1、细胞工程全册配套 完整精品课件 2 第第2讲讲 植物人工繁殖植物人工繁殖 3 o本节主要内容 o 1、组织培养再生植物 o 2、人工种子 o本节重要问题 o 1、细胞全能性、细胞分化与脱分化 o 2、激素在细胞分化中的调节作用 o 3、植物经组织培养的再生途径 4 基本概念：基本概念： 细胞全能性细胞全能性 细胞分化细胞分化 脱分化脱分化 再分化再分化 5 1细胞全能性 o细胞全能性细胞全能性(totipotency)：指分化细胞保留着全部的核基因 组，具有生物个体生长、发育所需要的全部遗传信息，具 有发育成完整个体的潜能。 o1902年，德国植物学家哈伯兰德(Haberlandt)提出了细胞
2、全 能性学说，预言植物细胞具有全能性。 n 细胞全能性首先在植物中被证实。1958年，史都华德（Steward） 等利用胡萝卜根韧皮部组织培养出了完整的新植株，证明高度分 化的植物营养组织仍保持着发育成完整植株的能力，以无性繁殖 方式繁殖后代。 n 1960年，Morel提出了离体无性繁殖兰花的新方法，其繁殖系数之 高，可谓始料不及，于是很快被兰花生产者所采用，从而在西方 迅速建立起了“兰花工业兰花工业”。可以说，这是植物组织培养技术第 一次在园艺作物上形成规模化的生产应用。 6 2 细胞分化 o细胞分化细胞分化（Differentiation）是指细胞在形态、结构和功 能上发生差异的过程，包
3、括时间上和空间上的分化。 n 时间上的分化是指一个细胞在不同的发育阶段可以形成不同 的形态和功能； n 空间上的分化是指同一种细胞由于所处的环境或部位不同可 以形成不同的形态和功能。细胞分化能力的强弱称为发育潜 能。 o细胞分化与形态发生（Morphogenesis）是相互联系在 一起的。形态发生是指通过细胞增殖、分化和行为塑 造组织、器官和个体形态的过程。 7 细胞分化的实质是基因的差异表达基因的差异表达 o 细胞分化的实质是基因的差异表达差异表达 （Differential expression）, 是奢侈基因按照一 定顺序表达的结果。 o 一些特定奢侈基因表达的结果生产一种类型的 分化细
4、胞。 n 在基因差异性表达中包括结构基因和调节基因的 差异性表达，差异表达的结构基因受组织特异性 表达的调控基因调控。 8 3细胞脱分化 o脱分化脱分化（Dedifferentiation）又称去分化，是指分 化细胞失去特有的结构和功能变为具有未分化细 胞特性的过程，即分化的细胞在适当条件下转变 为胚性状态而重新获得分裂能力的过程。 o不同生物的细胞脱分化能力不同，通常采用人工 诱导技术诱导体细胞的脱分化。不同生物的细胞 脱分化能力不同，决定了组织培养再生的难易。 9 o 脱分化后的植物细胞 经过细胞分裂，产生 无组织结构、无明显 极性的松散的细胞团 （原始胚样组织）， 称之为愈伤组织愈伤组织
5、 （Callus）。它具有再 分化成为完整植物体 的潜能。 愈伤组织愈伤组织 10 4 细胞再分化细胞再分化 o 再分化再分化（Redifferentiation）是指在离体条件下， 无序生长的脱分化的细胞在适当条件下重新 进入有序生长和分化状态的过程。细胞再分 化过程事实上是基因选择性表达与修饰的人 工调控过程。 o 再分化是再生的基础。离体培养植物组织或 细胞再生植株就是通过细胞脱分化和再分化 实现的。 o 脱分化是细胞全能性细胞全能性表现的前提，再分化是 细胞全能性的最终体现。 11 植物人工繁殖：通过无性繁殖实现植物快速繁殖 方法：组织培养、人工种子、胚胎培养 目的：为克服自然有性生殖
6、的不足，满足对优良植物的大量需求 12 二 植物组织培养植物组织培养再生再生 o 植物组织培养植物组织培养（Plant tissue culture）是将植物器官、 组织、细胞或原生质体等外植体材料无菌条件下培养 在人工培养基上，在适当条件下诱发长成完整植株的 一种技术。 o 愈伤组织愈伤组织：指由植物的一种组织或器官经历脱分化形 成的原始胚样组织，它具有再分化成为完整植物体的 潜能。 o 外植体外植体（Explant）:主要指用于离体培养的植物或组 织切段。可以是器官、组织、细胞和原生质体等。 o 继代培养继代培养:愈伤组织在培养基上生长一段时间后营养 物枯竭，水分散失，并已经积累一些代谢产
