1、第一章 发酵工程第第2 2节节发酵工程的无菌技术发酵工程的无菌技术生物（苏教版）高中生物 选择性必修31.掌握不同物品的灭菌方法掌握不同物品的灭菌方法。2.概述发酵工程的灭菌设备和无菌操作器具并掌握其概述发酵工程的灭菌设备和无菌操作器具并掌握其正正 确确使用方法使用方法。3.概述微生物接种的方法和传代的无菌技术。概述微生物接种的方法和传代的无菌技术。学习目标1.生命观念：理解防止杂菌污染对成功获得培养物及生命观念：理解防止杂菌污染对成功获得培养物及确确 保保操作者本身安全的重要性操作者本身安全的重要性。2.科学思维：利用无菌技术进行斜面接种和培养酵母菌。科学思维：利用无菌技术进行斜面接种和培养
2、酵母菌。素养要求一、无菌技术 泛指在培养微生物的操作中，所有泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染防止杂菌污染的方法。的方法。获得纯净的微生物培养物的关键获得纯净的微生物培养物的关键1.消毒 使用使用较为温和的物理、化学或生物等方法较为温和的物理、化学或生物等方法，杀死物体表面或，杀死物体表面或内部内部一部分微生物一部分微生物。常用消毒的方法：煮沸消毒法煮沸消毒法：100100 煮沸煮沸 5-6 min5-6 min。巴氏消毒法巴氏消毒法：62-6562-65下煮下煮30min 30min 或或 80-9080-90下煮下煮 30s-1min30s-1min。化学药剂消毒法化学药剂消毒法：
3、用：用70%70%酒精擦拭双手；氯气消毒水源等酒精擦拭双手；氯气消毒水源等。紫外线消毒法紫外线消毒法：用紫外灯照射接种室、接种箱、超净工作台用紫外灯照射接种室、接种箱、超净工作台生物消毒法生物消毒法：利用生物或其代谢物除去环境中部分微生物的：利用生物或其代谢物除去环境中部分微生物的方法。如常用抗生素青霉素、链霉素和新霉素等杀菌。方法。如常用抗生素青霉素、链霉素和新霉素等杀菌。紫外线：使微生物的紫外线：使微生物的核酸及蛋白质等的破核酸及蛋白质等的破坏作用而被灭活坏作用而被灭活2.灭菌 指使用指使用强烈的理化方法强烈的理化方法杀死物体内外杀死物体内外所有所有微生物微生物，包括，包括芽孢芽孢和孢子和
4、孢子。芽孢：有些有些细菌在一定的条件下，细胞里面形细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的成一个椭圆形的休眠体休眠体，叫做芽孢。，叫做芽孢。芽孢芽孢壁很壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3 3小小时以后才死亡。时以后才死亡。孢子：细菌细菌、原生动物、真菌和植物等产生的、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的一种有繁殖作用的无性生殖细胞无性生殖细胞。能直接发育。能直接发育成新个体。成新个体。常用灭菌的方法：（1）干热灭菌器具：电热鼓风干燥箱（干热灭菌箱）电热鼓风干燥
5、箱（干热灭菌箱）条件：140140160 160 下加热下加热 2 23h3h原理：使微生物细胞膜破坏、蛋白质使微生物细胞膜破坏、蛋白质 变性和原生变性和原生质干燥等质干燥等对象：耐高温，需保持干燥的物品耐高温，需保持干燥的物品，适用于玻璃器皿适用于玻璃器皿 (如试管、如试管、培养皿、移液管、注射器培养皿、移液管、注射器)、金属器具、金属器具 (如针头、如针头、镊子、镊子、剪刀等剪刀等)的灭菌。的灭菌。（2）灼烧灭菌器具：酒精灯酒精灯条件：酒精灯外焰灼烧酒精灯外焰灼烧效果：最彻底最彻底原理：使微生物燃烧使微生物燃烧对象：接种工具接种工具如接种环、接种针，如接种环、接种针，以及接种以及接种过程过
6、程中的中的试管口或瓶口试管口或瓶口等等易被污染部位易被污染部位（3）湿热灭菌（效果最好：高压蒸汽灭菌）器具：高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅条件：100kPa100kPa、121 121 下维持下维持15-20min15-20min原理：高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等 结构使其变性结构使其变性优点：操作简便，效果可靠，操作简便，效果可靠，可以杀灭所有可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体。的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体。基本保持基本保持培养基培养基的营养成分不被破坏。的营养成分不被破坏。对象：培养基、培养基、多种器材、物品多种器材、物品等等加水加水 装锅装
