1、第 1页，共 9页选修一选修一生物技术实践生物技术实践课题课题 1 1果酒和果醋的制作果酒和果醋的制作1.果酒制作菌种是酵母菌，是一种单细胞真菌，真核生物，代谢类型为异养兼性厌氧型，适宜条件下进行出芽生殖。 酵母菌在有氧条件下进行有氧呼吸大量繁殖， 无氧条件下进行酒精发酵产生酒精。（1）有氧呼吸反应式：C6H12O6+6O2+6H2O6CO2+12H2O+能量（2）无氧呼吸反应式：C6H12O62CO2+C2H5OH+少量能量 (制酒原理：酵母菌无氧呼吸将葡萄糖转化为酒精)2.果醋制作菌种是醋酸菌，原核生物，代谢类型为异养需氧型，以二分裂方式增殖。原理如下：（1）当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将
2、果汁中的糖分解成醋酸。反应式：C6H12O6+2O22CH3COOH+2CO2+2H2O（2）当氧气充足，缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再变为醋酸。反应式：C2H5OH+O2CH3COOH+H2O3.葡萄酒的自然发酵， 菌种来自附着在葡萄皮上的野生型酵母菌； 工业酿酒可在无菌条件下人工接种酵母菌菌种。4.葡萄酒呈现深红色的原因：在发酵过程中，红葡萄皮的色素进入发酵液中，使葡萄酒呈现深红色。5.在传统酿酒过程中，一般不需要严格的灭菌过程，是因为在缺氧、呈酸性的发酵液中，酵母菌可以生长繁殖，绝大多数其他微生物无法适应而受到抑制。6.果酒制作中，酒精含量达一定程度后不变，CO2也不产生，原因可能
3、是原料耗尽或高浓度的酒精抑制了酵母菌细胞呼吸。7.喝剩的果酒放置一段时间后会变酸，原因是醋酸菌在有氧条件下把酒精变为醋酸。8.制作果醋时， 变酸的酒表面常常有一层白色菌膜， 这层白色菌膜是醋酸菌大量繁殖形成的。9.果酒和果醋制作流程：挑选葡萄冲洗榨汁酒精发酵(果酒)醋酸发酵(果醋)（1）新鲜的葡萄应先冲洗再去梗。若先去梗再冲洗，会造成汁液流失和杂菌污染。（2）冲洗的目的是洗去浮尘，但不能反复冲洗，以防止菌种流失。（3）葡萄汁装入发酵瓶，要留约 1/3 的空间，目的是让酵母菌有氧呼吸大量繁殖，防止发酵液溢出。（4）果酒制作温度控制在 1825，时间为 1012d；果醋制作温度控制在 3035，时
4、间为 78d。（5）果酒制作前期需氧后期不需氧，果醋制作一直需氧。10.果酒和果醋制作的发酵装置（见右图）（1）充气口：在酒精发酵时应关闭；在醋酸发酵时连接充气泵泵入无菌空气。（2）排气口：酒精发酵时排出酵母菌产生的 CO2；醋酸发酵时排出剩余的空气、CO2。（3）出料口：取样、监测。（4）排气口连接长而弯曲的胶管目的是防止空气中微生物的污染。注：若使用带盖的瓶子制果酒果醋：在发酵过程中，每隔 12h 左右将瓶盖拧松一次，以放出 CO2，此后再将瓶盖拧紧。当发酵产生酒精后，再将瓶盖打开，盖上一层纱布，进行制果醋的发酵。11.酒精检测：在酸性条件下，橙色的重铬酸钾与酒精反应呈灰绿色。第 2页，共
5、 9页12.检验步骤： 先在试管中加入发酵液 2mL 再滴入物质的量浓度为 3mol/L 的 H2SO4溶液 3 滴，震荡均匀，最后滴加常温下饱和的重铬酸钾溶液 3 滴，震荡试管，观察颜色的变化。果醋的检测：可通过嗅味和品尝进行初步鉴定，再通过检测和比较醋酸发酵后的 PH 做进一步的鉴定。课题课题 3 3制作泡菜并检测亚硝酸盐含量制作泡菜并检测亚硝酸盐含量1.泡菜制作的菌种是乳酸菌，来自蔬菜表面。常见乳酸菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌，其中乳酸杆菌常用于生产酸奶。2.乳酸菌属于原核生物，代谢类型为异养厌氧型，以二分裂方式增殖。3.泡菜制作原理：乳酸菌在无氧条件下进行乳酸发酵，将葡萄糖分解成乳酸。反应
