1、动物实验动物实验是指声称具有特定保健功能或者以补充维生素、矿物质是指声称具有特定保健功能或者以补充维生素、矿物质为目的的食品，即适宜于特定人群食用，具有调节机体为目的的食品，即适宜于特定人群食用，具有调节机体功能，不以治疗疾病为目的，并且对人体不产生任何急功能，不以治疗疾病为目的，并且对人体不产生任何急性、亚急性或者慢性危害的食品。性、亚急性或者慢性危害的食品。保健食品：保健食品：掌握保健食品毒理学评价和功能评价的要求掌握保健食品毒理学评价和功能评价的要求 掌握实验动物的概念及分类掌握实验动物的概念及分类 熟悉保健食品评价的法规与标准熟悉保健食品评价的法规与标准 熟悉熟悉保健食品功能评价的实验
2、项目保健食品功能评价的实验项目 了解保健食品注册相关程序及要求了解保健食品注册相关程序及要求一、概述一、概述二、保健食品毒理学评价二、保健食品毒理学评价三、保健食品功能学评价：动物实验三、保健食品功能学评价：动物实验内内 容容 提提 纲纲6客户提出检验要求客户提出检验要求提供相关材料提供相关材料出具受理通知出具受理通知书书卫生学、稳定性试验卫生学、稳定性试验毒理学检验毒理学检验功能学检验功能学检验特特定定功功效效成成分分感感官官指指标标理理化化指指标标微微生生物物指指标标急性急性毒性、毒性、遗传遗传毒性毒性亚慢亚慢性、性、慢性慢性毒性毒性动动物物实实验验人人体体试试验验检验报告检验报告客户接受
3、报告客户接受报告保保健健食食品品注注册册检检验验受受理理程程序序国务院国务院:中华人民共和国食品卫生法中华人民共和国食品卫生法(20152015)卫生部：保健食品管理办法（卫生部：保健食品管理办法（20132013）卫生部：新食品原料申报与受理规定和新食品原料安全卫生部：新食品原料申报与受理规定和新食品原料安全性审查规程性审查规程(20(201 13 3）卫生部：食品安全性毒理学评价程序和方法卫生部：食品安全性毒理学评价程序和方法 (GB15193.1-2014GB15193.1-2014）保健食品功能学评价程序与检验方法规范保健食品功能学评价程序与检验方法规范（20032003）SFDASF
4、DA：保健食品注册与备案管理办法（保健食品注册与备案管理办法（20201616）检验机构名称检验机构名称注册检验项目范围注册检验项目范围 国家食品安国家食品安全风险评估全风险评估中心中心 安全性毒理学试验、功能学动物试验（安全性毒理学试验、功能学动物试验（1、增强免疫力功能、增强免疫力功能 2、辅助降血脂功能、辅助降血脂功能3、辅、辅助降血糖功能助降血糖功能4、抗氧化功能、抗氧化功能5、辅助改善记忆功能、辅助改善记忆功能6、促进排铅功能、促进排铅功能7、清咽功能、清咽功能8、辅、辅助降血压功能助降血压功能9、改善睡眠功能、改善睡眠功能10、促进泌乳功能、促进泌乳功能11、缓解体力疲劳功能、缓解
5、体力疲劳功能12、提高缺氧、提高缺氧耐受力功能耐受力功能13、对辐射危害有辅助保护功能、对辐射危害有辅助保护功能14、减肥功能、减肥功能15、改善生长发育功能、改善生长发育功能16、增、增加骨密度功能加骨密度功能17、改善营养性贫血功能、改善营养性贫血功能18、对化学性肝损伤有辅助保护功能、对化学性肝损伤有辅助保护功能19、调节肠、调节肠道菌群功能道菌群功能20、促进消化功能、促进消化功能21、通便功能、通便功能22、对胃粘膜损伤有辅助保护功能）、功效、对胃粘膜损伤有辅助保护功能）、功效成分或标志性成分检测、卫生学试验、稳定性试验、复核检验成分或标志性成分检测、卫生学试验、稳定性试验、复核检验
6、中国检验检疫中国检验检疫科学研究院科学研究院综合检测中综合检测中心心 安全性毒理学试验、功能学动物试验（安全性毒理学试验、功能学动物试验（1、增强免疫力功能、增强免疫力功能 2、辅助降血脂功能、辅助降血脂功能3、缓、缓解体力疲劳功能解体力疲劳功能4、调节肠道菌群功能能、调节肠道菌群功能能5、通便功能）、功效成分或标志性成分检测、通便功能）、功效成分或标志性成分检测、卫生学试验、稳定性试验卫生学试验、稳定性试验8实验动物（实验动物（laboratory laboratory animals,LAanimals,LA）是指人工培）是指人工培育，来源清楚，遗传背景明育，来源清楚，遗传背景明确，对其携