7、锅 加热排气加热排气 保温保压保温保压 出锅出锅不要装得过满使冷空气彻底排出然后将排气阀关闭103kPa；121；保持压力，维持1520min压力表中指针降至“0”点、温度降至60以下，打开排气阀，开盖，取出物品核心探讨1.培养基灭菌为什么采用高压蒸汽灭菌而不采用干热灭菌？培养基灭菌为什么采用高压蒸汽灭菌而不采用干热灭菌？突破重难强化素养提示干热灭菌箱内的高温会导致培养基的水分散失，而高压蒸汽锅内的湿度较大，不会导致培养基的水分散失。2.如何制备一瓶无菌水？如何制备一瓶无菌水？提示对一瓶有菌水进行高压蒸汽灭菌处理。3.某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没某同学在使用高压
8、蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是什么？有达到相应温度，最可能的原因是什么？提示未将锅内冷空气排尽。4.某同学从高压蒸汽灭菌锅内拿出培养基后发现，培养基已经溅满了锥某同学从高压蒸汽灭菌锅内拿出培养基后发现，培养基已经溅满了锥形瓶的瓶壁，最可能的原因是什么？形瓶的瓶壁，最可能的原因是什么？提示高压蒸汽灭菌锅的压力表指针还未降至“0”点，就提前打开了高压蒸汽灭菌锅。过滤除菌法 概念：通过通过滤膜过滤滤膜过滤阻阻留微生物从而达到除菌目的的方法。留微生物从而达到除菌目的的方法。器具：空气除菌设备空气除菌设备 对象：空气、料液，及在高温下不稳定的物质（空气、料液，
9、及在高温下不稳定的物质（大于滤膜孔径大于滤膜孔径 的细菌等微生物颗粒阻留）的细菌等微生物颗粒阻留）应用：a.a.在工业生产上在工业生产上制备无菌空气，制备无菌空气，用于好氧微生物的发酵；用于好氧微生物的发酵；b.b.在产品提取过程中，也可以利用过滤除菌法处理料液，以在产品提取过程中，也可以利用过滤除菌法处理料液，以获获得无菌产品得无菌产品。典型例题典型例题(2020漯河高中高二月考漯河高中高二月考)培养基、培养皿、接种环、培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌或消毒方法依实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌或消毒方法依次是次是()化学消毒化学消毒灼烧灭菌灼烧灭菌干
10、热灭菌干热灭菌紫外线消毒紫外线消毒高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌巴氏消毒法巴氏消毒法A.B.C.D.二、发酵工程的无菌操作器具1.接种器具接种：在无菌条件在无菌条件下将微生物接下将微生物接入培养基的入培养基的操作过程。操作过程。常用接种器具包括玻璃涂布器常用接种器具包括玻璃涂布器、接种针、接种针、接种环等。接种环等。应用：玻璃涂布器常用应用：玻璃涂布器常用于平板稀释涂布接种于平板稀释涂布接种，接种针，接种针用于穿刺用于穿刺接种接种，接种环，接种环用于斜面接种用于斜面接种或在平板培养基或在平板培养基上划线接种上划线接种。平板划线接种平板划线接种2.转移器具移液管的应用：一般用于转移移液管的应用：一般用
11、于转移部分液体部分液体 培养物、系列稀释微生物或分装化学培养物、系列稀释微生物或分装化学试剂。试剂。刻度移液管：刻度移液管：具有刻度的具有刻度的直形玻璃管，直形玻璃管，在需要控制在需要控制试剂加入量时试剂加入量时使用。使用。微量取液器 取液取液量很少时量很少时 (如如0.1mL)0.1mL)使用。使用。3.超净工作台概念：超净工作台是一种概念：超净工作台是一种经过空气净化经过空气净化而而 形成高洁净操作环境的设备。形成高洁净操作环境的设备。净化原理：是利用工作台净化原理：是利用工作台内紫外线灯的内紫外线灯的 杀菌作用，并杀菌作用，并通过空气过滤器过滤通过空气过滤器过滤 确保工作台内空气的无菌、
12、无污染。确保工作台内空气的无菌、无污染。(1)菌体蛋白质的变性温度与含水量相关，一般来说含水量越低，变性温菌体蛋白质的变性温度与含水量相关，一般来说含水量越低，变性温度越高度越高()(2)一般以能否杀死细菌的芽孢作为彻底灭菌的标准一般以能否杀死细菌的芽孢作为彻底灭菌的标准()(3)使用高压蒸汽灭菌锅时，为充分利用空间，装得使用高压蒸汽灭菌锅时，为充分利用空间，装得越满越好越满越好()(4)当高压蒸汽灭菌锅的压力表指针降至当高压蒸汽灭菌锅的压力表指针降至“0”点时，即可出锅点时，即可出锅()(5)制备氨基酸、抗生素等的发酵过程，所需的微生物对空气无菌的要求制备氨基酸、抗生素等的发酵过程，所需的微