6、式：C6H12O62C3H6O3少量能量4.含有抗生素的牛奶不能发酵成酸奶， 是因为酸奶的制作依靠的是乳酸菌的发酵作用， 而抗生素能够杀死或抑制乳酸菌的生长，因此含有抗生素的牛奶不能发酵成酸奶。5.泡菜坛的选择应选用火候好、无裂纹、无砂眼、坛沿深、盖子吻合好的泡菜坛。不合格的泡菜坛容易引起蔬菜腐烂。检查时，可将坛口向上压入水中，看坛内有无渗水现象。也可使用玻璃制作的泡菜坛。选用的蔬菜要新鲜，否则蔬菜中的硝酸盐易被大量还原为亚硝酸盐。亚硝酸盐为白色粉末，易溶于水，在食品生产中用作食品添加剂。自然界中，亚硝酸盐分布广泛。据统计，蔬菜中亚硝酸盐的平均含量约为 4mg/kg,咸菜中亚硝酸盐的平均含量在
7、7mg/kg 以上， 而豆粉中的平均含量可达 10mg/kg。 膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康，但是，当人体摄人的亚硝酸盐总量达到 0.30.5g 时，会引起中毒;当摄人总量达到 3g 时，会引起死亡。我国卫生标准规定，亚硝酸盐的残留量在肉制品中不得超过 30mg/kg，酱腌菜中不超过20mg/kg，而婴儿奶粉中不得超过 2mg/kg。膳食中的绝大部分亚硝酸盐在人体内以“过客”形式随尿排出，只有在特定的条件下(如适宜的 pH、温度和一定的微生物作用)，才会转变成致癌物亚硝胺。6.制作流程配制盐水：清水与盐的质量比为 10:1，盐水要煮沸冷却。煮沸的目的是杀菌除氧，冷却是为了保证乳酸菌等微
8、生物的生命活动不受影响。盐有杀菌、渗出蔬菜中过多的水分以及调味的作用。盐水浓度不能太高，因为盐水浓度太高会引起乳酸菌细胞渗透失水，影响乳酸菌生长繁殖，甚至导致乳酸菌死亡。7.在冷却后的盐水中加入少量“陈菜泡液”，目的是增加乳酸菌数量，缩短泡菜制作时间。8.加入调味料后要装坛密封(坛盖边沿水槽注水)，目的是创造无氧条件，利于乳酸菌发酵。9.泡菜中亚硝酸盐的含量与腌制时间、 腌制温度和食盐用量有关。 温度过高、 食盐用量过低、腌制时间过短，易造成细菌大量繁殖，使亚硝酸盐含量增加。一般在腌制 10d 后，亚硝酸盐的含量开始下降。10.亚硝酸盐含量的测定（1）方法：比色法。第 3页，共 9页（2）原理
9、：在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与 N-1-萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料。 将显色反应后的样品与已知浓度的标准显色液进行目测比较，可以大致估算出泡菜中亚硝酸盐的含量。（3）步骤：配制溶液制备标准显色液制备样品处理液比色。观察样品颜色的变化，并与标准显色液比较，找出标准液最相近的颜色，记录对应的亚硝酸钠含量，并按照下面的公式进行计算估算出亚硝酸盐的含量。（4）结论分析：泡菜发酵可分为三个阶段:发酵初期，由于硝酸盐还原菌的活动，亚硝酸盐含量有所增加。发酵中期:由于硝酸盐还原菌受抑制;同时形成的亚硝酸盐又被分解， 因而亚硝酸盐含量下降。发酵后期，硝酸盐还原菌完全受
10、抑制因而亚硝酸盐含量继续下降 。（5）发酵过程中应定期测定亚硝酸盐的含量，原因是发酵不同时期亚硝酸盐含量会发生变化，及时测定是为了把握取食泡菜的最佳时机。泡菜腌制过程中，亚硝酸盐的含量先增加后减少，最后稳定在较低水平。11.从开始制作到泡菜质量最佳这段时间，泡菜液逐渐变酸，这段时间内泡菜坛中乳酸菌数量增加，杂菌数量减少，原因是乳酸菌比杂菌更耐酸。12.各种试剂的作用：对氨基苯磺酸：与亚硝酸盐发生重氮化反应盐酸：营造酸性环境N-1-萘基乙二胺盐酸盐： 与重氮化反应的产物结合生成玫瑰红色染料， 作为测定亚硝酸盐的指示剂硅胶：干燥剂，用于干燥亚硝酸盐干燥后的亚硝酸钠：制备相应浓度的标准比色液氯化镉、
