1、第第3636讲讲 基因工程基因工程 第第1010单元单元 2022 第1课时 基因工程的基本工具与操作程序 内 容 索 引 01 02 03 素养导读素养导读 必备知识必备知识 固本夯基固本夯基 核心考点核心考点 能力提升能力提升 素养导读素养导读 必备知识必备知识 固本夯基固本夯基 一、重组DNA技术的基本工具 1.限制性内切核酸酶“分子手术刀” (1)来源:限制性内切核酸酶又称限制酶,这类酶主要是从 中 分离纯化出来的。 (2)作用及特点 作用:切割双链DNA分子每条链中特定部位的 。 特点:具有特异性,能够识别双链DNA分子的特定 ,并使 的磷酸二酯键断开。 结果:产生 和 。 原核生物
2、 磷酸二酯键 核苷酸序列 特定部位 黏性末端 平末端 名师点睛将一个基因从DNA分子上切割下来,需要切两处,同时产生4个 黏性末端或平末端。 限制酶在识别序列中心轴线两侧切开形成的是黏性末端,而在识别序列 中心轴线处切开形成的是平末端。 2.DNA连接酶 常用类型 E.coli DNA连接酶 T4DNA连接酶 来 源 T4噬菌体 功 能 只“缝合” “缝合” 结 果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的 大肠杆菌 黏性末端 黏性末端和平末端 磷酸二酯键 3.载体 (1)作用:将外源基因送入细胞。 (2)种类:质粒、 、动植物病毒等。 (3)质粒作为载体的条件或特点: 能在受体细胞中进行 。 有一
3、个至多个 切割位点,供外源DNA片段(基因)插入其中。 特殊的 ,便于重组DNA分子的筛选。 对受体细胞无害。 噬菌体 自我复制 限制酶 标记基因 二、基因工程的基本操作程序 1.基本程序 预期表达产物 PCR 启动子 标记 农杆菌转化法 显微注射 插入了目的基因 转录出了mRNA 抗原抗体杂交 基因 2.利用PCR获取和扩增目的基因 (1)原理:DNA 复制。 (2)过程:变性 (3)结果:由于延伸后得到的产物又可以作为下一个循环的模板,因而每一 次循环后目的基因的量可以增加一倍,即成 形式扩增(约为 , 其中n为扩增循环的次数)。 半保留 复性 延伸 指数 2n 概念检测 1.判断下列关于
4、基因工程的基本工具的表述是否正确。 (1)限制酶只能用于切割目的基因。( ) (2)每个质粒DNA分子上至少含一个限制酶识别位点。( ) (3)DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来。( ) (4)E.coli DNA连接酶既可连接平末端,又可连接黏性末端。( ) (5)限制酶也可以识别和切割RNA。( ) (6)限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具 酶。( ) (7)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因。( ) 答案 (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) 2.基于基因工程的基本操作程序,判断下列表述是否正确。 (1)根据不同的需要,目的基
5、因是不同的,但都是能编码蛋白质的基因。( ) (2)为培育抗除草剂的作物新品种,导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受 体。( ) (3)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达。( ) (4)检测目的基因是否成功表达可用抗原抗体杂交技术。( ) (5)PCR反应中温度的周期性改变是为了使DNA聚合酶催化不同的反应。 ( ) (6)PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶。( ) (7)目的基因导入双子叶植物一般采用农杆菌转化法。( ) 答案 (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) 教材拓展 (人教版选择性必修3 P83“到社会中去”)转基因抗虫棉在世界范
6、围内被广 泛种植,有效控制了棉铃虫的种群数量,显著减少了农药的用量。面对棉铃 虫的危害,有了抗虫棉是否就可以一劳永逸、高枕无忧呢?根据棉铃虫对 传统农药产生抗性的发展历史,科研人员推测棉铃虫存在对抗虫棉产生抗 性的可能。 (1)为什么科研人员推测棉铃虫存在对抗虫棉产生抗性的可能? 提示 变异是不定向的,棉铃虫对抗虫棉产生的抗性可能在种植抗虫棉之 前就已经产生。 (2)为应对可能出现的抗性,请你提出相应的措施。 提示 保护棉铃虫的天敌;通过导入多种抗虫基因培育抗虫棉;轮换种植或 混合种植转入不同抗虫基因的转基因抗虫棉,等等。 核心考点核心考点 能力提升能力提升 考点一考点一 基因工程的基本工具基
