1、专题专题1-2 目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定 目的基因的获取目的基因的获取 基因表达载体的构建基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞 ( (一）、目的基因概念：一）、目的基因概念： 主要指的是主要指的是编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因。 也可以是一些也可以是一些具有调控作用的因子具有调控作用的因子。 （二）、目的基因获取方法：（二）、目的基因获取方法： 从从基因文库基因文库中获取目的基因中获取目的基因 利用利用PCRPCR技术技术扩增目的基因扩增目的基因 化学方法直接化学方法直接人工合成人工合成 1、从、从基因文库基因文库中获取目的基因中获取目的基
2、因 基因文库基因文库 基因组文库基因组文库 部分基因文库部分基因文库 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNA片断片断,导入导入 到到受体菌的群体受体菌的群体中中,各个受体菌分别含有这种生各个受体菌分别含有这种生 物的不同基因物的不同基因,称为基因文库。称为基因文库。 限制酶限制酶 拼接到载体上拼接到载体上 导入受体细胞扩增导入受体细胞扩增 基因组文库基因组文库 cDNAcDNA文库的构建文库的构建- -反转录法：反转录法： 以目的基因转录成的以目的基因转录成的 信使信使RNARNA为模板，反为模板，反 转录成互补的单链转录成互补的单链 DNADNA，然后在酶的作，然后在
3、酶的作 用下合成双链用下合成双链DNADNA， 从而获得所需的基因。从而获得所需的基因。 目的基因的目的基因的mRNAmRNA 反转录酶反转录酶 单链单链DNADNA 双链双链DNA(DNA(目的基因目的基因) ) DNADNA聚合酶聚合酶 基因组文库和部分基因组文库基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库文库)比较比较 怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢? ? 依据依据-目的基因的有关信息。目的基因的有关信息。 如：根据基因的核苷酸序列如：根据基因的核苷酸序列 基因在染色体上的位置基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNAmRNA
4、 基因翻译产物蛋白质等特性。基因翻译产物蛋白质等特性。 2 2、利用、利用PCRPCR技术技术扩增目的基因扩增目的基因 PCRPCR的全称：的全称：聚合酶链式反应聚合酶链式反应 PCRPCR的原理：的原理： DNADNA复制复制 PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因的前提条件：的前提条件： 要有一段已知的目的基因的核苷酸序要有一段已知的目的基因的核苷酸序 列。列。 模板模板 原料原料 引物引物 酶酶 控制温度控制温度 目的基因目的基因DNADNA 四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸 如单链如单链DNADNA分子片段分子片段 耐热的耐热的DNADNA聚合酶聚合酶 PCRPCR的条件：的条件：
5、PCRPCR仪自动调控仪自动调控 PCRPCR反应的过程反应的过程 变性变性(90(90- -95)95) 复性复性(55(55- -60)60) 延伸延伸(70(70- -75)75) 3 3、用化学方法直接、用化学方法直接人工合成人工合成 基因基因较小较小，核苷酸序列，核苷酸序列已知已知。 条件：条件： 例2. 用限制酶EcoRV、Mbol单独或联合切割同一种质粒，得到的 DNA片段长度如下图(1 kb即1000个碱基对)，请在答题卡的 指定位置画出质粒上EcoRV、Mbol的切割位点。 1 1、基因表达载体的组成、基因表达载体的组成 目的基因目的基因 启动子启动子: 终止子终止子: 标记
6、基因等标记基因等 一段有特殊结构的一段有特殊结构的DNADNA片段片段。位于基因的。位于基因的 首端。首端。是是RNA聚合酶识别和结合的部位聚合酶识别和结合的部位， 有了它才能驱动基因转录有了它才能驱动基因转录mRNA，最终，最终 获得蛋白质。获得蛋白质。 一段有特殊结构的一段有特殊结构的DNADNA片段片段。位于基因的尾端。位于基因的尾端。使使 转录在所需要的地方停止。转录在所需要的地方停止。 是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因 的细胞筛选出来，如青霉素基因。的细胞筛选出来，如青霉素基因。 2 2、基因表达载体的构建目
7、的：、基因表达载体的构建目的： a.a.使目的基因在受体细胞中稳定存在，使目的基因在受体细胞中稳定存在， 并且可以遗传给下一代。并且可以遗传给下一代。 b.b.使目的基因能够表达和发挥作用。使目的基因能够表达和发挥作用。 3、注意：由于受体细胞有植物、动物、微生 物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法 不同，基因表达载体的构建也有差别，不是 千篇一律。 2 2、目的基因导入植物细胞、目的基因导入植物细胞 常用的方法常用的方法: : 农杆菌转化法农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、基因枪法、花粉管通道法 农杆菌的特点农杆菌的特点: : c.Tic.Ti质粒上的质粒上的T T- -DNADNA可