11、氯化钡：溶于蒸馏水后作为亚硝酸盐的提取剂氢氧化钠：中和过多的盐酸，营造碱性环境氢氧化铝：作为吸附剂吸附色素，使泡菜滤液脱色，变澄清13.自然发酵过程的白毛和白膜总结：喝剩啤酒放置一段时间、 醋坛子的表面都会长出一层白膜， 这层白膜是醋酸杆菌大量繁殖形成的。豆腐上生长的白毛是毛霉的白色菌丝。泡菜汤内发酵液表面有时会长一层白膜这层白膜是由于产膜酵母的繁殖而形成的。专题专题 2 2微生物的培养与应用微生物的培养与应用课题课题 1 1微生物的实验室培养微生物的实验室培养1.培养基指人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长发育繁殖的营养基质。（1）培养基按物理性质分为液体培养基和固体培养基，区
12、别是固体培养基中加入了凝固剂琼脂；琼脂是一种从红藻中提取的多糖。琼脂在 98以上熔化，在 44以下凝固，在常规培养条件下呈现固态。 微生物可在固体培养基表面形成肉眼可见的菌落， 固体培养基可用于微生物的分离、 鉴定、 活菌计数和保藏菌种。 液体培养基可用于细菌的选择培养、 扩大培养、富聚培养，目的是增加目的菌的数量。（2）培养基按用途分为选择培养基和鉴别培养基。第 4页，共 9页2.各种培养基的具体配方不同，但一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。另外，培养基还需要满足微生物生长对 pH、特殊营养物质以及氧气的要求。如培养细菌(如乳酸菌)时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌(真菌)时需将培养基的
13、pH调至酸性， 培养细菌时需将 pH 调至中性或微碱性， 培养厌氧微生物时则需要提供无氧的条件。牛肉膏和蛋白胨来源于动物原料，含有糖、维生素和有机氮等营养物质，蛋白胨提供的主要营养为碳源、氮源、维生素。牛肉膏提供的主要营养为碳源、氮源、磷酸盐、维生素。3.无菌技术的目的是获得纯净培养物，关键是创造无菌条件，防止外来杂菌的入侵。4.消毒和灭菌（1）消毒：用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物，不包括芽孢和孢子。常用方法：煮沸消毒法；牛奶用巴氏消毒法，既杀死牛奶中微生物，又使牛奶中的营养成分不被破坏；用酒精擦拭双手、氯气消毒水源是化学药剂消毒法；接种室、接种箱或超净工作台用紫外线
14、消毒法。（2）灭菌：用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。常用方法：灼烧灭菌：在火焰的充分燃烧层灼烧，可迅速彻底的灭菌，如接种环、接种针、试管口、瓶口。干热灭菌：工具为干热灭菌箱，160170下加热 12h，适用范围：能耐高温、需要保持干燥的物品，如培养皿、试管、吸管等。高压蒸汽灭菌：工具为高压蒸汽灭菌锅，100kPa、121下维持 1530min（锅内盛适量水并煮沸），主要用于能耐高温的物品，如培养基、无菌水、移液管。此法能留住培养基的水分。（3）无菌技术操作（消毒和灭菌）主要包括以下几个方面：对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。将用于微生物培养的器皿、接
15、种用具和培养基等进行灭菌。为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行(因为酒精灯火焰附近存在着无菌区域)。实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外， 还能有效避免操作者自身被微生物感染。5.制备培养基的步骤：计算称量溶化(调节 pH)灭菌倒平板。（1）计算 注意:据配方计算配制一定体积培养基时各成分的用量。（2）称量 注意:牛肉膏较粘稠，应用玻棒挑取，在称量纸上称量。牛肉膏蛋白胨易吸潮，动作要迅速。称后要及时盖上瓶盖。（3）溶化 将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯，加入少量水，加热。当牛肉膏溶化并与称