7、因工程的基本工具 合作探究合作探究 探究1构建基因表达载体时需要选择合适的限制酶切割含有目的基因的 DNA片段和载体 已知限制性内切核酸酶的识别序列和切点是 ,限制性内切 核酸酶的识别序列和切点是 ,根据图示讨论下列问题。 (1)请用图示法写出限制性内切核酸酶和限制性内切核酸酶切割后形 成黏性末端的过程。 提示 限制性内切核酸酶: 限制性内切核酸酶: (2)切割图示中的目的基因和质粒应选用哪类限制酶?请说明理由。 提示 限制酶的识别序列包含限制酶的识别序列,因此限制酶也可 切割限制酶的位点,故使用限制酶时,可在目的基因两端同时作切割, 从而切出“目的基因”,但若使用限制酶切割质粒,会同时破坏质
8、粒中的两 个“标记基因”,故只能使用限制酶切割质粒。 探究2质粒作为载体,将目的基因送入细胞,并利用标记基因筛选重组DNA 分子 在基因工程操作中,真正被用作载体的质粒,都是在天然质粒的基础上进行 过人工改造的。这些质粒上常有特殊的标记基因,便于重组DNA分子的筛 选。 (1)下图表示四种质粒,其中Mun和EcoR是两种限制性内切核酸酶,箭 头所指部位为限制性内切核酸酶的识别位点,质粒的阴影部分表示标记基 因。适于作为载体的质粒是哪一种?并指明理由。 提示 适合的质粒是。由图可知,质粒上无标记基因,不适合作为载体; 质粒和的标记基因上都有限制性内切核酸酶的识别位点,使用该酶后 将会导致标记基因
9、遭到破坏,故均不宜选作载体。 (2)若利用下图1所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的 重组质粒。这三种重组质粒中,不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有 哪些?试分析不能表达的原因。 图1 图2 提示 甲和丙。甲中目的基因插入在启动子的上游,丙中目的基因插入在 终止子的下游,二者的目的基因均不能被转录(其他合理答案也可)。 方法技巧选择限制酶的技巧 (1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类 应选择切点位于目的基因两端的限制酶,如图甲可选择Pst。 不能选择切点位于目的基因内部的限制酶,如图甲不能选择Sma。 为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,也可使用不同的限制酶 切
10、割目的基因和质粒,如图甲也可选择用Pst和EcoR两种限制酶(但要 确保质粒上也有这两种酶的切点)。 (2)根据质粒的特点确定限制酶的种类 所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致,以确保具有相同的黏性末 端。 质粒作为载体必须具备标记基因等,所以所选择的限制酶尽量不要破坏 这些结构,如图乙中限制酶Sma会破坏标记基因。 考向突破考向突破 考向1 基因工程中工具酶的作用 1.下表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点,由 此推断以下说法中,正确的是( ) 限制性内 切核酸酶 识别序列和 切割位点 限制性内 切核酸酶 识别序列和 切割位点 BamH Kpn EcoR Sau3A
11、Hind Sma 注:Y表示C或T,R表示A或G。 A.一种限制酶只能识别一种核苷酸序列 B.限制酶切割后一定形成黏性末端 C.不同的限制酶可以形成相同的黏性末端 D.限制酶的切割位点在识别序列内部 答案 C 解析 根据表格内容可以推知,每种限制酶都能识别特定的核苷酸序列,但 不一定只能识别一种序列,如限制酶Hind,A项错误;限制酶切割后能形成 黏性末端或平末端,如限制酶Hind切割后露出平末端,B项错误;不同的限 制酶切割后可能形成相同的黏性末端,如限制酶BamH和Sau3A切割后 露出的黏性末端相同,C项正确;限制酶的切割位点可以位于识别序列的外 侧,如Sau3A,D项错误。 规律方法限
12、制酶的识别序列和切割末端的判断 (1)识别序列的特点:呈现碱基互补对称,无论是奇数个碱基还是偶数个碱 基,都可以找到一条中心轴线,中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对 称重复排列的。 (2)判断黏性末端或平末端是否由同一种限制酶切割形成的方法是:将黏性 末端或平末端之一旋转180后,看它们的碱基序列是否完全相同。若相 同,则是由同种限制酶切割形成的。 归纳拓展对限制酶和载体切割位点的说明 (1)若用于切割载体的限制酶有多个切点,则切割后载体可能丢失含有复制 起始点的片段,重组DNA分子进入受体细胞后便不能进行自主复制。 (2)切点所处位置必须在载体本身需要的基因片段之外,以避免载体因目的 基