8、转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体可转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体 的的DNADNA上。上。 b.b.具有趋化性。具有趋化性。 a.a.易感染双子叶植物和祼子植物。易感染双子叶植物和祼子植物。 目的基因目的基因进入进入受体细胞内，并且在受体细胞内受体细胞内，并且在受体细胞内维持维持 稳定和表达稳定和表达的过程。的过程。 1 1、转化、转化 农杆菌转化法的导入过程农杆菌转化法的导入过程: : 构建基因表达载体构建基因表达载体 转入转入 农杆菌农杆菌 植物细胞植物细胞 导入导入 稳定维持和表达稳定维持和表达 农 杆 菌 转 化 法农 杆 菌 转 化 法 3 3、目的基因导入动物细胞、目
9、的基因导入动物细胞 常用的方法常用的方法: : 显微注射技术显微注射技术 操作程序：操作程序： a.a.先提纯含目的基因的表达载体先提纯含目的基因的表达载体 b.b.从雌性动物体内取出卵（受精卵）从雌性动物体内取出卵（受精卵） c.c.显微注射仪进行显微注射显微注射仪进行显微注射 d.d.将含目的基因的受精卵移植到输卵将含目的基因的受精卵移植到输卵 管或子宫中发育成新个体管或子宫中发育成新个体 4 4、目的基因导入微生物细胞、目的基因导入微生物细胞 原核生物的特点原核生物的特点: : 繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较 少。少。 大肠杆菌的转化过程大肠杆菌的转
10、化过程: : 用用CaCa2+ 2+处理细胞 处理细胞 感受态细胞感受态细胞重组表达重组表达 载体载体DNADNA分子与感受态细胞混合分子与感受态细胞混合感受态感受态 细胞吸收细胞吸收DNADNA分子。分子。 增加细胞壁的透性，增加细胞壁的透性， 与细胞膜无关与细胞膜无关 目的基因是否插入受体细胞染色体的目的基因是否插入受体细胞染色体的DNADNA上上 1 1、分子水平检测、分子水平检测 检测方法检测方法: : DNADNA分子杂交技术分子杂交技术 DNADNA探针：探针： 用放射性同位素等作标记的含有目的基因的 用放射性同位素等作标记的含有目的基因的DNADNA片段。片段。 目的基因是否转录
11、出目的基因是否转录出mRNAmRNA 检测方法检测方法: : 分子杂交技术分子杂交技术 用用DNADNA探针与探针与mRNAmRNA杂交。杂交。 目的基因是否翻译出蛋白质目的基因是否翻译出蛋白质 检测方法检测方法: : 抗原抗原抗体杂交抗体杂交 2 2、个体生物学水平的鉴定、个体生物学水平的鉴定 例例2、回答有关基因工程的问题因工程的问题： （1）构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割DNA后， 可能产生粘性末端，也可能产生_末端。若要在限制酶切割目 的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生 _（相同，不同）粘性末端的限制酶。 （2）利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载
12、体含有人胰岛 素基因及其启动子等，其中启动子的作用是 。在用表达载体转化大肠杆菌时， 常用 处理大肠杆菌，以利于表达载体进入：为了检测胰岛 素基因是否转录出了mRNA，可用标记的胰岛素基因片段作探针与 mRNA杂交，该杂交技术称为 。为了检测胰岛 素基因转录的mRNA是否翻译成 _，常用抗原- 抗体杂交技术。 如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞，先要将目的 基因插入农杆菌Ti质粒的 中，然后用该农杆菌感染植物 细胞，通过DNA重组将目的基因插入植物细胞的 上。 平平 相同相同 提供提供RNA聚合酶聚合酶 特异性识别结合位点，驱动基因转录特异性识别结合位点，驱动基因转录 Ca2+ D
13、NARNA分子杂交分子杂交 胰岛素原（蛋白质）胰岛素原（蛋白质） TDNA 染色体染色体 例例3、【生物生物现代生物科技专题现代生物科技专题】 人类疾病的转基因动物模型常用于致病机理的探讨及治疗药物的 筛选。利用正常大鼠制备遗传性高血压转基因模型大鼠的流程如 图所示。 （1）卵母细胞除从活体输卵管中采集外，还可以从处死的雌鼠 _中获取。 （2）图中的高血压相关基因作为_，质粒作为 _,二者需用_切割后连接成重组载体，该过程 与质粒上含有 _有关。 （3）子代大鼠如果_ _和_，即可说明高 血压相关基因已成功表达，然后可用其建立高血压转基因动物模 型。 （4）在上述转基因大鼠的培育过程中，所用到的主要胚胎工程技 术是_、早期胚胎培养和胚胎移植。 卵巢卵巢 目的基因目的基因 运载运载 体体 同种限制酶同种限制酶 限制酶切割位点限制酶切割位点 检测到体内有相关蛋白检测到体内有相关蛋白 出现高血压出现高血压 体外受精体外受精