7、物，此时 需要将这些组织转移到新的培养基上。 13 植物组织培养的优点 14 http:/ 15 http:/www.lanmei.cc/ 16 5 脱病毒植株脱病毒植株 o 很多农作物都带有病毒，尤其是无性繁殖植物， 如马铃薯、甘草、草莓、大蒜等。病毒积累，危 害加重。 o 植物生长点附近的病毒浓度很低甚至无病毒。因 为该区无维管束，病毒难以进入，所以茎尖培养 成为获得无病毒植株的重要途径。 17 http:/ 18 19 植物组织培养的应用 o 1.快速繁殖：例如一株兰花一年可以繁殖到400万株。 o 2.种苗脱毒：可以有效地培育出大量的无病毒种苗。 已经取得成功的有马铃薯、草莓、香蕉等。
8、 o 3.突变育种：可以直接诱变筛选出具抗病、抗盐以及 高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种。 o 4.基因工程育种：基因转导后通过组织培养途径实现 植株再生。 o 5.远缘杂交：利用离体受精技术和组织培养结合可以 实现远缘杂交，培育一些罕见的新物种。例如苹果与 梨的杂交种。 20 植物组织培养植物组织培养技术技术 o 1.生物条件 n 外植体（Explant）主要指用于离体培养的植物或组 织切段。 o 因素： n 不同植物品种 n 同一品种不同取材部位、发育阶段。一般：生长点、幼嫩组 织 n 大小适中，进行清洗、灭菌，大了容易污染，小了不易成活 21 2.物理条件： o 培养环境、组织培养 室
9、n无菌环境，人工控制 温度、光照、湿度等 培养条件。 n需要一定的设备、器 材和用具。 22 23 3 化学条件：培养基 o（1）无机盐无机盐 n 培养基中无机盐的浓度通常在 25mmol/L左右。 n 根据添加量分为大量元素（浓度大于0.5mmol/L）和微 量元素(浓度低于0.5mmol/L)。 n 大量元素主要有氮氮、硫、磷、钾、钙、镁。氮、硫、 磷是蛋白质、氨基酸、核酸和酶的主要成分。 n 微量元素主要包括铁、锰、铜、锌、氯、硼、钼等。 这些微量元素对于蛋白或酶的生物活性十分重要，并 参与生物过程的调节。 24 （2）有机物 o常用的有机物成分包括糖类、氨基酸、维生素、醇 类等。 n
10、糖类：是离体培养的植物细胞所必需的，既可以作为 碳源，又可以维持渗透压。蔗糖或蔗糖或D-葡萄糖是常用碳葡萄糖是常用碳 源源。 n 蔗糖浓度多在310之间，因不同植物材料而异。 n 一般在诱导培养阶段蔗糖浓度高诱导培养阶段蔗糖浓度高一些，分化培养时蔗分化培养时蔗 糖浓度低糖浓度低一些。 n 大多数植物以蔗糖为碳源时生长都较好，少数适合在 葡萄糖或果糖为碳源的培养基上生长。也有植物利用 麦芽糖、半乳糖、甘露醇、山梨醇和乳糖作为碳源。 25 o 氨基酸：通常采用蛋白质水解产物（包括酪蛋白水解物）、谷 氨酰胺或氨基酸混合物。 o 维生素：直接参与酶的合成，还参与蛋白质和脂肪的代谢。尽 管在培养过程中细
11、胞能合成必需的维生素，但是数量上满足不 了需求，需要在培养基中添加。 n常用的维生素：硫胺素（Thiamine,VB1），吡哆醇（Pyridoxin,VB6）、 烟酸（Nicotinic acid,Vpp）、生物素（Biotin,VH）、泛酸钙(Ca- pantothenate) 、叶酸(Folic acid)、维生素C等。 o 肌醇：在糖类的相互转化、维生素和激素利用等方面具有促进 作用，并能刺激细胞快速生长。 o 腺嘌呤：是合成细胞分裂素的前体物质之一。添加腺嘌呤能促 进细胞合成分裂素，有利于细胞的分裂和分化，促进芽的形成。 （2）有机物 26 （3）调节物质调节物质 o植物激素植物激素(
12、Phytohormone)是植物自然状态下产生的、 对生长发育有显著作用的微量有机物。能影响生能影响生 长和分化。长和分化。 o在个体发育中，不论是种子发芽、营养生长、繁在个体发育中，不论是种子发芽、营养生长、繁 殖器官形成以至整个成熟过程，殖器官形成以至整个成熟过程，主要由激素控制主要由激素控制。 n 植物激素的作用机理：植物体内的激素与细胞内某种 称为激素受体的蛋白质结合后，影响DNA、RNA和蛋 白质的合成，并对特殊酶的合成起调控作用，从而表 现出调节代谢的功能。 27 生长素生长素（Auxin） o 是由色氨酸通过一系列中间产物形成的。 o 在植物组织培养中，生长素主要用来刺激细 胞分