13、因的插入而失活。 考向2 载体的作用和特点 2.下图所示为pBR322质粒,其中Ampr(氨苄青霉素抗性基因)和Tetr(四环素 抗性基因)为标记基因,ori为复制原点,其他均为限制酶及其识别位点,并且 每种限制酶都只有一个。pBR322质粒是基因工程较常用的运载体。回答 下列相关问题。 (1)制备重组质粒,需要限制酶和 酶。如制备重组质粒时,使用 Pvu切割该质粒,则检测目的基因是否导入受体细胞,需要在培养基中添 加 。 (2)该质粒中的BamH识别的核苷酸序列及切割位点为 ,而 Sau3A识别的核苷酸序列只有4个碱基。若BamH和Sau3A分别切割 DNA所形成的DNA片段能拼接成一条DN
14、A链,则Sau3A识别的核苷酸序 列及切割位点为 。该拼接在一起的DNA片段,能否被 BamH识别? 。 (3)与图示质粒相比,完整的重组质粒中还应有 等三种特殊的DNA片段。将重组质粒导入动、植物细胞的方法分别 为 。如受体细胞为大肠杆菌,则该 菌经钙离子处理后会具备 的特性。 答案 (1)DNA连接 四环素 (2) 不一定能 (3)启动子、终 止子和目的基因 显微注射法、农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道 法(后者答出一个即可) 将外界DNA吸入细胞 【归纳总结】载体上标记基因的作用 载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受 体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生
15、素抗性基因的载体进入 受体细胞后,抗性基因在受体细胞内表达,使受体细胞能够抵抗相应抗生素, 所以在受体细胞的培养基中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受 体细胞,原理如下图所示: 考点二考点二 基因工程的操作程序基因工程的操作程序 合作探究合作探究 探究1利用PCR技术可特异性地快速扩增目的基因 PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理,在 体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件,对目的基因的核苷酸序列 进行大量复制的技术。结合下列图解,讨论相关问题。 (1)利用PCR技术扩增目的基因需要提供哪些条件? 提示 需要模板、酶、原料、引物以及反应需要的适宜温度和pH等
16、条件。 即以DNA两条链为模板,在热稳定DNA聚合酶的作用下,4种脱氧核苷酸(A、 T、C、G)用于合成子链的原料,从引物的3端开始连接脱氧核苷酸。反应 过程中,缓冲溶液使pH保持稳定,同时还要保证变性、复性和延伸需要的 适宜温度。 (2)什么是引物?一个目的基因(DNA)分子在第3次扩增时,需要几种引物? 需要几个引物? 提示 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核 酸,作为新子链的合成起点,只能结合在母链的3端。一个目的基因(DNA) 分子在第3次扩增时,需要2种引物;第三次复制是在第二次复制的基础上进 行的,第二次复制得到四个DNA分子,共八条链,因此需要8个引物。
17、归纳总结(1)PCR技术与细胞内DNA复制的比较 比较项目 细胞内DNA复制 PCR技术 区 别 解旋方式 解旋酶催化 DNA在高温下变性解旋 场所 主要在细胞核内 细胞外 酶 解旋酶、DNA聚合酶 热稳定DNA聚合酶 温度 细胞内温和条件 控制温度,需在不同温度下进行 结果 合成整个DNA分子 扩增特定的DNA片段或基因 联系 (1)模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板 (2)原料:均为四种脱氧核苷酸 (3)酶:均需DNA聚合酶 (4)引物:都需要引物,使DNA聚合酶从引物开始进行互补 链的合成 (2)PCR扩增过程中的循环图示与规律 循环次数 1 2 3 4n DNA分子数 2 4 8 2n
18、 含引物A(或B) 的DNA分子数 1 3 7 2n-1 同时含引物A、B 的DNA分子数 0=21-2 2=22-2 6=23-2 2n-2 共消耗的引物数量 2=21+1-2 6=22+1-2 14=23+1-2 2n+1-2 注:第三轮循环后,开始出现双链等长的目的基因片段。 探究2构建基因表达载体是基因工程的核心 一般用同一种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割载体和含有目的基 因的DNA片段,再用DNA连接酶把两者连接(如下图)。 (1)构建基因表达载体时往往用两种限制酶分别切割目的基因的两端以及 载体,请分析原因。 提示 如果用一种限制酶切割,目的基因两侧的末端以及质粒切口的两 个末
