1、第第2节节 微生物的培养技术及应用微生物的培养技术及应用一一 微生物的基本培养技术微生物的基本培养技术从社会中来 向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经过发酵就可以制成酸奶，由有益的细菌，再经过发酵就可以制成酸奶，由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶，自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导奶，自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致肠胃不适的事件屡见不鲜，主要原因是在制致肠胃不适的事件屡见不鲜，主要原因是在制作过程中有杂菌混入。那么，怎样才能保证无作过程中有杂菌混入。那么，怎样才能保证无处不在的杂菌不
2、混入发酵物中呢？处不在的杂菌不混入发酵物中呢？ 应该先对制作用具和原料进行灭菌处理，再接种纯的菌种，应该先对制作用具和原料进行灭菌处理，再接种纯的菌种，并控制发酵条件，避免杂菌进入。并控制发酵条件，避免杂菌进入。酸奶酸奶这需要应用无菌技术和微生物的培养技术这需要应用无菌技术和微生物的培养技术一、微生物概述一、微生物概述1. .微生物的概念：微生物的概念： _的统称。的统称。包括包括_等等 2._，_是研究和应用微是研究和应用微生物的前提，也是发酵工程的重要基础。生物的前提，也是发酵工程的重要基础。防止杂菌污染防止杂菌污染获得纯净的微生物培养物获得纯净的微生物培养物3.实验室培养微生物的条件：实
3、验室培养微生物的条件：要为人们需要的微生物提供合适的要为人们需要的微生物提供合适的_条件；条件；要要确保确保_，并将需要的微生物分离出来。，并将需要的微生物分离出来。营养和环境营养和环境其他微生物无法混入其他微生物无法混入难以用肉眼观察的微小生物难以用肉眼观察的微小生物细菌、真菌、病毒及一些原生生物细菌、真菌、病毒及一些原生生物 人们按照人们按照_，配制出供其生，配制出供其生长繁殖的长繁殖的营养基质营养基质，即培养基。，即培养基。二、培养基的配制二、培养基的配制1.培养基的概念、作用及类型培养基的概念、作用及类型（1）概念：概念：微生物对营养物质的不同需求微生物对营养物质的不同需求（2）作用：
4、作用： 用以用以培养、分离、鉴定、保存微生物培养、分离、鉴定、保存微生物或或积累其代谢物积累其代谢物。（3）类型：）类型：液体培养基固体培养基菌落不含凝固剂（如琼脂）不含凝固剂（如琼脂）在液体培养基中加入琼脂后制在液体培养基中加入琼脂后制成的成的琼脂固体培养基琼脂固体培养基，是实验，是实验室中最常用的培养基之一室中最常用的培养基之一呈液态状态呈液态状态微生物在琼脂固微生物在琼脂固体培养基表面或体培养基表面或内部生长形成肉内部生长形成肉眼可见的眼可见的菌落菌落补充资料：培养基的类型及用途补充资料：培养基的类型及用途划分标准培养基种类特点用途物理性质化学成分用途不加凝固剂不加凝固剂加凝固剂，如琼脂
5、加凝固剂，如琼脂微生物分离、鉴定、微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种活菌计数、保藏菌种含化学成分不明确的天然物质含化学成分不明确的天然物质工业生产工业生产培养基成分明确培养基成分明确分类、鉴定分类、鉴定允许特定种类的微生物生长允许特定种类的微生物生长, ,同时抑同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养制或阻止其他种类微生物生长的培养基基培养、分离出特定培养、分离出特定微生物微生物在培养基中加入某种指示剂或化学在培养基中加入某种指示剂或化学药品药品, ,用以鉴别不同种类的微生物用以鉴别不同种类的微生物鉴别不同种类鉴别不同种类微生物微生物天然培养基天然培养基合成培养基合成培养基固体培养基固体培养基
6、液体培养基液体培养基半固体培养基半固体培养基选择培养基选择培养基鉴别培养基鉴别培养基2、培养基的营养构成、培养基的营养构成:（1 1）基本成分：）基本成分： 水、碳源、氮源水、碳源、氮源、无机盐、无机盐。碳源碳源无机碳源：无机碳源：有机碳源：有机碳源：氮源氮源NHNH4 4、NONO3 3- -、NHNH3 3等等。牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等。COCO2 2、COCO3 32-2-、HCOHCO3 3- -。葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等。无机氮源：无机氮源：有机氮源：有机氮源：来源于动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质来源于动物，含有糖、