16、量纸分离后，用玻璃棒取出称量纸。加入称量好的蛋白胨和氯化钠，用玻璃棒搅拌，使其溶解。加入琼脂，加热使其熔化。当琼脂完全融化后，补加蒸馏水至 100mL。溶化后调 PH，分装封口后灭菌。注意:溶化琼脂时要不断搅拌，防止琼脂糊底而导致烧杯破裂;加热过程中部分水分蒸发，待琼脂完全溶化后应补加蒸馏水，以保持溶液的浓度。溶化时将牛肉膏连同称量纸一起加热的目的可保证粘附在称量纸上的牛肉膏也能溶于水中,减少误差。第 5页，共 9页（4）调 pH 注意:由于不同微生物适宜的 pH 不同，因此在熔化后，必须用 NaOH 或 HCl 来调节 pH。在溶化后灭菌前调节 pH，若先灭菌后调 pH 易污染培养基。（5）
17、灭菌将 50ml 培养基用玻棒转移至锥形瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅，在压力为 100kPa、温度为 121，灭菌 1530min。将培养皿用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在 160170下灭菌 2h。在灭菌前, 用牛皮纸、旧报纸包紧盛有培养基的锥形瓶的目的是灭菌时能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞； 取出培养基锥形瓶时也能起到隔绝空气中杂菌污染的作用。注意:用高压蒸汽灭菌法;培养基先调 pH 再灭菌;一般是培养基先灭菌再倒平板。（6）倒平板 注意:待培养基冷却到 50左右时,瓶口要通过酒精灯火焰灭菌;培养基灭菌后，需要冷却到 50左右时，才能用来倒平板目的是温度过
18、高，太烫，不易操作；温度过低，培养基易凝固。平板冷凝后要将平板倒置，既可防止皿盖上凝结的水滴滴入培养基造成污染;又可避免培养基表面的水分过快挥发。6.微生物接种方法(分离纯化细菌方法)（1）接种微生物的方法很多。最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。微生物的接种技术还包括斜面接种、穿刺接种等方法。虽然这些技术的操作方法各不相同，但是，其核心都是要防止杂菌的污染，保证培养物的纯度。（2）平板划线法：通过接种环(工具)在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。 在数次划线后， 可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，即菌落。灼烧接种环目的：第一次灼烧：避
19、免接种环上可能存在的微生物污染培养物；以后每次划线前灼烧：杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使每次划线的菌种来自上次划线末端；划线结束灼烧：杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。灼烧次数划线次数1。在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线，以免接种环温度太高杀死菌种。每次从上一次划线的末端开始， 目的是将聚集的菌体逐步稀释分散到培养基表面， 以便得到单个菌落。用平板划线法接种划线某个平板培养后， 第一区域的划线上都不间断地长满了菌， 第二划线区域所划的第一条线上无菌落，其他环线有菌落。造成划线无菌落的原因：a.接种环未冷却。b.划线未从第一区域末端开始划线（第二区域的第一条
20、线未接到第一区域末端）。（3）稀释涂布平板法：用移液管(工具)和无菌水将菌液进行一系列的梯度稀释，然后用涂布器(工具)将不同稀释度的菌液分别均匀地涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。 在稀释度足够高的菌液里， 聚集在一起的微生物被分散成单个细胞， 从而能在培养基表面形成单个的菌落。在涂布平板时，滴加到培养基表面的菌悬液量不宜过多（0.1ml）的原因是培养基表面的菌菌悬液会出现积液，导致菌体堆积，影响分离效果。梯度稀释原因：培养液中菌体浓度高，直接培养很难分离得到单菌落；目的：将聚集的菌体分散开，以便获得单菌落。梯度稀释中，每次取样前需用手指轻压移液管橡皮头，吹吸三次，目的是使微生物和无菌水混合