13、裂和诱导根诱导根的分化。常用的生长素有： 吲哚乙酸（IAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2， 4-D）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA） 等。其中吲哚乙酸在植物体内普遍存在，是 生理活性最强的生长素生长素。 o 生长素处理植物细胞主要作用于转录系统。 用生长素处理植物细胞能够刺激mRNA和 rRNA的合成以及某些核蛋白的磷酸化。 28 细胞分裂素细胞分裂素（Cytokinin） o 大多是嘌呤族衍生物大多是嘌呤族衍生物，自然状态下 分裂素主要在根中形成，茎端、萌 发中的种子、发育中的果实和种子 也能合成分裂素。 o 分裂素的生理作用主要是诱导芽的诱导芽的 分化促进侧芽萌发生长分化促进侧芽萌发生
14、长、促进细胞 分裂与扩大。多用于诱导不定芽的 分化和茎、苗的增殖，而在生根培 养时使用较少或用量较低。 o 主要有激动素（KT）、6-苄基腺嘌腺嘌 呤呤（BA）和玉米素（ZT）等。其中 最常用的是常用的是6苄基腺嘌呤。苄基腺嘌呤。 o 对于细胞分裂素的作用机理还不清 楚。 29 激素配比 o 1956年，米勒（Miller）从鱼精子中分离得到比腺嘌呤 活性高的激动素，效果比腺嘌呤好，代替了腺嘌呤而与 生长素一起控制器官分化并与斯库格（Skoog）一起提 出了植物激素控制器官形成的观点 19481948年，斯库格等较好地解决了如何从离体组年，斯库格等较好地解决了如何从离体组 织或器官中诱导植物再
15、生的方法，并确定了织或器官中诱导植物再生的方法，并确定了腺腺 嘌呤嘌呤/ /生长素的比例生长素的比例是控制芽和根形成的一个是控制芽和根形成的一个 重要条件：重要条件： 30 兰花组织培养兰花组织培养 o 兰花是第一个组织培养兰花是第一个组织培养 成功产业化的植物成功产业化的植物。 o 名贵兰花达摩兰： 以禅宗“一花开五叶， 结果自然成”的诗意命 名。 o 在台湾，早期达摩量少， 求种者多，非常昂贵； 有人曾以一盆爪艺达摩爪艺达摩 交换台中市一栋高楼交换台中市一栋高楼。 o 珍稀而名贵的达摩兰等 名贵兰花，如今已成市 井之花。一株不过百元。 31 激素配比举例激素配比举例 32 虽然海藻组织培养
16、成果显著,但是仍然存在许多尚未解 决的问题。海藻的愈伤组织由于诱导率低、生长缓慢 及分化困难,很难像高等植物一样大规模用于养殖育苗 和次生代谢产物的生产。 海藻组织培养海藻组织培养 33 其它一些有激素生理活性的物质，如其它一些有激素生理活性的物质，如：甾类、多胺类、水杨酸类等 五类植物激素五类植物激素 赤霉素：赤霉素：属于二萜类酸，由四环骨架衍生而得。赤霉素种类至少38种，广泛 应用于农业生产。可刺激叶和芽的生长，提高产量。最突出的生理效应是促进 茎的伸长和诱导长日植物在短日条件下抽薹开花。遗传上矮生的植物对赤霉素 最敏感。 34 （4）常见培养基 o MS培养基：1962年穆拉辛格和斯库格
17、为 烟草细胞培养而设计，其中硝酸盐的浓度 高，适合植物原生质体、细胞和组织培养。 o B5培养基：1968年甘伯尔格为大豆细胞 培养而设计，铵的浓度低，适合木本植物 的组织和细胞培养。 35 培养基培养基分类分类 o 富盐平衡培养基富盐平衡培养基 是目前使用最广泛的一类，代表性的培养基有 MS、LS、BL、BM、ER等。特点是：无机盐浓度高，微量元素种 类齐全，浓度高；元素间比例适当，离子平衡性好，具有较强的 缓冲能力、稳定性好、营养丰富，一般培养时无需再加入有机成 分。 o 高硝态氮培养基高硝态氮培养基 代表性培养基有B5、N6、SH。特点是：硝酸钾 浓度高，氨态氮浓度低，含有较高浓度的硫胺
18、素（VB1）。 o 中盐培养基中盐培养基 代表性培养基有Nitsch、Miller、Blaydes、H。大多是 在MS培养基基础上进行改良设计。特点是：大量元素无机盐为MS 的一半，微量元素种类减少、含量增高。维生素种类比MS增多， 例如增加了生物素、叶酸等。 o 低盐培养基低盐培养基 代表性培养基有 White、WS、HE、HB。特点是：无 机盐、有机成分含量浓度低，多用作生根培养的培养基。 36 37 与微生物培养基的区别? o 组分复杂，价钱昂贵 o 需要大量无机盐 o 多种维生素和激素维生素和激素 o 一般采用无机氮源 o 一般以蔗糖为碳源 38 4 植物组织培养再生植株的途径植物组织
19、培养再生植株的途径 o 两条途径完成： o 一是器官发生途径一是器官发生途径：成熟细胞愈伤组织出根出芽出根出芽完 整植株。 o 二是体细胞胚发生途径二是体细胞胚发生途径：成熟细胞分生细胞胚状体胚状体 完整植株。 39 （1）器官发生途径 o 植物的器官发生是指离体培养的组织或细胞 团（愈伤组织）分化形成不定根、不定芽等 器官的过程。 o 在自然界，许多植物的无性繁殖（如插条、 嫁接等）属于器官发生途径的发育方式。 40 过程： o （1）启动期：启动诱导外植体细胞脱分化和分裂。 n 用于培养的植物组织多是由已经分化成熟的细胞组成，这 些细胞大部分已经丧失分裂能力。由这些细胞诱导产生愈 伤组织必
