1、Copyright 2022 liqionghua版权申明：本课件为著作人原创作品，未经著作人授权不得擅自抄袭转载摘编或用于商业用途第2章第2节动物细胞工程（动 物 细 胞 培 养）在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫排斥反应。那么，怎样才能获得大量的自体健康皮肤？能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？动物细胞培养 动物细胞融合 动物细胞核移植是动物细胞工程的基础一.动物细胞培养1 1概念：概念：从动物体中取出相关的组织，将它从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞分
2、散成单个细胞，然后在然后在适宜的培养条件适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖下，让这些细胞生长和增殖的技术。的技术。2 2原理：细胞的分裂（增殖）原理：细胞的分裂（增殖）3 3、目的：、目的：获得细胞或细胞产物；不能获得完整动物个体。获得细胞或细胞产物；不能获得完整动物个体。目录Contents1 动物细胞培养的条件2 动物细胞培养的过程3 干细胞培养及其应用细胞培养的条件动物细胞培养的条件营养物质营养物质其他条件其他条件糖类氨基酸无机盐维生素无菌、无毒的环境适宜的温度、pH和渗透压适宜的气体环境动物细胞培养的条件1 1营养：营养：由于人们对细胞所需的营养物质由于人们对细胞所需的营养物质还没
3、有完全搞清楚，因此，在使还没有完全搞清楚，因此，在使用合成培养基时，通常需加入血用合成培养基时，通常需加入血清等一些天然成分。清等一些天然成分。血清中不仅含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等多种血清中不仅含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等多种营养物质，还有激素及多种未知的促细胞生长因子及其营养物质，还有激素及多种未知的促细胞生长因子及其他活性物质，能促进细胞的生长、增殖。他活性物质，能促进细胞的生长、增殖。培养动物细胞一般使用液体培养基，也称为培养液动物细胞培养的条件2 2、无菌、无毒的环境、无菌、无毒的环境无菌：无菌：对培养液和所有培养用具进行灭菌处理对培养液和所有培养用具进行灭菌处理在无菌环
4、境下进行操作在无菌环境下进行操作定期更换培养液。定期更换培养液。目的：以便清除代谢物，防止细胞代谢目的：以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成伤害。物积累对细胞自身造成伤害。无毒：无毒：1动物细胞培养的条件n 适宜的温度、pH和渗透压哺乳动物多以（36.50.5）温度：pH：多数细胞生存的适宜pH在7.2-7.4渗透压：需要考虑的一个重要环境参数细胞培养的条件4 4、气体环境、气体环境用培养皿或松盖培养瓶，在用培养皿或松盖培养瓶，在95%95%空空气和气和5%CO5%CO2 2的混合气体的的混合气体的COCO2 2培养箱培养箱中进行培养。中进行培养。常用：CO2培养箱O2:细胞代谢所
5、必需的CO2：维持培养液的pH微生物培养中的作用不同（为自养型微生物提供碳源）CO2 培养箱取动物组织取动物组织用机械法或用用机械法或用胰蛋白酶胰蛋白酶、胶原蛋白酶胶原蛋白酶等等分散成单个细胞分散成单个细胞悬浮生长悬浮生长贴壁生长贴壁生长(大多数）细胞密度过大、细胞密度过大、有害代谢物积累、有害代谢物积累、营养物质缺乏等营养物质缺乏等接触抑制接触抑制传代培养传代培养细胞悬液细胞悬液解决解决原代培养原代培养分瓶分瓶培养培养加培养液加培养液在培养皿或培养瓶内在培养皿或培养瓶内悬浮培养的细胞悬浮培养的细胞:直接用离心法收集直接用离心法收集贴壁细胞贴壁细胞:需要重新用胰蛋白酶使之分散，后离需要重新用胰
6、蛋白酶使之分散，后离心法收集心法收集细胞细胞分裂分裂受阻受阻收集细胞收集细胞制成制成细胞悬液细胞悬液，分瓶培养，分瓶培养细胞与细胞靠在一起，彼此限制细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和增值。分散后，细胞与了生长和增值。分散后，细胞与培养液可充分接触，有利于营养培养液可充分接触，有利于营养物质的供应和代谢废物的及时排物质的供应和代谢废物的及时排出。出。其细胞生命力旺盛，其细胞生命力旺盛，分化程度低，分化程度低，分裂能力强。分裂能力强。2动物细胞培养的过程【思考1】用胰蛋白酶分散细胞，由此可说明细胞间的物质主要是什么成分？【思考2】胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？那将动物组织分散成单个细胞时要注意什么问