21、均匀。涂布器浸在酒精中的主要目的是为涂布器的灼烧灭菌做准备； 为保证菌液均匀分布， 应在涂布时转动培养皿。第 6页，共 9页注：以上操作均在酒精灯火焰旁进行，防止杂菌污染。若要分离并统计活菌数，应选用稀释涂布平板法。平板划线法不能用于活菌计数的原因是菌落连成片，无法计数。7.菌种保藏：频繁使用的菌种用传代培养保藏法， 将菌种接种到试管的固体斜面培养基上在合适的温度下培养当菌落长成后将试管放入 4的冰箱中保藏，(4冷藏室)，但保存时间不长，因为菌种易被污染或产生变异；需长期保存的菌种用甘油管藏法(-20冷冻箱中保存)。课题课题 2 2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数土壤中分解尿素的细菌的分离与计
22、数1.在自然界寻找目的菌：要根据目的菌对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。2.选择培养基：允许特定种类的微生物生长(包括营养、温度、pH 等)，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。例如： 以尿素为唯一氮源的培养基可筛选出尿素分解菌； 以纤维素为唯一碳源的培养基可筛选出纤维素分解菌； 以石油为唯一碳源的培养基可筛选出石油分解菌； 缺乏有机碳源的培养基可筛选出自养微生物； 缺乏氮源的培养基可筛选出固氮微生物； 加入抗生素的培养基可筛选出酵母菌、霉菌等真菌。3.微生物计数方法：稀释涂布平板法（活菌计数法），显微镜直接计数法，滤膜法。（1）稀释涂布平板法（活菌计数法）原理：当样品的稀释度足够
23、高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。原则：设置重复组，同一稀释度下至少涂布 3 个平板，增强实验说服力和准确性；重复组结果应一致。为了保证结果准确，一般选择菌落数在 30300 的平板进行计数。计算公式：每克样品中的菌株数(CV)M(个/mL)。其中，C 代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V 代表涂布平板时所用的稀释液体积(mL)(一般为 0.1mL)，M 代表稀释倍数。结果：统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。需要设置未接种(或接种等量无菌水
24、)的培养基作为空白对照， 目的是判断培养基是否被杂菌污染。需要设置牛肉膏蛋白胨培养基与选择培养基作为对照，目的判断选择培养基的筛选作用（2）显微镜直接计数法主要用具：血细胞计数板和显微镜。血细胞计数板使用方法： “先盖后滴再吸”，即先盖盖玻片，后滴培养液，再用吸水纸吸。计算公式：1mL 培养液中细胞个数小方格中细胞平均数400104稀释倍数(个/mL)结果：估算值比实际值偏大，因为该方法不能区分细胞的死活，计数到的细胞数包括了死亡的细胞数。（3）滤膜法第 7页，共 9页以测定饮用水中大肠杆菌的数目为例。 将已知体积的水过滤后， 将滤膜放在伊红美蓝培养基上培养。在该培养基上，大肠杆菌的菌落呈现黑
25、色，带金属光泽。可以根据培养基上黑色菌落的数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。4.实验流程：土壤取样样品稀释涂布培养与观察计数。（1）土壤取样：土壤有“微生物的天然培养基”之称。土壤取样时应选取取富含有机质、pH 接近中性且潮湿的距地表约 38cm 的土壤层。 取一定量土溶于无菌水中， 制成土壤溶液。（2）将样品进行梯度稀释：样品稀释度直接影响平板上生长的菌落数目。用一定稀释范围的样品液进行涂布培养，以保证获得菌落数在 30300 之间、适于计数的平板。测定细菌数量一般选用 104、105和 106倍稀释液，测定放线菌数量一般选用 103、104和 105倍稀释液，测定真菌数量一般选用 102、