7、带的微生物和寄确，对其携带的微生物和寄生虫实行监控，用于生命科生虫实行监控，用于生命科学研究、药品与生物制品生学研究、药品与生物制品生产和检定以及其他学科研究产和检定以及其他学科研究的动物。的动物。遗传学要求遗传学要求微生物和寄生虫监控要求微生物和寄生虫监控要求应用要求应用要求三大特点三大特点实验用动物实际上实验用动物实际上是指一切可以用于是指一切可以用于实验的动物，包括：实验的动物，包括：实验动物，野生动实验动物，野生动物，经济动物、观物，经济动物、观赏动物。赏动物。小鼠，大鼠小鼠，大鼠，豚，豚鼠，地鼠，家兔，鼠，地鼠，家兔，猫，犬，鸡，小猫，犬，鸡，小型猪，猕猴等型猪，猕猴等 。一般按遗传
8、背景分类：一般按遗传背景分类：分为四类：分为四类：近交系；近交系；突变系；突变系；封闭群；封闭群；系统杂交动物系统杂交动物概念：概念：同胞兄妹交配（繁殖）同胞兄妹交配（繁殖）2020代以上，近交系数达代以上，近交系数达98.6%98.6%以以上，群体基因达到高度上，群体基因达到高度纯合纯合和稳定的动物群，称之为近交系。和稳定的动物群，称之为近交系。近交系数：近交系数：群体中两个等位基因源于同祖先的同一基因的概率。群体中两个等位基因源于同祖先的同一基因的概率。一般近交一般近交8 81212代的近交群没有实用价值，只有连续代的近交群没有实用价值，只有连续2020代以后，群代以后，群体基因才能达到纯
9、合和基本稳定。体基因才能达到纯合和基本稳定。近交系动物的特点：近交系动物的特点：a a基因位的纯合性：基因位的纯合性：纯合率达纯合率达98.6%98.6%，因而能繁殖出完，因而能繁殖出完全一致的纯合子后代，品系内个体繁殖的后代不会出现全一致的纯合子后代，品系内个体繁殖的后代不会出现性状分离。性状分离。使用近交系动物实验时，不会因为隐性基因暴露而使用近交系动物实验时，不会因为隐性基因暴露而影响试验结果。影响试验结果。b.b.遗传的同源性遗传的同源性c.c.遗传的长期稳定性遗传的长期稳定性d.d.均一性均一性e.e.遗传组成的独特性遗传组成的独特性f.f.国际分布性国际分布性 目前常用的近交系实验
10、动物：目前常用的近交系实验动物：目前有：目前有：250个小鼠品系，个小鼠品系，111个大鼠品系，个大鼠品系，20个家兔，个家兔，14个豚鼠品系。个豚鼠品系。常用的小鼠、大鼠近交系：常用的小鼠、大鼠近交系：小鼠：小鼠：C57BL，C3H，BALB/C，DBA/2等。等。大鼠：大鼠：F344，LEW，BN，SHR，DA等。等。C57BLBALB/C概念：概念：又称远交原种，或非近交系。把又称远交原种，或非近交系。把5 5年以上不从外引种，只在群内随机年以上不从外引种，只在群内随机配对繁殖，而生产的动物，群内有效大小应保持在配对繁殖，而生产的动物，群内有效大小应保持在5050只以上。只以上。特点：特
11、点：a.a.杂合性杂合性，避免了近交衰退现象，生命力较强，易于生产，成本低。多用于预，避免了近交衰退现象，生命力较强，易于生产，成本低。多用于预试验，教学及一般实验中。试验，教学及一般实验中。b.b.具有具有异质遗传异质遗传，常用于人类遗传学研究，药物筛选，毒性试验等方面。，常用于人类遗传学研究，药物筛选，毒性试验等方面。c.c.遗传特性相对稳定，但试验结果的重复性，一致性低于近交系、系统杂交遗传特性相对稳定，但试验结果的重复性，一致性低于近交系、系统杂交动动物。物。常用的封闭群动物：常用的封闭群动物：小鼠：小鼠：KMKM，NIHNIH，ICRICR，LACALACA，大鼠：大鼠：Wistar
12、Wistar，SDSD，兔：兔：青紫兰兔，新西兰兔。青紫兰兔，新西兰兔。KMWistarSD新西兰兔概念：概念：正常染色体基因发生突变，具有了各种遗传缺陷，将需要的某种遗传正常染色体基因发生突变，具有了各种遗传缺陷，将需要的某种遗传缺陷动物，再进行定向培育成具有突变基因的近交系，称为突变系。或利用遗缺陷动物，再进行定向培育成具有突变基因的近交系，称为突变系。或利用遗传工程方法将突变基因导入已育成的近交系，这种具有突变基因的近交系也称传工程方法将突变基因导入已育成的近交系，这种具有突变基因的近交系也称突变系。突变系。突变系动物的特点和应用突变系动物的特点和应用突变系动物可以作为人类疾病的动物模型
13、。突变系动物可以作为人类疾病的动物模型。常用突变系动物：常用突变系动物：小鼠：小鼠：100100多种。如，肥胖症小鼠（多种。如，肥胖症小鼠（odod），糖尿病小鼠（），糖尿病小鼠（dbdb）,裸鼠（裸鼠（nunu）等。）等。大鼠，大鼠，2020多种。如，新西兰高血压大鼠（多种。如，新西兰高血压大鼠（GHRGHR），米兰高血压（），米兰高血压（MHSMHS），粮尿病大），粮尿病大鼠（鼠（didi），肥胖症大鼠（），肥胖症大鼠（fafa），白内障大鼠（），白内障大鼠（rcrc）等。）等。概念：概念：两个不同的近交系杂交所产生的两个不同的近交系杂交所产生的F1F1代动物。代动物。F1F1动物具有杂交