7、维生素和有机氮等营养物质无机盐无机盐ZnZn、CuCu、MnMn、CoCo、MoMo等等大量元素：大量元素：微量元素：微量元素：CaCa、K K 、MgMg等等牛肉膏、蛋白胨：牛肉膏、蛋白胨：自养微生物自养微生物异养微生物异养微生物为什么培养基需要氮源？为什么培养基需要氮源？ 是是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。（2 2）特殊需求：）特殊需求：满足微生物对 _的需求培养培养厌氧微生物厌氧微生物时，需要时，需要提供提供_的条件。培养培养乳酸杆菌乳酸杆菌时，需要在培养基中添加时，需要在培养基中添加_；培养培养霉菌霉菌时，需要将培养基调至时，需要将培养基调至
8、_；培养培养细菌细菌时，需要将培养基时，需要将培养基调至调至_；维生素维生素酸性中性或弱碱性无氧表1-1 1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养组成组分组分含量含量提供的主要营养提供的主要营养牛肉膏牛肉膏5g5g碳源、磷酸盐和维生素等碳源、磷酸盐和维生素等蛋白胨蛋白胨10g10g氮源和维生素等氮源和维生素等NaClNaCl5g5g无机盐无机盐H2OH2O定容至定容至1000ml1000ml水水例：某种细菌培养基的营养构成pH、特殊营养物质、氧气三、无菌技术三、无菌技术1.1.概念：概念： _的培养微生物的操作技术的培养微生物的操作技术2.2.手段：手段： 主要包括主要包括_和和_。（1）对实验操
9、作的）对实验操作的_、操作者的、操作者的_，进行，进行清洁清洁和和消毒消毒。（2）将用于微生物培养的）将用于微生物培养的_、_和和_等进行等进行灭菌灭菌。 无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？污染外，还有什么作用？还能有效避免操作者被微生物感染还能有效避免操作者被微生物感染。防止杂菌污染防止杂菌污染消毒消毒灭菌灭菌空间空间衣着和手衣着和手器皿器皿接种用具接种用具培养基培养基3.消毒消毒（1）概念：）概念： 指使用指使用较为温和较为温和的的物理、化学或生物等方法物理、化学或生物等方法杀死物体表杀死物体表面或内部面或
10、内部一部分微生物一部分微生物。（2）常用的消毒方法）常用的消毒方法煮沸消毒法煮沸消毒法： 100100煮沸煮沸5 56min6min，可以杀死微生物的营养细，可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。胞和一部分芽孢。巴氏消毒法巴氏消毒法： 62626565下消毒下消毒30 min30 min或或80809090处理处理30s30s1min1min适合一些适合一些不耐高温的液体不耐高温的液体，如牛奶。可以杀死牛奶中的绝大多，如牛奶。可以杀死牛奶中的绝大多数微生物，并且不破坏牛奶的营养成分数微生物，并且不破坏牛奶的营养成分。用用70%70%酒精擦拭双手酒精擦拭双手、用、用氯气消毒水源氯气消毒水源等。等
11、。化学药剂消毒法化学药剂消毒法: :紫外线消毒法紫外线消毒法： 接种室、接种箱或超净工作台在使用前可接种室、接种箱或超净工作台在使用前可用紫用紫外线照射外线照射30min30min。可杀死物体表面和空气中的微生物。在照射前，。可杀死物体表面和空气中的微生物。在照射前，适量喷洒石碳酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果。适量喷洒石碳酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果。4.灭菌灭菌（1）概念：）概念： 指使用指使用强烈的理化方法强烈的理化方法杀死物体内外杀死物体内外所有的微生物，包所有的微生物，包括芽孢和孢子括芽孢和孢子。（2）常用的灭菌方法）常用的灭菌方法湿热灭菌湿热灭菌： 利用沸水、流
12、通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌的方法。的方法。高压蒸汽灭菌效果最好，高压蒸汽灭菌效果最好，100 kPa100 kPa、121121下维持下维持151530min30min，工具为工具为高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅，常用于培养基、无菌水等的灭菌，常用于培养基、无菌水等的灭菌。干热灭菌干热灭菌： 将灭菌物品放入密闭容器如干热灭菌箱，在将灭菌物品放入密闭容器如干热灭菌箱，在160160170170的热空气中维持的热空气中维持2 23h3h。常用于。常用于耐高温的和需要保持干耐高温的和需要保持干燥的物品燥的物品（如（如玻璃器皿、金属用具等玻璃器皿、金属用具等）。灼烧灭菌