20、须首先使这些细胞恢复分裂能力，变成分生性细 胞。 n 主要通过向培养基中添加一定浓度、种类和比例的外源激 素刺激外植体细胞改变原来的代谢途径来诱导细胞活化， 重新获得分裂能力，需要选择合适的较高浓度的生长素诱 导剂（如NAA、IAA、2，4-D等）或细胞分裂素启动诱导 外植体细胞脱分化和分裂。 41 o （2）愈伤组织诱导：即细胞开始分裂并不断增生子 细胞的过程。 n这个阶段一般需要降低激素浓度，有些情况下甚至不需要 生长素和分裂素。外植体外层细胞开始分裂并脱分化。质 量好的愈伤组织多呈淡黄（绿）色或无色、疏密适中。 o （3）拟分生组织的形成：将愈伤组织转移到有利于 有序生长的条件下培养，细
21、胞内部开始发生一系列 形态和生理变化，分化出形态和功能不同的细胞。 n此时，表层细胞分裂减慢，内部的局部细胞也开始分裂。 在若干部位出现类似形成层的细胞群，通常称为“生长中 心”，又可称为“拟分生组织”，该过程是器官发生的一个转 变时期。 42 o （4）器官原基和器官的形成：拟分生组织 形成后，一些细胞分化成为管状细胞，进 而形成维管组织，形成不同的器官原基， 进一步分化出相应的组织和器官。 o 大多数情况下，植物再生过程中器官的发 生是通过提供适宜的植物激素来实现的。 43 植物愈伤组织培养的基本过程植物愈伤组织培养的基本过程 o 愈伤组织的 形成 o 愈伤组织的 生长 o 愈伤组织的 分
22、化与形态 的发生 o 此为概念流程图，图片非关联 44 45 （2） 体细胞胚发生途径体细胞胚发生途径 o 体细胞胚体细胞胚（Somatic embryo）又叫胚 状体，是指离体培养条件下没有经 过受精过程而形成的胚胎类似物。 o 体细胞胚发生途径是指体细胞在离 体培养过程中经过了胚胎发育过程。 体细胞胚起源于非合子细胞，因此 不同于合子胚。 o 离体培养条件下体细胞胚的发生最 早是在胡萝卜中发现的，经过胚状经过胚状 体形成、心形期、鱼雷期、子叶期、体形成、心形期、鱼雷期、子叶期、 幼苗幼苗几个阶段 . 46 胡萝卜体细胞胚发生胡萝卜体细胞胚发生 A 器官外植体直接发生途径器官外植体直接发生途
23、径 B 悬浮培养细胞发生途径悬浮培养细胞发生途径 C 愈伤组织发生途径愈伤组织发生途径 47 A 器官外植体直接发生途径器官外植体直接发生途径 o 属于离体培养条件下体细胞胚发生 的直接途径。茎表皮、叶、子叶、 下胚轴等外植体分化细胞经过脱分 化后均可以产生胚状体。 o 以叶片为外植体直接形成体细胞胚外植体直接形成体细胞胚 为例，一般经过2个阶段：（1）诱 导期。叶片表皮细胞或亚表皮细胞 感受刺激后进入分裂状态，形成小 的瘤状突起瘤状突起；（2）胚胎发育期。 瘤状物继续发育，经过球形胚、心 形胚等阶段最后形成体细胞胚 48 o B 悬浮培养细胞发生途径悬浮培养细胞发生途径： 在悬浮培养的细胞中
24、一些细胞 可以产生胚性细胞团，一个胚性细胞团胚性细胞团可以发育成一个胚 状体，也可以产生多个胚状体。这种方式可以得到大量的 胚状体。 o C 愈伤组织发生途径愈伤组织发生途径：是胚状体发生常见的形式。愈伤组愈伤组 织织内部或表面细胞均可以产生胚状体。这种途径包括三个 阶段：第一阶段，诱导外植体形成愈伤组织；第二阶段， 诱导愈伤组织胚性化；第三阶段，体细胞胚形成。 49 5 植物组织培养的问题分析植物组织培养的问题分析 o（1）玻璃化问题玻璃化问题：植物组织培养中，常会出 现一些半透明状的畸形试管植物半透明状的畸形试管植物，这类植物 体被称为“玻璃苗”，这种现象称为玻璃化玻璃化 （Vitrifi
25、cation）现象，又称过度水化现象。 o 由于玻璃苗的组织结构和生理功能异常，因此 分化能力低分化能力低，难以增殖成芽，也难以生根成苗， 移栽大田更难成活，已成为组培的一大问题。 o 组织培养过程中试管苗的玻璃化现象主要是适 应性的生理问题，是不能很好适应培养基和培 养环境的结果。 50 o （2）褐变问题褐变问题 o 褐变褐变（Browning）可分为酶促褐变和非酶促褐变， 主要是酶促褐变。酶促褐变是由多酚氧化酶 (Polyphenol oxidase, PPO)引起的。 o 当外值体处于机械损伤等逆境时，细胞膜的结构遭 到破坏，酚酶催化多酚类化合物，使其发生氧化形 成棕褐色的醌类物质和水