14、优势，生命力较强。动物具有杂交优势，生命力较强。特点及应用特点及应用系统杂交动物有许多优点，在某些方面比近交系更适用于实验研究。系统杂交动物有许多优点，在某些方面比近交系更适用于实验研究。a.a.杂交优势：杂交优势：抗病力、适应力强，对实验处理耐受性强，适合于长期慢性实验。抗病力、适应力强，对实验处理耐受性强，适合于长期慢性实验。b.b.遗传和表型上的一致性：遗传和表型上的一致性：F1F1有与近交系相似的个体均质性。加上上述优点，广有与近交系相似的个体均质性。加上上述优点，广泛适用于营养，药物，病原体和激素的生物评估。泛适用于营养，药物，病原体和激素的生物评估。c.c.具有杂合的遗传组成：具有
15、杂合的遗传组成：可同时接受两个亲本品系的细胞、组织，器官和肿瘤移可同时接受两个亲本品系的细胞、组织，器官和肿瘤移植。植。级别分类，一般是按实验动物的微生物背景划分的，这是实验动物级别分类，一般是按实验动物的微生物背景划分的，这是实验动物质量控制的一个重要方面。质量控制的一个重要方面。国际上一般分为四级国际上一般分为四级：无菌动物无菌动物（germfree animal,GFgermfree animal,GF）悉生动物悉生动物（gnotobiotic animal,GNgnotobiotic animal,GN）无特定病原体动物无特定病原体动物（specific pathogen free a
16、nimal,SPFspecific pathogen free animal,SPF）普通动物普通动物（conventional animal,CVconventional animal,CV）对微生物的控制要求对微生物的控制要求GFGF：以无菌技术获得，不带任何微生物和寄生虫，在隔离系统饲以无菌技术获得，不带任何微生物和寄生虫，在隔离系统饲养。养。GNGN：带有明确的微生物丛，无菌条件饲育，在隔离系统饲养。带有明确的微生物丛，无菌条件饲育，在隔离系统饲养。SPFSPF：不带指定的病原微生物和寄生虫，在屏障系统饲养。不带指定的病原微生物和寄生虫，在屏障系统饲养。CVCV：微生物、寄生虫携带性情
17、况不明，但不能带有人畜共患和烈微生物、寄生虫携带性情况不明，但不能带有人畜共患和烈性传染病原体，在开放系统饲养。性传染病原体，在开放系统饲养。生产条件、动物质量和动物实验条件的标准化。生产条件、动物质量和动物实验条件的标准化。动物实验条件实验动物生产条件相匹配相匹配影响因素影响因素遗传遗传微生物微生物/寄生虫寄生虫环境环境营养营养一、概述一、概述二、保健食品毒理学评价二、保健食品毒理学评价三、保健食品功能学评价：动物实验三、保健食品功能学评价：动物实验内内 容容 提提 纲纲 食品毒理学评价食品毒理学评价 食品功能学评价食品功能学评价 食品卫生学、稳定性评价食品卫生学、稳定性评价动物实验25常用
18、的实验动物常用的实验动物1.1.大鼠（大鼠（Rattus Rattus norvegcusnorvegcus ）(常用，重要常用，重要)哺乳纲啮齿目鼠科。食性广泛，寿命哺乳纲啮齿目鼠科。食性广泛，寿命-3-3年，性成熟期年，性成熟期2-32-3月，孕期月，孕期3030天，一年产仔天，一年产仔4-74-7胎，哺乳期胎，哺乳期3030天。天。饲养；安静、通风、饲养；安静、通风、18-2518-25、湿度、湿度30-50%30-50%。长方铁丝笼。长方铁丝笼、5 5只、雌雄分养。只、雌雄分养。饲养方法上午喂一次，饲养方法上午喂一次，30-35g30-35g。清洁水。清洁水。262.2.小鼠（小鼠（M
19、as musculus Mas musculus）(常用常用)哺乳纲啮齿目鼠科，寿命哺乳纲啮齿目鼠科，寿命2 2年，性成熟期雌：年，性成熟期雌：35-5535-55天，雄：天，雄：45-6045-60天，孕期天，孕期20-2520-25天，一年产仔天，一年产仔4-94-9胎，哺乳期胎，哺乳期3030天。天。饲养饲养:安静、通风、光线较暗、安静、通风、光线较暗、18-2518-25、湿度、湿度50-60%50-60%。长方铁皮。长方铁皮鼠盒、鼠盒、1010只、雌雄分养。生长速度快、耗粮少、易捉。只、雌雄分养。生长速度快、耗粮少、易捉。饲养方法：上午喂一次，饲养方法：上午喂一次，30-35g30-