13、灼烧灭菌： 直接在酒精灯火焰的充分燃烧层（外焰）灼烧直接在酒精灯火焰的充分燃烧层（外焰）灼烧，可，可以迅速彻底地灭菌。以迅速彻底地灭菌。适用于微生物的接种工具，如涂布器、接种环、接种针或其它适用于微生物的接种工具，如涂布器、接种环、接种针或其它金属用具，试管口、瓶口等容易被污染的部位金属用具，试管口、瓶口等容易被污染的部位四、微生物的纯培养四、微生物的纯培养1.概念：概念：（1 1）培养物：培养物： 在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物培养物。（2 2）纯培养物：）纯培养物
14、： 由单一个体繁殖所获得的微生物群体由单一个体繁殖所获得的微生物群体（5 5）纯培养：）纯培养： 获得纯培养物的过程获得纯培养物的过程（3 3）菌落：菌落： 分散的微生物在适宜的固体培养基表分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。，这就是菌落。 将单个微将单个微生物分散在固体培养基上的方法生物分散在固体培养基上的方法2.原理：原理：微生物群微生物群分散分散或或稀释稀释单个细胞单个细胞单个菌落单个菌落繁殖繁殖（4 4）平板划线法）平板划线法和和稀释涂布平板法：稀释涂布平板法：
15、3.步骤：步骤： 微生物的纯培养包括微生物的纯培养包括_、_、_、分离分离和和_等步骤等步骤配制培养基配制培养基灭菌灭菌接种接种培养培养（以（以酵母菌的纯培养酵母菌的纯培养为例）为例）（1 1）制备培养基：）制备培养基：配制配制培养基培养基：称取去皮马铃薯称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水，切成小块，加水1000ml，加热煮，加热煮沸至马铃薯软烂，沸至马铃薯软烂，用纱布过滤用纱布过滤。向滤液中加入。向滤液中加入20g葡萄糖葡萄糖、1520g琼脂琼脂，用蒸馏水定容至，用蒸馏水定容至1000ml。灭菌：灭菌： 将配制好的将配制好的培养基培养基转转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛移到锥形瓶中，加棉塞
16、，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高高压蒸汽灭菌锅压蒸汽灭菌锅中，在压力为中，在压力为100kPa、温度为、温度为121的条件下，的条件下，灭菌灭菌1530min。培养基培养基灭菌：灭菌： 将将58套套培养皿培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱干热灭菌箱内，在内，在160170灭菌灭菌2h。培养皿培养皿灭菌：灭菌：倒平板倒平板待培养基冷却到待培养基冷却到50左右时，在左右时，在酒精灯火焰附近酒精灯火焰附近倒平板。倒平板。拔出锥形拔出锥形瓶的棉塞瓶的棉塞将瓶口迅速将瓶口迅速通过火焰通过火焰用拇指和食指用拇指和食指将培养皿打开一
17、将培养皿打开一条稍大于瓶口的条稍大于瓶口的缝隙，将培养基缝隙，将培养基（101020mL20mL）倒）倒入培养皿，立即入培养皿，立即盖上皿盖盖上皿盖倒平板的具体操作倒平板的具体操作步骤步骤等待培养基冷却等待培养基冷却凝固后，将培养皿凝固后，将培养皿倒转过来放置倒转过来放置既可以防止培养基既可以防止培养基表面的水分挥发；表面的水分挥发；又可以防止皿盖上又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，的水珠落入培养基，造成污染。造成污染。（2）接种和分离酵母菌）接种和分离酵母菌 通过接种环在固体培养基表面通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作连续划线的操作( (平板划线法平板划线法) )，将聚集的菌种将聚集的
18、菌种逐步稀释分散到培养基表面逐步稀释分散到培养基表面。经数次划线后培养，可。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。以分离得到单菌落。灼烧接种环，直至灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红接种环金属丝烧红在火焰旁冷却接种环，拔在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞出酵母菌培养液试管的棉塞试管口通过火试管口通过火焰焰在火焰附近用接种在火焰附近用接种环蘸取一环菌液环蘸取一环菌液试管口通过火焰，试管口通过火焰，并塞上棉塞并塞上棉塞将皿盖打开将皿盖打开一条缝隙，一条缝隙，用用接种环接种环在培养在培养基表面迅速基表面迅速划划三至五三至五条平行条平行线，盖上皿盖线，盖上皿盖灼烧接种环，待灼烧接种环，待其冷