26、；醌类物质经过非酶促聚 合，形成黑褐色物质(羟醌与黑色素等)，引起褐变 的发生。 51 （3）微生物污染微生物污染 o 造成污染的病原菌主要包括外部污染菌和内源菌。微生物污 染主要由外植体带菌或培养基灭菌不彻底以及操作人员操作 不慎造成。外植体带菌引起的污染与外植体的种类、取材季 节、部位、预处理及消毒方法等密切相关。 o 应该严格按照无菌操作，取材时应选择嫩梢、新芽或胚作为 外植体材料，对外植体进行彻底消毒。针对内源菌污染，有 可以采取以下防治措施：（1）改进外植体消毒方法。结合 常规的消毒方法，采用间隙消毒法。即经过一般的消毒过程 后，把外植体放在不含激素和维生素的培养基中，培养一段 时间
27、后取出，再消毒1次；（2）反复检查培养物。在初代培 养成功后要反复检查，不要急于扩大繁殖；（3）使用抗生 素。 52 （4）品种限制）品种限制 o 一些植物很容易通过组织 培养进行无性繁殖：无心 插柳柳成荫。目前被子植 物组织培养成功的比较多。 o 裸子植物组织培养成功的 比较少。很难脱分化诱导 成具有全能性的细胞。 53 三、 人工种子 （artificial seed） 体细胞胚再生途径的应用：体细胞胚再生途径的应用： 54 1、定义 o 人工种子人工种子（ Artificial seed）又称合成种子合成种子(Synthetic seed)或体细胞体细胞 种子种子(Somatic see
28、d)，是指将植物离体培养中产生的胚状体或芽包裹 在含有养分和保护功能的人工胚乳(Artificial endosperm)和人工种皮 (Artificial seed coat)中形成的类似种子的颗粒。 o 结构上从外向里包括三部分，与天然种子具有类似的结构：（1） 人工种皮外层，保护胚状体中的水分免于丧失和防止外部力量冲击； （2）人工胚乳，含有必需的营养成分和某些植物激素；（3）胚状 体或芽。 1978年在第四届国际植物组织培养大会上年在第四届国际植物组织培养大会上 首次提出研制人工种子的设想首次提出研制人工种子的设想 55 2 优点 o 便于运输和储藏。 o 人工胚乳可根据不同植物的要求
29、配制，通过 加入植物激素、有益微生物或抗病、抗虫成 分，使人工种子优越于天然种子。 o 可以固定杂种优势，加速良种繁育。 o 可作为植物基因工程和遗传工程的载体。 o 可保存珍贵稀有植物品种。 o 利于快速繁殖，生产效率高。 56 3 关键技术问题 o （1）胚状体同步发育胚状体同步发育 o高质量和高数量的胚状体是大量制备人工种子的基础。控制胚状体发育的 同步化是人工种子制备的核心之一，主要方法如下： n抑制剂法抑制剂法 在细胞培养初期加入细胞分裂抑制剂（如5-氨基尿嘧啶）， 一旦去除抑制剂后细胞可以同步发育。 n低温法低温法 低温处理抑制细胞分裂，再恢复正常温度可以使细胞分裂同步 化。 n渗
30、透压法渗透压法 不同发育时期的胚状体对渗透压的要求不同，用一定的渗透 压使胚状体停止在某一阶段，然后再使其同步发育。 n通气法通气法 细胞分裂旺盛时有大量气体（如乙烯等）生成。可以通过在培 养基中通入乙烯或氮气控制细胞同步分裂。 n分离筛选法分离筛选法 用不同孔径的筛网将不同发育时期的胚状体分离开来，也 可以采用密度梯度离心法来选择不同发育期的胚状体。 57 （2）人工种皮制作人工种皮制作 o 理想的人工种皮人工种皮(Artifical seed coat)应该具有保 护胚状体的功能，并且具有无毒、良好的通气 性、抗污染、适合运输等特点。 o 最早采用的材料是最早采用的材料是聚氧乙烯聚氧乙烯，
31、但是具有一定毒 性、易溶解于水等不足。 o 目前采用海藻酸盐海藻酸盐较多，其具有成胶容易、操 作条件温和、使用方便、毒性低、成本低廉等 优点。但是也存在一些缺点，例如：水性营养 成分易流失、表面易结团等。因此，开发理想开发理想 的人工种皮材料仍是一个重要课题。的人工种皮材料仍是一个重要课题。 58 （3）人工胚乳配制人工胚乳配制 o 胚乳是胚胎发育的营养保证。人工胚乳人工胚乳 (Artifical endosperm)主要包括无机盐、碳水 化合物、蛋白质等。 o 由于糖等物质的存在易导致微生物污染，所 以还要加入防腐剂、抗菌素、农药等成分。 o 人工胚乳可以直接加在人工种子的凝胶囊中 缓慢释放