20、35g。清洁水。清洁水 。27对保健食品的毒理学评价是确保人群食用安全的前提。对保健食品的毒理学评价是确保人群食用安全的前提。严格按照卫生部严格按照卫生部食品安全性毒理学评价程序和方法食品安全性毒理学评价程序和方法 GB15193GB15193进行，进行，主要评价食品生产、加工、保藏、运输和销售过程中使用的主要评价食品生产、加工、保藏、运输和销售过程中使用的化学和生物物化学和生物物质质以及上述过程中产生的和污染的以及上述过程中产生的和污染的有害物质、食物新资源及其成分和新资有害物质、食物新资源及其成分和新资源食品源食品。对于功能食品及功效成分必须进行对于功能食品及功效成分必须进行食品安全性毒理
21、学评价程序和方法食品安全性毒理学评价程序和方法中规定的中规定的第一、二阶段第一、二阶段的毒理学试验，依据评判结果决定是否进行的毒理学试验，依据评判结果决定是否进行三、四三、四阶段阶段的毒理学试验。的毒理学试验。若功能食品的原料选自若功能食品的原料选自普通食品原料普通食品原料或或已批准的药食两用原料已批准的药食两用原料则不再进行则不再进行试验。试验。28（1 1）试验的四个阶段）试验的四个阶段第一阶段：第一阶段：急性毒性试验，包括经口急性毒性（急性毒性试验，包括经口急性毒性（LD50LD50）和联合急性毒性）和联合急性毒性。第二阶段：第二阶段：遗传毒性试验、传统致畸试验、短期喂养试验。遗传毒性试
22、验、传统致畸试验、短期喂养试验。第三阶段：第三阶段：亚慢性毒性试验（亚慢性毒性试验（9090天喂养试验）、繁殖试验和代谢试验。天喂养试验）、繁殖试验和代谢试验。亚慢性毒性：亚慢性毒性：材料或其浸提液每天一次或多次给予后，在寿命期的材料或其浸提液每天一次或多次给予后，在寿命期的一段时间内一段时间内(不超过动物寿命期的不超过动物寿命期的10%10%，如大鼠一般不超过，如大鼠一般不超过9090天天)引起的引起的不良反应。不良反应。第四阶段：第四阶段：慢性毒性实验（包括致癌试验）慢性毒性实验（包括致癌试验）29（2 2）功能食品特别是功效成分的毒理学评价原则：）功能食品特别是功效成分的毒理学评价原则：
23、凡属凡属我国创新的物质我国创新的物质：四个阶段四个阶段的试验。的试验。凡属与已知物质（指经过安全性评价并允许使用者）的化学凡属与已知物质（指经过安全性评价并允许使用者）的化学结构基本相同的衍结构基本相同的衍生物或类似物生物或类似物：根据：根据第一、二、三第一、二、三阶段毒性试验结果判断是否需进行第阶段毒性试验结果判断是否需进行第四四阶段阶段的毒性试验。的毒性试验。凡属凡属已知已知的化学物质，世界卫生组织已公布每人每日容许摄入量（的化学物质，世界卫生组织已公布每人每日容许摄入量（ADIADI），同时），同时又有资料证明我国产品的质量规格与国外产品一致：可先进行第一、二阶段毒又有资料证明我国产品的
24、质量规格与国外产品一致：可先进行第一、二阶段毒性试验，若试验结果与国外产品的结果一致，一般不要求进行进一步的毒性试性试验，若试验结果与国外产品的结果一致，一般不要求进行进一步的毒性试验，否则应进行第三阶段毒性试验。验，否则应进行第三阶段毒性试验。30 食品食品新资源新资源及其食品：应进行及其食品：应进行第一、二、三第一、二、三个阶段毒性试验，以及必要的人个阶段毒性试验，以及必要的人群流行病学调查。必要时应进行第四阶段试验。若根据有关文献资料及成分群流行病学调查。必要时应进行第四阶段试验。若根据有关文献资料及成分分析，未发现有或虽有但量甚少，不至构成对健康有害的物质，以及较大数分析，未发现有或虽
25、有但量甚少，不至构成对健康有害的物质，以及较大数量人群有长期食用历史而未发现有害作用的天然动植物（包括作为调料的天量人群有长期食用历史而未发现有害作用的天然动植物（包括作为调料的天然动植物的粗提制品）可以先进行第一、二阶段毒性试验，经初步评价后，然动植物的粗提制品）可以先进行第一、二阶段毒性试验，经初步评价后，决定是否需要进行进一步的毒性试验。决定是否需要进行进一步的毒性试验。凡属毒理学凡属毒理学资料比较完整资料比较完整，世界卫生组织已公布日允许量或不需规定日允许，世界卫生组织已公布日允许量或不需规定日允许量者，要求进行量者，要求进行急性毒性试验和一项致突变试验急性毒性试验和一项致突变试验，首
26、选，首选AmesAmes试验或小鼠骨髓试验或小鼠骨髓微核试验。微核试验。31 凡属有一个国际组织或国家凡属有一个国际组织或国家批准使用批准使用，但世界卫生组织未公布日许量，或资料，但世界卫生组织未公布日许量，或资料不完整者，在进行不完整者，在进行第一、二第一、二阶段毒性试验后作初步评价，以决定是否需进行进阶段毒性试验后作初步评价，以决定是否需进行进一步的毒性试验。一步的毒性试验。天然植物提取的天然植物提取的单一组分，单一组分，高纯度高纯度的添加剂，凡属的添加剂，凡属新产品新产品需先进行需先进行第一、二、第一、二、三阶段三阶段毒性试验，凡毒性试验，凡属国外已批准使用属国外已批准使用的，则进行的，