26、103和 104倍稀释液进行平板培养。（3）培养与观察：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和时间。细菌：3037培养 12d，放线菌：2528培养 57d，霉菌：2528的温度下培养 34d。将样品涂布到固体培养基表面， 不能用平板划线法。 为防止皿盖上的水珠滴入培养基造成污染，需将培养皿呈倒置状态放置。每隔 24h 统计一次菌落数目，最后选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。一般来说，在一定的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，这些特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面。（4）计数：当菌落数目稳定时，取同一稀释度下至少 3 个
27、平板进行计数，求出平均值，并根据所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。 用记号笔标记培养皿中菌落时， 应标记在皿底。5.未接种或接种等量无菌水的培养基(空白对照)上有菌落生长，说明培养基被杂菌污染。牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落的数目和种类远大于选择培养基时， 说明选择培养基具有筛选作用。6.在以尿素为唯一氮源的培养基中， 只有能分解尿素的细菌才能利用尿素这种氮源来生长繁殖， 并长出菌落。 尿素分解菌产生的脲酶能将尿素分解成 CO2和 NH3， NH3溶于水会离解出 NH4+和 OH-，使培养基的碱性增强，pH 值升高。在以尿素为唯一氮源的选择培养基中加入酚红指示剂(鉴别培养基)培养细菌，如果菌落
28、周围变红（指示剂将变红），可初步确定该种细菌能够分解尿素。7.伊红美蓝培养基属于鉴别培养基， 大肠杆菌代谢产物会和伊红美蓝发生反应， 使菌落呈现黑色，并有金属光泽。8.思考 1：1g 土的体积约为 1ml ，10g 土加入到 90ml无菌水，相当于稀释了 10 倍。思考 2：假如 104稀释度下涂布的 3 个平板的菌落数分别为 42、 40 和 38， 则 1ml 稀释液中的菌株数为 400，104稀释度的试管中的菌株数为 4103， 102稀释度的试管中的菌株数为 4105，101稀释度的锥形瓶中的菌株数为 4107。101稀释度的锥形瓶中的菌株来自于 10g 土，所以 1g 土中的菌株数为
29、 4106。专题专题 3 3 植物组织培养技术植物组织培养技术课题课题 1 1 菊花的组织培养菊花的组织培养第 8页，共 9页1.植物组织培养（1）原理：植物细胞的全能性。（2）由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化，或者叫做去分化。脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫做再分化。再分化形成的试管苗，移栽到地里，可以发育成完整的植物体。2.植物组织培养常用的培养基是 MS 培养基，其中含有的大量元素，微量元素，有机物等。在配制好的 MS 培养基中，常常需要添加植物激素。3.接种前培养基需要用高压蒸汽灭菌，外植体需要消毒（常用酒精和
30、氯化汞）消毒时既要考虑药剂的消毒效果，又要考虑植物的耐受性。4.植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、 脱分化和再分化的关键性激素。 在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强趋势。5.进行菊花的组织培养，每日用日光灯照射 12h。专题专题 5 5DNADNA和蛋白质技术和蛋白质技术课题课题 1 1DNADNA 的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定1.原理：（1）思路：DNA 与 RNA、蛋白质和脂质在物理和化学性质方面的差异，提取 DNA 去除其它杂质。（2）DNA 的溶解性：DNA 和蛋白质等其它成分在不同浓度的 NaCl 溶液中溶解度不同，利用这一特点，选用适当的浓度就能使 DNA 充