32、。 59 （4） 包埋包埋技术技术 o 包埋是人工种子制作的重要一环。方法主要有以下 两种： o 干燥法干燥法 这是比较早的一种包埋方法。将胚状体置 于23、70%左右相对湿度、黑暗条件下逐渐干燥， 然后用聚氧乙烯等种皮材料包裹。 o 水凝胶法水凝胶法 这是目前比较常用的一种方法。用海藻 酸钠等水溶性凝胶与Ca2+进行离子交换后凝固的特 点包埋单个胚状体或芽。种子硬度由凝胶浓度与络 合时间控制。 60 海藻酸钠包埋 o 包埋液（人工胚乳）制 备： 2%-3%的海藻酸钠 +营养物、生长因子等 o 将成熟的健康的体细胞 胚胎与包被液相混合， 然后将其滴入适当浓度 的氯化钙溶液中，经过 胶复合作用的
33、造形过程， 在20-30分钟内形成内含 细胞胚、有一定硬度的 雏形人工种子。 视频：视频： http:/ 61 （5）贮藏与发芽 o 一般将人工种子人工种子贮藏在47低温、相对湿 度小于67%的条件下。 o 随贮藏时间的延长,人工种子人工种子的萌发率会显著 下降。 62 4 存在存在的的问题问题 o 人工种皮性能不尽人意； o 还没有一种符合多数植物胚状体需要的人工 胚乳； o 胚状体储藏阶段的休眠控制； o 如何保证长期储藏而又不影响萌发率； o 制作流程较繁琐、成本高。 o 许多植物还不能成功地诱导出高质量体细胞 胚。 63 人工种子应用举例 一品红又名圣诞花，是在元旦和圣诞节前夕观赏的
34、一种著名盆栽花卉，属大朗科，常绿溜木。此花原 产墨西哥及中美，现我国各地都有栽培。 64 1球形胚 2心形胚 3犁形胚 4子叶期胚 5人工种子 6人工种子萌发 65 本章小结 o 组织培养、人工种子。 o 要点： n 1.植物组织培养的理论基础是什么？ n 2.植物经组织培养的再生途径有哪两种？ n 3.激素在细胞分化中是如何调节器官分化的？ o 实践： n 了解组培应用与市场新颖产品新颖产品： 手指花卉、植物宠物手指花卉、植物宠物 http:/ P5DO41 66 课后作业： o 1. 自学：植物胚胎培养、植物脱毒技术 o 2. 结合应用举例结合应用举例，理解植物组织培养和人工 种子的技术原
35、理和操作过程。 o 3.视频：了解植物组织培养的相关实验操作 o http:/ 67 下节内容 o动物人工繁殖 o 预习思考题： o 体外受精动物与核移植动物相比各自有 什么优缺点？ 68 问题与讨论问题与讨论 69 植物组织培养再生植物的应用举例植物组织培养再生植物的应用举例1 70 培养技术 o 总路线：以寒兰种子萌发后形成的根状茎 为外植体，对类原球茎诱导、增殖、分化。 o 1.材料：以寒兰种子萌发后形成的根状茎 为外植体。 71 o NAA（萘乙酸）：生长素 o 6-BA（6-苄基腺嘌呤）：分裂素 o 3-3307(优康唑)：生长调节剂（促进分蘖、 抑制细胞伸长，矮化植物） o suc
36、rose（蔗糖） 72 73 74 75 76 例例2 海带愈伤组织培养海带愈伤组织培养 o 选择合适的 外植体 叶状体下部 细胞。 o 无菌处理 洗净、酒 精消毒。 o 诱导愈伤组 织培养。 77 叶状体下部组织1 切割外植体 2 切割并洗净 3 酒精消毒 4 火焰消毒 5 切成小片 6-7 琼脂培养基培 养 8 液体培养基培养 78 海带幼叶1幼叶选择 2 外植体固体培养基培养 3 外植体生长 4 液体培养基培养 5 6愈伤组织形成 7-8 新植株形成 79 80 虽然海藻组织培养成果显著,但是仍然存在许多尚未解 决的问题。海藻的愈伤组织由于诱导率低、生长缓慢 及分化困难,很难像高等植物一
37、样大规模用于养殖育苗 和次生代谢产物的生产。 81 例例3：人工种子应用举例：人工种子应用举例 一品红又名圣诞花，是在元旦和圣诞节前夕观赏的 一种著名盆栽花卉，属大朗科，常绿溜木。此花原 产墨西哥及中美，现我国各地都有栽培。 82 一品红人工种子制作 o 一品红正常繁殖速度慢。 o 目前多以叶片、茎段为外植体诱导愈伤组织，在分 步诱导芽湖根，生成苗。器官发生途径。 o 这里以苞片为外植体，离体诱导体细胞胚，制作人 工种子。体细胞胚具有双极性（一端为芽端、一端 为根端），可以简化步骤。体细胞胚途径。 o 注意不同生长素/分裂素比例对于体细胞胚诱导的影 响。 n2，4-D：2，4-二氯苯氧乙酸（生
38、长素） n6-BA： 6-苄基腺嘌呤（分裂素）。 83 第一步 愈伤组织诱导 2，4-D/6-BA：比例较高时有利 84 第二步：体细胞胚诱导 降低生长素2，4-D浓度；活性炭 85 第三步：包埋与萌发 海藻酸钠法 86 1球形胚 2心形胚 3犁形胚 4子叶期胚 5人工种子 6人工种子萌发 87 第3讲 动物人工繁殖 88 为什么要进行动物人工繁殖？ o 上海世博会：2010年3月底10只大熊 猫将从中国保护大熊猫研究中心雅安碧峰 峡基地启程前往上海，在上海旅居一年， 为世博会助兴添彩。 o 大熊猫是我国的国宝，是国家一级保 护动物，系濒危物种。 o 野外大熊猫到了圈养环境中繁殖率非 常低，7