27、则进行第一、二阶段第一、二阶段毒性试验。毒性试验。凡属尚无资料可查、国际组织凡属尚无资料可查、国际组织未允许使用未允许使用的，先进行的，先进行第一、二第一、二阶段毒性试验，阶段毒性试验，经初步评价后，决定是否需进行进一步试验。经初步评价后，决定是否需进行进一步试验。32（1）保健保健食品评价为什么要进行毒理学评价？评价项食品评价为什么要进行毒理学评价？评价项目包括哪些？目包括哪些？（2）实验实验动物的概念、级别及分类有哪些？动物的概念、级别及分类有哪些？（3）近交系近交系、突变系、封闭群、系统杂交动物的特点、突变系、封闭群、系统杂交动物的特点及各自的主要品系？及各自的主要品系？一、概述一、概述
28、二、保健食品毒理学评价二、保健食品毒理学评价三、保健食品功能学评价：动物实验三、保健食品功能学评价：动物实验内内 容容 提提 纲纲 动物实验动物实验 人体试食实验人体试食实验 细胞水平功能检验细胞水平功能检验应用于保健食品审评的保健食品功能学共有应用于保健食品审评的保健食品功能学共有27个项目。个项目。其中需要做人体试食试验的项目有其中需要做人体试食试验的项目有20个个；有有7 7个项目不需做人体试食试验；个项目不需做人体试食试验；有有1515个项目既要做动物实验，又要做人体试食试验；个项目既要做动物实验，又要做人体试食试验；有有5 5个项目只需做人体试食试验，而不需做动物实验（详见个项目只需
29、做人体试食试验，而不需做动物实验（详见下表）下表）。序号序号项目项目需动物实验需动物实验需人体试食试验需人体试食试验1辅助降血脂功能辅助降血脂功能2辅助降血糖功能辅助降血糖功能3抗氧化功能抗氧化功能4辅助改善记忆功能辅助改善记忆功能5促进排铅功能促进排铅功能6清咽功能清咽功能7辅助降血压功能辅助降血压功能8促进泌乳功能促进泌乳功能9减肥功能减肥功能10改善生长发育功能改善生长发育功能11改善营养性贫血功能改善营养性贫血功能12调节肠道菌群功能调节肠道菌群功能13促进消化功能促进消化功能14通便功能通便功能15对胃粘膜损伤有辅助保护功能对胃粘膜损伤有辅助保护功能序号项目需动物实验需人体试食试验1
30、616缓解视疲劳功能缓解视疲劳功能1717祛痤疮功能祛痤疮功能1818祛黄褐斑功能祛黄褐斑功能1919改善皮肤水份功能改善皮肤水份功能2020改善皮肤油份功能改善皮肤油份功能2121增强免疫力功能增强免疫力功能2222改善睡眠功能改善睡眠功能2323缓解体力疲劳功能缓解体力疲劳功能2424提高缺氧耐受力功能提高缺氧耐受力功能2525对辐射危害有辅助保护功能对辐射危害有辅助保护功能2626对化学性肝损伤有辅助保护功能对化学性肝损伤有辅助保护功能2727增加骨密度功能增加骨密度功能：“”表示需要；“”表示不需要。39此七种功能只需进行动物试验，不需要进行人体试验此七种功能只需进行动物试验，不需要进
31、行人体试验增强免疫力增强免疫力改善睡眠改善睡眠对化学性肝损伤有辅助保护对化学性肝损伤有辅助保护对辐射危害有辅助保护功能对辐射危害有辅助保护功能缓解体力疲劳缓解体力疲劳提高缺氧耐受力提高缺氧耐受力增加骨密度增加骨密度细胞免疫功能的检测细胞免疫功能的检测体液免疫功能的检测体液免疫功能的检测单核巨噬细胞功能的检单核巨噬细胞功能的检测测NKNK细胞功能的检测细胞功能的检测 ConAConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验 小鼠迟发型变态反应小鼠迟发型变态反应抗体生成细胞检测抗体生成细胞检测血清溶血素的测定血清溶血素的测定小鼠碳廓清实验小鼠碳廓清实验小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实
32、验小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验乳酸脱氢酶（乳酸脱氢酶（LDHLDH）测定法）测定法实验动物实验动物 推荐用近交系小鼠，推荐用近交系小鼠，18-22g18-22g，单一性别，每组，单一性别，每组10-1510-15只只 剂量分组剂量分组 至少设置三个剂量组和一个阴性对照组，必要时设置阳性对照至少设置三个剂量组和一个阴性对照组，必要时设置阳性对照组或空白对照组。剂量选择应合理，以人体推荐量的组或空白对照组。剂量选择应合理，以人体推荐量的1010倍为其中的倍为其中的一个剂量组，另设两个剂量组，尽可能找出最低有效剂量。一个剂量组，另设两个剂量组，尽可能找出最低有效剂量。受试样品给予时间受试样品给予