31、分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。（3）DNA 对酶、高温和洗涤剂的耐受性原理:蛋白酶能够水解蛋白质，但是对 DNA 没有影响。大多数蛋白质不能忍受 6080的高温，而 DNA 在 80以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对 DNA 没有影响。2、操作过程：材料的选取：选用 DNA 含量相对较高的生物组织。破碎细胞：鸡血细胞，加蒸馏水，用玻璃棒搅拌，用纱布过滤，收集滤液。去除杂质：利用 DNA 在不同浓度的 NaCl 溶液中溶解度的不同，通过控制 NaCl 溶液的浓度去除杂质。DNA 析出：将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等的、冷却的体积分数为 95%的酒精溶液。DNA 的
32、鉴定：在溶有 DNA 的溶液中加入二苯胺试剂，沸水中加热 5 min，溶液变成蓝色。使用顺序实验结果先生长素，后细胞分裂素有利于分裂但不分化先细胞分裂素，后生长素细胞既分裂也分化同时使用分化频率提高生长素细胞分裂素比值与结果比值高时促根分化，抑制芽形成比值低时促芽分化，抑制根形成比值适中促进愈伤组织生长脱分化植物组织再分化再分化移栽愈伤组织丛芽生根完整植株第 9页，共 9页注意：本实验不能用哺乳动物成熟红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟红细胞无细胞核。实验中两次使用蒸馏水，第一次的目的是使成熟的鸡血细胞涨破释放出 DNA，第二次的目的是稀释 NaCl 溶液，使 DNA 从溶液中析出。(3)二
33、苯胺试剂要现配现用，否则二苯胺会变成浅蓝色，影响鉴定效果。课题课题 2 2 多聚链式反应扩增多聚链式反应扩增 DNADNA 片段片段1.PCR 全称为多聚链式反应，它是指一种体外迅速扩增 DNA 片段的技术的实验技术。2.PCR 扩增是在 PCR 自动扩增仪中进行的，具体反应过程包括 3 个反应步骤即变性，复性，和延伸。3.PCR 体外扩增 DNA 的过程类似细胞内 DNA 的复制的过程，两者都需要 DNA 模板，引物，四种脱氧核苷酸，DNA 聚合酶都需要能量，所不同的是体内解聚是靠解旋酶，体外解聚是靠高温变性，引物是一小段 DNA 或 RNA，它能与 DNA 母链的一段碱基序列互补配对。4.
34、PCR 原理DNA 热变性原理，即：5.PCR 反应过程变性：当温度上升到 90以上时，双链 DNA 解聚为单链。复性：温度下降到 50左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链 DNA 结合。延伸：温度上升到 72 左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在 TaqDNA 聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的 DNA 链。6.为了明确地表示 DNA 的方向，通常将 DNA 的羟基（OH）末端称为 3端，而将磷酸基团的末端称为 5端。DNA 聚合酶不能从头开始合成 DNA，而只能从 3端延伸 DNA 链，因此 DNA 复制需要引物。当引物与 DNA 母链通过碱基互补配对结合后，DNA 聚合酶就能从引物的 3端开始延伸 DNA 链，因此，DNA 的合成方向总是从子链的 5端向 3端延伸。