39、8%的雌性大熊猫不孕。 o 长期以来圈养大熊猫90%的雄性大熊 猫不育。我国20世纪末实行了大熊猫人工 繁殖计划。 89 人类生殖秘密 o 人类：世界范围内不孕夫妇占10左右，需 要建立人工助孕技术。 o 解决方案：体外受精婴儿（试管婴儿） o 2012.02.28自然-医学：美科学家从成年女性身上获取 的干细胞在实验室中可以自发生成新的卵子，有望治疗 不孕 o 2014.12.24细胞：英国剑桥和以色列团队合作率先实 现完全体外培养出成熟精子和卵子细胞。首次将皮肤细 胞完全在体外诱导成为诱导干细胞，并使其分化成人类 原始生殖细胞，同时发现了体外培养诱导的关键基因 SOX17基因。 90 本节
40、主要内容： o 1-体外受精动物（试管动物、试管婴儿） o 2-核移植动物（克隆动物） o 本节关键问题： o 1-体外受精动物的培育：精子获能与卵细胞成熟培 养、体外受精方法、性别控制的原理与方法 o 2-核移植动物的培育：核移植、重组胚的激活 91 动物人工繁殖的技术方法 第一部分 体外受精动物 93 概念 o 体外受精(In vitro fertilization，IVF)是指将哺 乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境 中完成受精过程的技术。 o 体外受精动物也称试管动物（test-tube animal），是指将供体的精子和卵子在体外 受精，体外培养胚胎发育到一定阶段通过胚 胎移植移
41、入受体完成发育出生的动物。 o 体外体外受受精与人工精与人工授授精的区别？精的区别？ 94 世界上首批试管动物 o 1951年，美籍华人张明觉和澳大利亚人Austin同时 发现了哺乳动物的精子获能精子获能现象，这一领域的研究 才获得突破性进展。 o 1959年，张明觉以家兔为实验材料，从一只交配后 12h的母兔子宫中冲取精子(即体内获能的精子)，从 另外两只超数排卵处理母兔的输卵管中收集卵子， 精子和卵子在体外人工配制的溶液中完成受精过程， 然后，正常卵裂的36枚胚胎被移植到6只受体的输 卵管中，其中4只妊娠，并产下15只健康仔兔，这 是世界上首批试管动物，它们的正常发育标志着体 外受精技术的
42、建立。 95 优点 96 知识回顾：生殖与发育 97 o 受精1天后才开始卵裂。 o 8细胞之前，分裂球之间结合 比较松散。 o 形成致密的球体16细胞期， 内部1-2个细胞属于内细胞团， 将来发育为胚胎，而其外周 细胞变为滋养细胞。 o 动物的胚胎在64细胞以前为 实心体，称为桑椹胚。 o 继续分裂成由100多个细胞组 成的早期胚泡。细胞团内部 空隙扩大，成为充满液体的 囊胚腔（Blastocele），此时 的胚胎称为囊胚。囊胚的大 小仍和受精卵相似，但细胞 已经增殖到上千个。 98 试管动物（婴儿）培育流程 o 精子采集与体外获能、卵子采集与成熟培养。 o 体外受精。 o 胚胎体外培养。
43、o 胚胎移植。 n 胚胎移植(Embryo transfer，ET)：是指将受精卵或发育到 一定阶段的胚胎移植到与供体同时发情排卵、但未经配种 的“受体” 输卵管或子宫的技术。 o 体内发育、出生。 视频视频: 试管婴儿体外受精全部过程试管婴儿体外受精全部过程 视频：视频：体外受精婴儿体外受精婴儿 99 1 精子的采集与体外获能处理 o 精子上游法采集：在精液上面加入少量培养 液，有活力的精子游到表面，收集。 o 精子获能(Capacitation)是指精子获得穿透卵 子透明带能力的过程。 o 精子的顶起反应：遇到卵子时，精子头部 “顶体”脱落，顶体酶释放，使卵子的放射 冠和透明带溶解，精子进
44、入卵细胞，达到受 精的目的。 100 顶体酶 顶体酶存在于精子顶体内膜及赤道部膜上，通常以无活性形式 存在，当精子头部进入卵透明带时，顶体酶原才被激活为顶体 酶。 此酶是受精过程中不可缺少的一种中性蛋白水解酶中性蛋白水解酶，其作用类 似于胰蛋白酶，它能水解卵透明带糖蛋白，使精子穿过卵丘再 穿过透明带，使精子与卵子融合;它还能促使生殖道中激肽释放， 从而增强精子的活力和促进精子的运动。 顶体酶正常值：顶体酶正常值：(36.7221.43)U/L (BAEE-ADH法， N-benzoy L-arginine sthyl esteralcohol dehydrogenase)。 顶体酶临床意义：顶
