虑安全性及有效性。2 2、肌肉细胞、肌肉细胞 常用。肌肉细胞分布广，含量丰富，为常用。肌肉细胞分布广，含量丰富，为“永永久性久性”细胞，基因不会因分裂而丢失；细胞细胞，基因不会因分裂而丢失；细胞长而大，且为多核细胞，基因易转移和表达。长而大，且为多核细胞，基因易转移和表达。为为“非生命非生命”器官，安全；溶酶体少，外源器官，安全；溶酶体少，外源DNADNA不易被降解，基因存活时
14、间长；血流丰不易被降解，基因存活时间长；血流丰富，产物可释放入血富，产物可释放入血323 3、皮肤、皮肤 表皮涂抹或肤内注射裸露表皮涂抹或肤内注射裸露DNADNA活脂质体包裹活脂质体包裹DNADNA。安全、简便，易行，但皮肤不断更替。安全、简便，易行，但皮肤不断更替。4 4、其他、其他 如肝细胞、静脉注射等。如肝细胞、静脉注射等。33五、转移方法五、转移方法1 1、化学法、化学法DNADNA介导：用磷酸钙微量沉淀外源介导：用磷酸钙微量沉淀外源DNADNA，然，然后与靶细胞混合。后与靶细胞混合。染色体介导：用秋水仙素处理使染色体固缩，染色体介导：用秋水仙素处理使染色体固缩，破碎，差速离心，分离出
15、染色体，与受体细破碎，差速离心，分离出染色体，与受体细胞混合。胞混合。脂质体介导：临床已用脂质体介导：临床已用受体介导：外源受体介导：外源DNADNA与某些细胞特异性受体的与某些细胞特异性受体的多肽配基形成复合物，与受体结合进入细胞多肽配基形成复合物，与受体结合进入细胞342 2、物理法、物理法直接注射法，显微注射法，电穿透法等直接注射法，显微注射法，电穿透法等3 3、病毒介导、病毒介导目前最常用和最成熟的方法目前最常用和最成熟的方法35六、基因治疗的临床试验当前基因治疗试验：v治疗性试验v基因标记v非治疗性试验36治疗性试验v1、遗传性疾病、遗传性疾病v2、恶性肿瘤、恶性肿瘤v（1）抑癌基因
16、或细胞因子基因治疗）抑癌基因或细胞因子基因治疗v（2）自杀基因系统）自杀基因系统v（3）抑制血管生成）抑制血管生成v（4）反义药物反义药物v（5）导入）导入MHCI类抗原基因类抗原基因v（6）导入）导入MDR1(Multidrug Resistance)基因基因v3、病毒性感染、病毒性感染v4、其他、其他3738394041遗传疾病遗传疾病缺失的基因产物缺失的基因产物细胞类型细胞类型严重联合免疫缺陷腺苷酸脱氢酶T/B淋巴细胞慢性肉牙肿瘤细胞色素b中性粒细胞戈谢病糖脑苷酶巨噬细胞镰刀状细胞贫血珠蛋白红细胞和地中海贫血和珠蛋白红细胞Lesch-Nyhan症群次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基底神经节Duch
17、eme肌委缩萎缩素肌肉细胞帕金森病多巴胺脑黑质肺气肿1抗胰蛋白酶肺上皮细胞囊性纤维化CF跨膜传导调控剂肺/胰上皮细胞苯丙酮尿症苯丙氨酸羟化酶肝细胞家族性高胆固醇血症低密度脂蛋白受体肝细胞血友病A和B凝血因子和血小板、肝细胞42 遗传性单基因疾病遗传性单基因疾病v腺苷脱氨酶(ADA)缺乏的严重联合免疫缺陷(SCID)43腺苷脱氨酶(ADA)缺乏的严重联合免疫缺陷(SCID)第一个基因临床治疗的方案(1990.9.14,NIH)v病因:v淋巴细胞缺乏ADA酶 腺苷、dATP堆积 破坏免疫功能 患儿很少活到成年n治疗策略：n淋巴细胞ADA酶 恢复至正常水平的 5%-10%维持免疫系统功能 改善病人症
18、状4445治疗基本步骤:v ADA基因+逆转录病毒载体v 导入患者淋巴细胞v 体外扩增v 回输病人体内v淋巴细胞ADA酶恢复至正常水平的5%-10%v 维持免疫系统功能,改善病人症状4647恶性肿瘤的细胞因子基因治疗恶性肿瘤的细胞因子基因治疗基因工程“瘤苗”策略a：将刺激免疫反应的细胞因子基因(IL-2/IL-12/IFN-)转导肿瘤细胞，提高肿瘤细胞的免疫原性转导细胞因子基因的肿瘤细胞在体内持续分泌细胞因子增强抗肿瘤的免疫反应，形成局部的抗肿瘤免疫微环境引发全身的抗肿瘤免疫机能48策略b：引入抑瘤基因，如p53基因 今又生（Gendicine）是世界上第一个获得批准临床使用的抗肿瘤基因药，由
19、正常人肿瘤抑制基因p53 和改构的5型腺病毒基因重组而成。通常判断一个抗癌基因必须同时具备以下条件：1、在该肿瘤中该基因发生了变化，包括突变、缺失、甲基化等。2、将该基因的野生型导入肿瘤细胞能够部分或全部抑制其表型。3、该基因在该肿瘤相应的正常组织中存在正常表达。49P53结构示意图P53基因产物是一种核磷酸化蛋白，能够与8种以上细胞蛋白结合，生物学活性是引起细胞周期阻滞，诱导凋亡和细胞分化。大约50%的人类肿瘤中存在p53基因的变化50The H2 alpha helix,shown in gold and comprised of residues 278-286,is thought t
20、o be a key component of of the DNA binding domain with its numerous charged residues,helping to bind to the major groove of the DNA molecule.5152自杀基因自杀基因 将一基因转入细胞，它编码的蛋白可将无毒将一基因转入细胞，它编码的蛋白可将无毒的前药转变为有毒的物质的前药转变为有毒的物质 如胸苷激酶基因（如胸苷激酶基因（tktk），利用），利用tktk治疗脑瘤的治疗脑瘤的实验于实验于19921992年经年经FDAFDA批准应用于临床，批准应用于临床，1010名名接受治疗的患者，有接受治疗的患者，有6 6名至今仍活着。名至今仍活着。5354Endostatin Endostatin 是是型胶型胶 原原C-C-末端的末端的184184个氨基酸个氨基酸 片段片段,具有抑制血管生成具有抑制血管生成 的作用。的作用。重组鼠重组鼠 Endostatin Endostatin 可可 以完全抑制小鼠肿瘤细胞以完全抑制小鼠肿瘤细胞 的生长的生长,并且不产生耐药并且不产生耐药 性性,经过几轮给药后小鼠经过几轮给药后小鼠 的肿瘤被治愈。的肿瘤被治愈。Endostatin Endostatin 的结构与抑瘤效果的结构与抑瘤效果55个人观点供参考，欢迎讨论！