7、题呢？主要是蛋白质(胶原蛋白等)。能，应注意时间的控制。因为胰蛋白酶不仅能分解细胞间的蛋白质，长时间还会分解膜蛋白，对细胞造成损伤。【思考3】能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？不能，因为动物细胞培养适宜的PH为7.27.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。2 动物细胞培养的过程u 细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上。u 培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易于贴附。2动物细胞培养的过程 瓶壁上的细胞层数是一层（或单层）贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖。u 接触抑制分瓶培养解除方法肿瘤细胞失去接触抑制，条
8、件适宜肿瘤细胞失去接触抑制，条件适宜在培养液可以无限增殖下去。在培养液可以无限增殖下去。可形成多层细胞可形成多层细胞2动物细胞培养的过程将分瓶之前的细胞培养，即动物组织经处理后的初次培养称为原代培养。将分瓶后的细胞培养称为传代培养。u传代培养:u原代培养:在进行传代培养时，悬浮培养的细胞直接用离心法收集；贴壁细胞需要重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集。之后，将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养。【思考4】用胰蛋白酶两次处理的目的是？第一次处理的目的是使组织细胞分散开；第二次处理的目的是使细胞从瓶壁上脱离下来，便于分瓶后继续培养。u原代培养视频演示u传代培养视频演示1.幼
9、龄动物的细胞与老龄动物的细胞比较，分化程度低的细胞与分化程度高的细胞比较，哪些细胞更易于培养？为什么？细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物的细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物的细胞则相反。所以，一般来说，幼龄动物的细胞比老龄动物的细胞易于培养。同样，分化程度越低的细胞，增殖能力越强，所以更容易培养。思考讨论思考讨论2.动物细胞培养与植物组织培养有什么相同和不同之处？培养结果动物血清植物激素常用液体培养基常用固体培养基培养基性质细胞的全能性原 理动物细胞培养植物组织培养比较项目新的细胞群，不形成个体完整植株培养基特有成分细胞增殖1.1.干细胞的概念：干细胞的概念：动物和人体内动物和人体内
10、保留的具有分裂和分化能力的细胞保留的具有分裂和分化能力的细胞即为干细即为干细胞，在一定的条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞。胞，在一定的条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞。2.2.干细胞来源：干细胞来源：干细胞存在于早期细胞、骨髓和脐带血等多种组织和器官中。干细胞存在于早期细胞、骨髓和脐带血等多种组织和器官中。3.3.干细胞的类型：干细胞的类型：胚胎干细胞、成体干细胞。胚胎干细胞、成体干细胞。三.干细胞培养及应用1胚胎干细胞(简称ES细胞)(1)存在：早期胚胎中。(2)作用：具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。(3)成果：目前科学
11、家已经分离了兔、牛、猴和人等的ES细胞，并证明了ES细胞可以在体外分化成心肌细胞、神经元和造血干细胞等细胞。来自早期胚胎的干细胞2成体干细胞(1)存在：成体干细胞是成体组织或器官内的干细胞。(2)分类：包括造血干细胞、神经干细胞和精原干细胞等。(3)作用：成体干细胞具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。三.干细胞培养及应用注意：造血干细胞是发现最早、研究最多、应用也最为成熟的一类成体干细胞，主要存在于成体的骨髓、外周血和脐带血中。有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关，因而在医学上有着广泛的应用。例如，将正常的造血干细胞移