45、体酶临床意义：顶体酶活力不足可导致男性不育。因此精子 顶体酶活性测定可作为精子受精能力和诊断男性不育症的参考 指标。 101 自然受精过程中的获能 体内获能 o 睾丸内的精子不具备受精能力，还需在附睾 内经历精子成熟过程，获得受精能力。 o 雄性精液中含有“去能因子去能因子”（多是：糖蛋 白），附在精子表面，是顶体酶的抑制剂， 抑制了受精能力。 o 去能因子的清除去能因子的清除主要依靠宫颈、子宫及输卵 管液中的淀粉酶、胰蛋白酶、葡糖苷酶及 唾液酸酶，后者在卵泡液中含量也很高。可 以水解糖蛋白等“去能因子”，使精子顶体 酶活性恢复，具有受精能力。 102 103 体外获能 o 20世纪60年代初
46、至20世纪80年代中期，人们以家兔、小鼠 和大鼠等为实验材料，进行了大量基础研究，在精子获能精子获能 机理和获能方法方法方面取得很大进展。 o 精子由最初在同种或异种雌性生殖道孵育获能，发展到用 子宫液、卵泡液、子宫内膜提取液或血清等在体外培养获 能 o 最后用化学成分明确的溶液培养获能。诱导获能的药物常 用肝素和钙离子载体。 n 1986年Parrish等用含肝素的介质处理牛的冷冻精液，然 后与体外成熟的卵母细胞体外受精获得成功。 104 2 卵子的回收与成熟培养 o 2-1 卵母细胞的获得 n1)超数排卵：雌性动物用促卵泡素和促黄体素促卵泡素和促黄体素处理后， 从输卵管中冲取成熟卵子可直接
47、与获能精子受精。 n2)从活体卵巢中采集卵母细胞：借助超声波探测仪、内 窥镜或腹腔镜直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。 105 2-2 卵母细胞的选择 o 采集的卵母细胞绝大部分与卵丘细胞形成卵丘 卵母细胞复合体（cumulus oocyte complesx COC）。 o 无论采用何种方法方法采集的COC都要求卵母细胞 形态规则，细胞质均匀，外围有多层卵丘细胞 紧密包围。 o 在体外受精研究中，常把未成熟卵母细胞分为 A、B、C和D四个等级。 106 未成熟卵母细胞分级 o A级卵母细胞要求有三层以上 卵丘细胞紧密包围，细胞质均 匀； o B级要求卵母细胞质均匀，卵 丘细胞层低于三层或部
48、分包围 卵母细胞； o C级为没有卵丘细胞包围的裸 露卵母细胞； o D级是死亡或退化的卵母细胞。 o 在体外受精实践中，一般只培 养A级和B级卵母细胞。 107 2-3 卵母细胞的成熟培养 o 由超数排卵采集的卵母细胞已在体内发育成熟，不 需培养可直接与精子受精，对未成熟卵母细胞（初 级卵母细胞、次级卵母细胞）需要在体外培养成熟。 o 家畜卵母细胞成熟培养液普遍采用TCM199培养基 添加孕牛血清、促性腺激素、雌激素和抗生素成份。 血清是大分子营养物质的主要来源，而且可提供细 胞生长因子。作为能量来源的物质主要是葡萄糖， 氨基酸也可作为能源起作用。 o 卵母细胞的体外培养还需对温度、渗透压、
49、pH、气 相等进行控制。 108 卵母细胞体外培养 o 卵母细胞体外培养：通常采用微 滴培养法，微滴体积一般为50- 200微升，每个微滴中一般放入 10-40个卵母细胞。二氧化碳培养 箱培养，条件为39、100%湿度、 5%二氧化碳。 o 成熟标志成熟标志：极体排出极体排出、透明带软 化、卵丘细胞层扩散靠近卵母细 胞周围的卵丘细胞呈放射状排列， 出现放射冠，用DNA特异性染料 染色后，在显微镜下进行核相观 察，可见卵母细胞处于第2次成熟 分裂中期。 109 3 试管动物的体外受精 o 精子发生顶体反应时，精子顶体外膜与其相 贴的卵细胞膜发生多点融合而破裂，继而出 现小孔。 o 顶体酶顶体酶就
50、是通过这些小孔释放出去，使卵细 胞周围的卵丘细胞分散并去除放射冠，分解 透明带。 o 精子顶体内膜与卵细胞膜相互融合，最终雄 性原核和雌性原核合二为一，完成受精过程。 110 3-1 共同培养：共同培养：一般将成熟的卵母细胞和获 能的精子在一个合适的体外环境条件下共 同培养一段时间，就能完成体外受精。 受精过程所采用的培养液与动物细胞培养 用培养液类似，但需添加一些特殊物质， 如肾上腺素、亚牛黄酸、肝素等，它们有 助于精子穿卵和促使原核的形成。 精子和卵子常在小滴中共培养，受精时精 子密度为1-9106/ml，每10微升精液中放 人1-2枚卵子，小滴体积一般为50-200微升。 受精成功观察：