33、时间 30 30天，必要时可延长至天，必要时可延长至4545天天 增强免疫力功能判定：在细胞免疫功能、体增强免疫力功能判定：在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核液免疫功能、单核巨噬细胞功能、巨噬细胞功能、NKNK细胞活性细胞活性四个方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样四个方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品增强免疫力。品增强免疫力。NKNK细胞活性结果判定：细胞活性结果判定：测定项目中的两个实验结果均测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定细胞剂量组结果阳性，可判定细胞免疫功能测定结果阳性。免疫功能测定结果阳性。测定实验的两个剂量
34、测定实验的两个剂量组结果阳性，可判定组结果阳性，可判定NKNK细胞活性结果阳性。细胞活性结果阳性。细胞免疫功能结果判定：细胞免疫功能结果判定：体液免疫功能结果判定：体液免疫功能结果判定：单核单核巨噬细胞功能结果判定：巨噬细胞功能结果判定：ConAConA：刀豆蛋白：刀豆蛋白A A；MTT MTT：四甲基偶氮唑盐：四甲基偶氮唑盐原理：原理：当当T T淋巴细胞受淋巴细胞受ConAConA刺激后发生母细胞增殖反应，活细刺激后发生母细胞增殖反应，活细胞特别是增殖细胞中的线粒体水解酶可将胞特别是增殖细胞中的线粒体水解酶可将MTTMTT分解为蓝紫色结晶分解为蓝紫色结晶显色，其光密度值能反映细胞的增殖情况显
35、色，其光密度值能反映细胞的增殖情况。脾细胞悬液配置脾细胞悬液配置无菌条件下取小鼠脾脏，置于盛有适量无菌无菌条件下取小鼠脾脏，置于盛有适量无菌PBS液的平皿中；液的平皿中；切碎小鼠脾脏，纱网过滤，制成单细胞悬液；切碎小鼠脾脏，纱网过滤，制成单细胞悬液；PBS液洗液洗2次，每次次，每次1000rpm/min，离心，离心5min；细胞悬浮于细胞悬浮于1ml完全培养基中；完全培养基中；台盼兰染色，计数活细胞数（应在台盼兰染色，计数活细胞数（应在95%以上）；以上）；调整细胞浓度为调整细胞浓度为3x106个个/ml。淋巴细胞增殖反应淋巴细胞增殖反应脾细胞悬液加入脾细胞悬液加入96孔培养板中，孔培养板中，
36、100 l/孔；孔；实验组加最适剂量的实验组加最适剂量的ConA液，液，5%CO2，37 培养箱培养培养箱培养68h；细胞饥饿培养细胞饥饿培养24h，加入，加入CCK8液，继续培养液，继续培养4h；酶标仪检测酶标仪检测450nm 处光密度值。处光密度值。淋巴细胞的增殖能力淋巴细胞的增殖能力=加加ConAConA孔的光密度值孔的光密度值 -不加不加ConAConA孔的光密度值孔的光密度值方差分析，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比方差分析，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法统计，若较方法统计，若P P 0.050.05，各组均数间显著性差异，各组均数间显著性差异，若若P P 0.0
37、50.05，组均数间无显著性差异。，组均数间无显著性差异。受试样品组的光密度差值显著高于对照组的光密度差值受试样品组的光密度差值显著高于对照组的光密度差值，可判定该实验结果阳性，可判定该实验结果阳性原理：原理：二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFBDNFB）是一种半抗原，将其稀释液）是一种半抗原，将其稀释液涂抹小鼠腹壁皮肤后，与皮肤蛋白结合成完全抗原，由涂抹小鼠腹壁皮肤后，与皮肤蛋白结合成完全抗原，由此刺激此刺激T T淋巴细胞增殖程致敏淋巴细胞。淋巴细胞增殖程致敏淋巴细胞。4-7d4-7d后将其涂后将其涂抹于耳部进行抗原攻击，使局部产生迟发型变态反应（抹于耳部进行抗原攻击，使局部产生迟发型变态反应（