12、植到病人体内，恢复病人的造血和免疫功能，已成为治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病的一种重要手段；神经干细胞在治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）方面有重要的应用价值。3.干细胞的应用（1）含义：科学家通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，将它称为诱导多能干细胞（简称iPS 细胞），并用iPS 细胞治疗了小鼠的镰状细胞贫血。4.iPS细胞及应用从胚胎中获取胚胎干细胞，是否涉及伦理问题？（2）应用：用iPS 细胞治疗阿尔茨海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展。因为诱导过程无须破坏胚胎，而且iPS 细
13、胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应，所以科学家普遍认为iPS 细胞的应用前景优于胚胎干细胞。胚胎干细胞必须从胚胎干细胞必须从胚胎中获取，这涉胚胎中获取，这涉及伦理问题，因而及伦理问题，因而限制了它在医学上限制了它在医学上的应用。的应用。诱导多功能干细胞（诱导多功能干细胞（iPSiPS细胞）细胞）取取成纤维细胞成纤维细胞转入转入相关因子相关因子细胞细胞转化为转化为iPSiPS细胞细胞诱导诱导iPSiPS细胞定细胞定向分化为多种向分化为多种组织细胞组织细胞移植回病人体内移植回病人体内(1)(1)胚胎干细胞和成体干细胞都具有形成机体的所有组织和器官胚胎干细
14、胞和成体干细胞都具有形成机体的所有组织和器官,甚至个体甚至个体的潜能的潜能()()(2)(2)造血干细胞是发现最早、研究最多、应用最为成熟的一种成体干细胞造血干细胞是发现最早、研究最多、应用最为成熟的一种成体干细胞()()(3)iPS(3)iPS细胞称为诱导多能干细胞细胞称为诱导多能干细胞,与胚胎干细胞类似与胚胎干细胞类似,也需从胚胎中获取也需从胚胎中获取()()(4)(4)不同类型的干细胞分化能力不同不同类型的干细胞分化能力不同,胚胎干细胞的分化能力最强胚胎干细胞的分化能力最强()()(5)(5)干细胞将在再生医学、药物安全性、有效性检测、疾病治疗等领域发挥干细胞将在再生医学、药物安全性、有
15、效性检测、疾病治疗等领域发挥重要作用重要作用()()课堂检测课堂检测 有一个婴儿在出生后医院为他保留了脐带血有一个婴儿在出生后医院为他保留了脐带血,在他的生长发育过程中如在他的生长发育过程中如果出现了某种难治疗的疾病果出现了某种难治疗的疾病,就可以通过脐带血中的干细胞来为他治病就可以通过脐带血中的干细胞来为他治病,下列关于这个实例说法正确的是下列关于这个实例说法正确的是()A.A.用干细胞培育出人体需要的器官用来移植治病用干细胞培育出人体需要的器官用来移植治病,需要激发细胞的所有需要激发细胞的所有全能性全能性B.B.用脐带血中的干细胞能够治疗这个孩子所有的疾病用脐带血中的干细胞能够治疗这个孩子
16、所有的疾病C.C.如果要移植用他的干细胞如果要移植用他的干细胞,需要用到细胞培养技术需要用到细胞培养技术D.D.如果要移植用他的干细胞培育出的器官如果要移植用他的干细胞培育出的器官,应该长期给他使用免疫抑制应该长期给他使用免疫抑制药物药物C C 干细胞是一种尚未充分分化的未成熟的细胞，医学家们正在尝试利用干细胞治疗一些顽疾，下列说法不正确的是（）A.各种组织干细胞分化形成不同组织细胞是基因选择性表达的结果B.利用干细胞治疗某些顽疾，是因为干细胞具有再生各种组织、器官的潜能C.同一生物个体中，神经细胞与干细胞所含有的遗传物质不同D.干细胞包括成体干细胞和胚胎干细胞【答案】C【解析】细胞分化是基因
17、选择性表达的结果，A 项正确；干细胞具有发育的全能性，可以分化成成年动物的各种组织、器官，故可利用干细胞治疗某些顽疾，B 项正确；同一个体的神经细胞和干细胞均是由受精卵通过细胞分裂和细胞分化形成的，遗传物质相同，C 项错误；干细胞包括成体干细胞和胚胎干细胞，D 项正确。有研究表明“渐冻症”是由突变的基因导致运动神经元合成了某种毒蛋白，从而阻碍了轴突内营养物质的流动。也有最新研究结果表明，利用诱导多功能干细胞（iPS 细胞）制作前驱细胞，然后移植给渐冻症实验鼠，能延长其寿命。下列相关描述错误的是（）A.iPS 细胞分化成的多种细胞中所有核酸相同，蛋白质却不完全相同B.iPS 细胞分化的实质是基因
18、的选择性表达，细胞种类增多C.若控制运动神经元合成毒蛋白的基因替换，则可以起到良好的治疗作用D.植入神经干细胞，恢复受损的运动功能，也许会在一定程度上使“渐冻症”病情改善A【答案】A【解析】细胞分化的实质是基因的选择性表达，因此iPS细胞分化成的多种细胞中DNA 相同，RNA 和蛋白质不完全相同，A 项错误；细胞分化的结果是形成形态、结构和生理功能不同的细胞，使细胞的种类增多，B 项正确；若控制运动神经元合成毒蛋白的基因替换，则无法合成该毒蛋白，所以可以起到治疗该病的作用，C 项正确；植入神经干细胞，诱导分化成前驱细胞，恢复受损的运动功能，也许会在一定程度上使“渐冻症”病情改善，谢谢观看Thanks！