19、却后，从第一其冷却后，从第一次划线的末端开始次划线的末端开始作第二次划线。重作第二次划线。重复以上操作，作第复以上操作，作第三、四、五次划线三、四、五次划线平板划线法的具体划法平板划线法的具体划法注意：注意：接种环只蘸一次菌液接种环只蘸一次菌液, ,但要在培但要在培养基不同位置连续划线多次；养基不同位置连续划线多次；划线首尾不能相接；划线首尾不能相接；每次划线前接种环进行灭菌；每次划线前接种环进行灭菌；划线后划线后, ,培养皿倒置培养。培养皿倒置培养。2022-1-12 为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时环？在划
20、线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？仍然需要灼烧接种环吗？为什么？灼烧时期灼烧时期目的目的取菌种前取菌种前每次划线前每次划线前接种结束后接种结束后杀死接种环上原有微生物杀死接种环上原有微生物杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞种数目逐渐减少，直至得到单个细胞杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者和感染操作者2022-1-12（3）培养酵母菌）培养酵母菌 完成平板划线后，待
21、菌液被培养完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将基吸收，将接种后的平板接种后的平板和和一个未接一个未接种的平板种的平板倒置，放入倒置，放入28左右左右（培养培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养的恒温培养箱中培养2448h。4.结果分析与评价结果分析与评价（1）在未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，说明了在未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，说明了什么？什么？ 在未接种的培养基表面应该没有菌落生长，如果有，说明培在未接种的培养基表面应该没有菌落生长，如果有，说明培养基被杂菌污染或灭菌不彻底养基被杂菌污染或灭菌不彻底。（2）在接种酵母
22、菌的培养基上，你是否观察到了单菌落？这些在接种酵母菌的培养基上，你是否观察到了单菌落？这些菌落的颜色、形状和大小是否一致？如果你观察到了不同形态的菌落的颜色、形状和大小是否一致？如果你观察到了不同形态的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的吗？菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的吗？ 在接种酵母菌的培养基上可观察到单菌落。如果培养基上在接种酵母菌的培养基上可观察到单菌落。如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合酵母菌菌落生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合酵母菌菌落的特点，的特点， 则说明纯化酵母菌的操作成功；则说明纯化酵母菌的操作成功；如果观察到了如果观察到了不同不
23、同形态的菌落形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起的因引起的。（3）你是如何记录实验结果的？）你是如何记录实验结果的？ 提示：可以在培养提示：可以在培养12h12h和和24h24h后，观察菌落的大小、形状、后，观察菌落的大小、形状、颜色。培养颜色。培养24h24h后，菌落的大小、形状是否发生变化，菌落颜色后，菌落的大小、形状是否发生变化，菌落颜色是否加深，光泽度是否增加，等等是否加深，光泽度是否增加，等等评估论点的可信程度评估论点的可信程度 所谓所谓“酵素酵素”，就是，就是“酶酶”的另一种说法。的另一种说法。“酵素酵素”制作就是制
24、作就是利用微生物进行无氧呼吸的原理利用微生物进行无氧呼吸的原理，进行像制作，进行像制作泡菜一样的发酵。泡菜一样的发酵。 这样制作的这样制作的“酵素酵素”中中可能有糖类可能有糖类( (包括包括- -些简单的糖和膳食纤维等些简单的糖和膳食纤维等) )、蛋白质、蛋白质( (包括多种酶包括多种酶) )、有机酸等成分有机酸等成分，不存在它独有的、特殊的营养物质不存在它独有的、特殊的营养物质，其，其中中甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质，食用后可甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质，食用后可能会危害人体健康能会危害人体健康。因此，。因此，“吃水果酵素可以美容、减吃水果酵素可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力肥、促进消化和提高免疫力”的论点值得怀疑。的论点值得怀疑。