38、肿胀）。一般在抗原攻击后肿胀）。一般在抗原攻击后24-48h24-48h达高峰，故于此时测达高峰，故于此时测定其肿胀程度。肿胀程度反应迟发型变态反应程度。定其肿胀程度。肿胀程度反应迟发型变态反应程度。DNFBDNFB溶液配制：溶液配制：新鲜配制，称取新鲜配制，称取DNFB50mgDNFB50mg，置于清洁干燥小，置于清洁干燥小瓶中，将预先配制好的瓶中，将预先配制好的5ml 5ml 丙酮麻油溶液（丙酮麻油溶液（V/V=1:1V/V=1:1），倒），倒入小瓶，盖好瓶塞并用胶布密封，混匀后，用注射器通过瓶入小瓶，盖好瓶塞并用胶布密封，混匀后，用注射器通过瓶盖取用。盖取用。致敏致敏激发激发小鼠腹部皮肤
39、脱毛，范围小鼠腹部皮肤脱毛，范围约约3cm3cm*3cm3cm，DNFBDNFB溶液溶液5050l l均匀涂抹致敏。均匀涂抹致敏。5 5天后，用天后，用DNFBDNFB溶液溶液1010l l均匀涂抹于小鼠均匀涂抹于小鼠左耳（两面）进行激发；左耳（两面）进行激发；触发触发24h24h后，游标卡尺测量左右耳廓厚度；后，游标卡尺测量左右耳廓厚度；处死小鼠，剪下左右耳；处死小鼠，剪下左右耳；打孔器取下直径打孔器取下直径8mm8mm的耳片，称重。的耳片，称重。各组小鼠在致敏激发后均出各组小鼠在致敏激发后均出现不同程度的耳廓红肿、渗现不同程度的耳廓红肿、渗出出，第，第3 3次激发后各组小鼠次激发后各组小鼠
40、皮损处出现轻微结痂。皮损处出现轻微结痂。模型模型组左耳相比右耳明显变厚，组左耳相比右耳明显变厚，且血管清晰可见。且血管清晰可见。结果判定结果判定 用左右耳重量之差表示迟发型变态反应的程度，受试样品用左右耳重量之差表示迟发型变态反应的程度，受试样品组的重量差值显著高于对照组的重量差值（组的重量差值显著高于对照组的重量差值（P P 0.05 0.05），），可判定该项实验结果阳性。可判定该项实验结果阳性。注意事项注意事项 操作时避免操作时避免DNFBDNFB与皮肤接触。与皮肤接触。制备制备SRBCSRBC原理：原理：用绵羊红细胞（用绵羊红细胞（SRBCSRBC）免疫的）免疫的小鼠脾细胞悬液与一定量
41、的小鼠脾细胞悬液与一定量的SRBCSRBC混合，在补体参与下，使混合，在补体参与下，使分泌抗体的脾细胞周围的分泌抗体的脾细胞周围的SRBCSRBC溶解，形成肉眼可见的空斑。溶解，形成肉眼可见的空斑。溶血空斑数可反映抗体分泌细溶血空斑数可反映抗体分泌细胞数。胞数。SRBCSRBC与脾细胞共孵育与脾细胞共孵育免疫动物免疫动物制备脾细制备脾细胞悬液胞悬液制备补体制备补体补体参与补体参与形成溶血空斑形成溶血空斑制备制备SRBCSRBC免疫动物免疫动物制备脾细制备脾细胞悬液胞悬液制备补体制备补体玻片小室的制作细胞混合液的配制细胞混合液的配制混合细胞的灌注混合细胞的灌注取洁净（无油）的载玻片，按图粘三条透
42、明胶带，在胶带上薄涂一层凡士林（勿涂到小室内），然后用镊子取两个盖片，分别放在其上，制成两个小室。用镊子尾端将盖片压平贴牢（保持小室一定体积）。用凡士林将盖片底端（其中的任一端）封住，顶端作为注入细胞混合液。封小室开口封小室开口3737温箱中孵温箱中孵6060分钟分钟溶血空斑计数溶血空斑计数3.玻片小室的制作取洁净（无油）的载玻片，按图粘三条透明胶带，在胶带上薄涂一层凡士林（勿涂到小室内），然后用镊子取两个盖片，分别放在其上，制成两个小室。用镊子尾端将盖片压平贴牢（保持小室一定体积）。用凡士林将盖片底端（其中的任一端）封住，顶端作为注入细胞混合液。4.细胞混合液的配制：取小试管一只，将指示细胞
43、悬液与脾细胞悬液，混匀。5.混合细胞的灌注：于小室开口一端轻轻将细胞混合液注满小室，记录实际注入的细胞悬液微升数（约70ul）。每个样品注2个小室，取其平均值。6.用牙签粘取少许凡士林封小室开口。7.将作好的标本水平置湿盒中，放37温箱中孵60分钟8.溶血空斑计数：肉眼观察空斑并计数两个小室出现的溶血空斑数。对模糊不清的空斑可在低倍镜下检查，真正的溶血空斑必须中心有一个淋巴细胞，周围为透明区。全脾脏中抗体产生细胞总数可依下述公式计算：结果判定结果判定 空斑数空斑数/10/106 6脾细胞数（或空斑数脾细胞数（或空斑数/全脾细胞数）表示全脾细胞数）表示抗体生成细胞抗体生成细胞 受试样品组的空斑数
44、或空斑数受试样品组的空斑数或空斑数/全脾细胞数显著高于全脾细胞数显著高于对照组的空斑数（对照组的空斑数（P P 0.05 0.05），可判定该项实验结果），可判定该项实验结果阳性。阳性。原理：原理：巨噬细胞属机体的非特异性免疫细胞，在有异物侵入的时候，血液中释巨噬细胞属机体的非特异性免疫细胞，在有异物侵入的时候，血液中释放出巨噬细胞吞噬异物。放出巨噬细胞吞噬异物。鸡红细胞相对小鼠是异体抗原性物质，当被注入小鼠腹腔后，可引起腹鸡红细胞相对小鼠是异体抗原性物质，当被注入小鼠腹腔后，可引起腹腔巨噬细胞聚集并吞噬，这是衡量机体非特异性免疫功能的主要指标。腔巨噬细胞聚集并吞噬，这是衡量机体非特异性免疫功