19、端都是互补的,因此连接时可能会出现载体与载体、目的基因与目的 基因、目的基因与载体三种连接情况,而符合要求的只有载体与目的基因 的连接。如果用两种不同的限制酶进行切割就可以有效避免载体与载 体以及目的基因与目的基因的连接,提高连接的有效性。 (2)启动子是起始密码子吗?终止子是终止密码子吗? 提示 启动子是一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的上游。它是RNA 聚合酶识别、结合的部位。终止子是一段有特殊结构的DNA短片段,位于 基因的上游,作用是使转录过程在所需要的地方停止。起始密码子和终止 密码子位于mRNA上,分别控制翻译过程的启动和终止。 名师点睛(1)基因工程操作中,只有使用受体生物自
20、身基因的启动子才有利 于基因的表达。 (2)质粒中的标记基因、目的基因片段中不能含有限制酶的识别序列,防止 标记基因和目的基因被限制酶破坏。 (3)质粒中限制酶的切割位点应该在启动子和终止子之间,目的基因应插入 启动子和终止子之间,以保证目的基因的表达。 考向突破考向突破 考向1 PCR技术的流程和原理 1.(2020江苏)如果已知一小段DNA的序列,可采用PCR的方法,简捷地分析 出已知序列两侧的序列,具体流程如下图(以EcoR 酶切为例)。 请据图回答问题。 (1)步骤用的EcoR是一种 酶,它通过识别特定的 切割特定位点。 (2)步骤用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3-羟基与5-磷酸
21、间形 成 ;PCR循环中,升温到95 是为了获得 ;Taq DNA聚合酶的作用是催化 。 (3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物,步骤选用的 PCR引物必须是 (从引物中选择,填编号)。 对 象 DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列) 已知序列 PCR引物 5-AACTATGCGCTCATGA-3 5-GCAATGCGTAGCCTCT-3 5-AGAGGCTACGCATTGC-3 5-TCATGAGCGCATAGTT-3 (4)对PCR产物测序,经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列 中(虚线处省略了部分核苷酸序列),结果正确的是 。 A.5-AACTATGCGA
22、GCCCTT-3 B.5-AATTCCATGCTGAATT-3 C.5-GCAATGCGTTCGGGAA-3 D.5-TTGATACGCCGAGTAC-3 答案 (1)限制性内切核酸(或限制) 核苷酸序列 (2)磷酸二酯键 DNA 单链 以DNA为模板的DNA链的延伸 (3) (4)B 解析 本题主要考查基因工程的相关知识,旨在考查考生对PCR过程的理 解。(1)由图可知,EcoR将DNA分子切出两个黏性末端,可判断EcoR是 一种限制性内切核酸(或限制)酶;限制酶能够识别双链DNA分子的某种特 定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯 键断裂。 (2)DNA连接酶催化
23、相邻核苷酸之间的3-羟基与5-磷酸间形成磷酸二酯 键;PCR扩增DNA的过程包括变性、复性和延伸,高温95 变性是为了破 坏碱基对之间的氢键,获得DNA单链,TaqDNA聚合酶能够催化以DNA为模 板的DNA子链沿引物的3端延伸。(3)引物是一小段单链DNA,引物5端的 碱基可以与DNA两条链的3端的碱基进行碱基互补配对,可作为DNA复制 的起始点,子链的延伸方向为53。据题图分析,结合已知序列可知,能与 片段F左边配对的引物为,与右边配对的引物为,故步骤选用的PCR 引物应为。(4)对PCR产物测序,得到了片段F的完整序列,由于片段F 具有被限制酶EcoR剪切的黏性末端,EcoR识别的序列是
24、GAATTC,且 在G与A之间切割,所以5端应该是AATTC,3端是GAATT,故选B项。 考向2 基因工程的基本操作程序 2.(2020江苏淮安期中)(多选)SARS病毒表面的S蛋白是主要的病毒抗原,在 SARS病人康复后的血清中有抗S蛋白的特异性抗体。研制预防SARS病毒 的疫苗简要的操作流程如下,有关叙述正确的是( ) A.步骤所代表的反应过程是逆转录 B.将大量扩增的S基因直接导入大肠杆菌,也能得到表达的S蛋白 C.步骤和常用的方法分别是农杆菌转化法和显微注射法 D.可用抗原抗体杂交法检测细胞中是否真正成功表达了病毒S蛋白 答案 AD 解析 步骤所代表的反应过程是以RNA为模板合成DNA的逆转录,A项 正确;目的基因需要与运载体连接后才能导入受体细胞,不能直接导入受体 细胞,B项错误;将目的基因导入微生物细胞常用Ca2+处理法,将目的基因导 入动物细胞最有效的方法是显微注射法,即步骤和常用的方法分别是 Ca2+处理法和显微注射法,C项错误;可用抗原抗体杂交法检测目的基因 是否成功表达,即可用抗原抗体杂交法检测细胞中是否真正成功表达了 病毒S蛋白,D项正确。