13、生物对空气无菌的要求较低较低()(6)将移液管移入准备接受溶液的容器时，为避免污染，移液管不能接触将移液管移入准备接受溶液的容器时，为避免污染，移液管不能接触器壁器壁()判断正误三、微生物接种和传代的无菌技术1.1.菌种保存的重要条件菌种保存的重要条件：低温、干燥、真空（隔绝空气）。2.2.菌种保存的方法菌种保存的方法（1）临时保存（44左右冰箱保存，每隔左右冰箱保存，每隔2 23 3个月个月重新接种重新接种）穿刺接种：保存厌氧微生物保存厌氧微生物斜面接种：常用的菌种传代和低温下保存菌种的方法常用的菌种传代和低温下保存菌种的方法培养酵母菌核心归纳斜面接种和培养酵母菌的操作步骤及其目的或分析说明
14、斜面接种和培养酵母菌的操作步骤及其目的或分析说明顺序顺序接种操作步骤接种操作步骤目的或分析说明目的或分析说明将将接种环的环端接种环的环端和接种时可能和接种时可能进入试管的部分放在酒精灯火进入试管的部分放在酒精灯火焰上，焰上，来回灼烧多次来回灼烧多次将接种环灭菌，避免污染菌种将接种环灭菌，避免污染菌种迅速将迅速将试管口通过火焰试管口通过火焰23次次灼烧灭菌，灼烧灭菌，防止试管口上的微防止试管口上的微生物污染培养基生物污染培养基将灭过菌的接种环伸入菌种管，将灭过菌的接种环伸入菌种管，先将环部接触培养基斜面顶端先将环部接触培养基斜面顶端或其他无菌体的培养基部位或其他无菌体的培养基部位使使接种环冷却，
15、避免杀死菌种接种环冷却，避免杀死菌种抽出接种环时，带菌部位抽出接种环时，带菌部位不要不要触及管壁触及管壁或通过火焰或通过火焰防止菌种沾于管壁防止菌种沾于管壁；防止菌种；防止菌种被杀死被杀死在培养基斜面上在培养基斜面上由底部向上轻由底部向上轻轻划轻划“Z”型折线型折线，但，但不要将培不要将培养基的表面划破养基的表面划破初步接种。初步接种。划破培养基不利于划破培养基不利于后续的继续划线，长出的菌落后续的继续划线，长出的菌落不标准不标准将试管口与试管塞分别通过火焰将试管口与试管塞分别通过火焰23次，迅速塞紧试管次，迅速塞紧试管防止杂菌污染防止杂菌污染将接种过菌种的试管，放在将接种过菌种的试管，放在恒
16、温恒温箱箱(28)中培养中培养24 h培养酵母菌，观察接种和培培养酵母菌，观察接种和培养的结果养的结果（2）长期保存：甘油管藏（一般可保存（一般可保存2 24 4年）年）2020以下的甘油管在冷冻箱中保藏以下的甘油管在冷冻箱中保藏(1)低温、干燥、高氧是菌种保存的重要低温、干燥、高氧是菌种保存的重要条件条件()(2)厌氧微生物常采用穿刺接种的方法将其保护在培养基厌氧微生物常采用穿刺接种的方法将其保护在培养基中中()(3)将含有新鲜菌种的试管放在将含有新鲜菌种的试管放在4 的冰箱中保存有利于延长保存的冰箱中保存有利于延长保存时间时间()判断正误典题应用5.下列关于斜面接种和培养酵母菌的叙述，错误
17、的是下列关于斜面接种和培养酵母菌的叙述，错误的是A.接种环灭菌时，只需将其环端进行灭菌接种环灭菌时，只需将其环端进行灭菌B.接种时，应在培养基斜面上由底部向上轻轻划接种时，应在培养基斜面上由底部向上轻轻划“Z”型折线型折线C.挑取菌体时应先将接种环的环部接触培养基斜面顶端或其他无菌体挑取菌体时应先将接种环的环部接触培养基斜面顶端或其他无菌体的的 培养基培养基部位使其冷却部位使其冷却D.将菌种置于将菌种置于4 左右的冰箱中保藏即有利于减缓培养基的水分蒸发左右的冰箱中保藏即有利于减缓培养基的水分蒸发，又又有利于延长保存时间有利于延长保存时间及时反馈知识落实6.下列关于微生物接种和传代的无菌技术的叙述，错误的是下列关于微生物接种和传代的无菌技术的叙述，错误的是A.菌种的传代和保存要考虑菌种的生理、生化特性菌种的传代和保存要考虑菌种的生理、生化特性B.低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都有抑制微生物生长和低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都有抑制微生物生长和代谢代谢 的的作用作用C.破伤风芽孢杆菌可在培养基深处的厌氧环境下生长破伤风芽孢杆菌可在培养基深处的厌氧环境下生长D.在培养基斜面上接种时应由上部向底部轻轻划在培养基斜面上接种时应由上部向底部轻轻划“Z”型折线型折线