45、能的主要指标。利用巨噬细胞对光滑表面如玻璃表面具有黏附的特性，将含有巨噬细胞利用巨噬细胞对光滑表面如玻璃表面具有黏附的特性，将含有巨噬细胞的腹腔液滴于载玻片上，加入鸡红细胞，孵育一段时间后，冲洗掉未黏的腹腔液滴于载玻片上，加入鸡红细胞，孵育一段时间后，冲洗掉未黏附的细胞，固定染色，在显微镜下计数吞噬鸡红细胞的巨噬细胞的吞噬附的细胞，固定染色，在显微镜下计数吞噬鸡红细胞的巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数，据此判定巨噬细胞的吞噬能力。率和吞噬指数，据此判定巨噬细胞的吞噬能力。结果判定结果判定 用用40 40 显微镜观察每显微镜观察每100100个巨噬细胞吞噬鸡红细胞的个数，计个巨噬细胞吞噬鸡红细胞的个数
46、，计算吞噬率和吞噬指数。算吞噬率和吞噬指数。受试样品组的吞噬百分率和吞噬指数与对照组相比，差异均有受试样品组的吞噬百分率和吞噬指数与对照组相比，差异均有显著性，方可判定该项结果阳性。显著性，方可判定该项结果阳性。小鼠腹腔中的巨噬细胞小鼠腹腔中的巨噬细胞腹水中的巨噬细胞腹水中的巨噬细胞此七种功能只需进行动物试验，不需要进行人体试验此七种功能只需进行动物试验，不需要进行人体试验增强免疫力增强免疫力改善睡眠改善睡眠对化学性肝损伤有辅助保护对化学性肝损伤有辅助保护对辐射危害有辅助保护功能对辐射危害有辅助保护功能缓解体力疲劳缓解体力疲劳提高缺氧耐受力提高缺氧耐受力增加骨密度增加骨密度直接睡眠实验直接睡眠
47、实验 比较对照组与受试样品组入睡动物数及睡眠时间的差异，若入睡动物数及比较对照组与受试样品组入睡动物数及睡眠时间的差异，若入睡动物数及睡眠时间增加有显著性，则实验结果阳性。睡眠时间增加有显著性，则实验结果阳性。延长戊巴比妥钠睡眠时间实验延长戊巴比妥钠睡眠时间实验 在戊巴比妥钠催化的基础上，观察受试样品能否延长戊巴比妥钠睡眠时间在戊巴比妥钠催化的基础上，观察受试样品能否延长戊巴比妥钠睡眠时间，睡眠时间延长有显著性，则实验结果阳性。，睡眠时间延长有显著性，则实验结果阳性。戊巴比妥钠（或巴比妥钠）阈下剂量催眠实验戊巴比妥钠（或巴比妥钠）阈下剂量催眠实验 注射戊巴比妥钠最大阈下剂量，记录注射戊巴比妥钠
48、最大阈下剂量，记录3030分钟内睡眠动物数，入睡分钟内睡眠动物数，入睡动物发生率显著增加，则结果阳性。动物发生率显著增加，则结果阳性。此七种功能只需进行动物试验，不需要进行人体试验此七种功能只需进行动物试验，不需要进行人体试验增强免疫力增强免疫力改善睡眠改善睡眠对化学性肝损伤有辅助保护对化学性肝损伤有辅助保护对辐射危害有辅助保护功能对辐射危害有辅助保护功能缓解体力疲劳缓解体力疲劳提高缺氧耐受力提高缺氧耐受力增加骨密度增加骨密度化学性肝损伤：是由化学性肝毒性物质所造成的肝损伤。化学性肝损伤：是由化学性肝毒性物质所造成的肝损伤。根据毒性强弱，亲肝毒物可分为三类根据毒性强弱，亲肝毒物可分为三类 1.
49、1.剧毒类：包括磷、三硝基甲苯、四氯化碳、氯奈、丙烯醛等剧毒类：包括磷、三硝基甲苯、四氯化碳、氯奈、丙烯醛等。2.2.高毒类：砷、汞、锑、苯胺、氯仿、呻化氢、二甲基甲酰胺高毒类：砷、汞、锑、苯胺、氯仿、呻化氢、二甲基甲酰胺等。等。3.3.低毒类：二硝基酚、乙醛、有机磷、丙烯晴、铅等。低毒类：二硝基酚、乙醛、有机磷、丙烯晴、铅等。动物实验方案动物实验方案 1.1.四氯化碳肝损伤模型四氯化碳肝损伤模型 2.2.酒精肝损伤模型酒精肝损伤模型测试指标测试指标 体重，谷丙转氨酶（体重，谷丙转氨酶（ALTALT），谷草转氨酶（），谷草转氨酶（ASTAST），肝组织），肝组织病理学检查病理学检查结果判定结果
50、判定 病理结果阳性，谷丙转氨酶和谷草转氨酶二指标中任一项病理结果阳性，谷丙转氨酶和谷草转氨酶二指标中任一项指标阳性，可判定该受试样品具有对化学性肝损伤有辅助保护指标阳性，可判定该受试样品具有对化学性肝损伤有辅助保护功能作用。功能作用。测试指标测试指标 体重，丙二醛（体重，丙二醛（MDAMDA），还原型谷胱甘肽（），还原型谷胱甘肽（GSHGSH），甘油三酯（），甘油三酯（TGTG），肝组织病理学检查，肝组织病理学检查 结果判定结果判定 肝脏肝脏MDAMDA、GSHGSH、TGTG三项指标结果阳性，可判定该受试样品对乙醇引三项指标结果阳性，可判定该受试样品对乙醇引起的肝损伤有辅助保护功能，起的肝损
