1、高压蒸汽灭菌液体培养基微生物的基本培养技术1、实验室培养微生物条件1）提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件培养基2）确保其它微生物无法混入无菌技术高压蒸汽灭菌温故知新：2、培养基的营养构成: 碳源、氮源、水、无机盐等无机碳源：无机碳源：COCO2 2、COCO3 32 2- -、HCOHCO3 3- -有机碳源：有机碳源： 葡萄糖、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等牛肉膏、蛋白胨等自养微生物自养微生物异养微生物异养微生物2）无机氮源：无机氮源： NHNH4 4、NONO3 3- -有机氮源：有机氮源：牛肉膏牛肉膏、蛋白胨、蛋白胨、尿素、尿素、等等注：3）CaCa、K K 、MgMg为为大量元素大量元素Z
2、nZn、CuCu、MnMn、CoCo、MoMo等等微量元素微量元素类型适用范围操作方法消毒灭菌较为温和理化方法，杀死部分微生物（不包括芽孢、孢子）强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法日常生活100 煮沸56 min巴氏消毒法不耐高温的液体6265 煮30 min或80-90 煮30s-1 min化学药剂生物活体、水源等擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源紫外线紫外线照射30 min灼烧灭菌接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧干热灭菌耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等物品放入干热灭菌箱,160170 加热23h湿热灭菌
3、培养基、培养皿等,生产和实验室常用高压蒸汽灭菌锅内,100 kPa,温度121 ,1530 min无菌的方法：接种室、接种箱，超净工作台课题背景 自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想要想从中分离出需要的特定微生物从中分离出需要的特定微生物并不容并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，更难实现。不是优势种群时，更难实现。稀释涂布平板法呈现的杂菌群那么我们又如何达成这一目标呢？科学家们应用选择性培养基解决了这一难题。二、微生物的选择培养和计数（一）选择培养基美国黄石国家公园的一个热泉 19731973年，科学
4、家从美国黄石国家公园的热泉中筛年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而提取出耐高温的选出水生栖热菌，进而提取出耐高温的DNADNA聚合酶。聚合酶。 为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢？为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢？ 实验室微生物的筛选时，可实验室微生物的筛选时，可人为提供有利于目的人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度、菌生长的条件（包括营养、温度、pHpH等），同时抑制等），同时抑制或阻止其他微生物生长。或阻止其他微生物生长。 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。 因为水生栖热菌能在因为水生栖
5、热菌能在70-8070-80的高温条件下生存，的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。而绝大多数微生物在此条件下不能生存。培养基中加培养基中加氨苄青霉素氨苄青霉素具有具有氨苄氨苄青霉素抗青霉素抗性性的的菌落菌落没有没有氨氨苄苄青霉素抗青霉素抗性性的的细菌细菌培养基应培养基应有菌落有菌落没有没有氨苄青霉素抗性氨苄青霉素抗性的的细菌细菌被被淘汰淘汰怎样怎样选择选择出出抗抗氨苄青霉素能力氨苄青霉素能力的细菌的细菌?加入加入青霉素青霉素：不加不加氮源氮源：不加不加含碳有机物含碳有机物：分离分离出酵母菌、霉菌等真菌出酵母菌、霉菌等真菌分离分离出固氮菌出固氮菌 分离分离出自养型微生物出自养型
6、微生物补充补充资料资料1-1-那么如果让你分离土壤中分解尿素的细菌，你应该怎么设计呢？思考-讨论选择培养基配方的设计尿素的立体结构讨论：牛肉膏牛肉膏5.0g5.0g蛋白胨蛋白胨10.0g10.0gNaClNaCl5.0g5.0g琼脂琼脂20.0g20.0g蒸馏水蒸馏水定容到定容到1000ml1000mlKHKH2 2POPO4 41.4g1.4gNaHNaH2 2POPO4 42.1g2.1gMgSOMgSO4 47H7H2 2O O0.2g0.2g葡萄糖葡萄糖10.0g10.0g尿素尿素CO(NHCO(NH2 2) )2 21.0g1.0g琼脂琼脂15.0g15.0g蒸馏水蒸馏水定容到定容到
7、1000ml1000ml配方配方一：一：培养培养细菌细菌配方配方二：二：培养可以培养可以分解尿素的细菌分解尿素的细菌配方二是配方二是选择选择培养基培养基2 2、此培养基中共有哪些、此培养基中共有哪些成分成分？在此？在此培养基中哪些作为培养基中哪些作为碳碳源、氮源源、氮源？配方二配方二成分：成分：（二）微生物的选择培养 如果想知道如果想知道1g1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，还需对土壤菌液进行土壤中有多少能分解尿素的细菌，还需对土壤菌液进行稀释稀释及科学的微生物及科学的微生物数量测定数量测定方法方法-稀释涂布平板法。稀释涂布平板法。2、 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土从肥沃、湿润的土壤
8、中取样。先铲去表层土3cm3cm左右，左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。再取样，将样品装入事先准备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌制备以尿素为唯一氮源的制备以尿素为唯一氮源的选择培养基选择培养基是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。6 6支试管，分别加入支试管，分别加入9ml9ml无菌水无菌水1ml1021ml1031ml1041ml1051ml1061ml1073
9、 3）样品梯度稀释：）样品梯度稀释：微量微量 移移液器液器稀释稀释10倍倍菌菌液液101ml无菌水中，无菌水中，摇匀，制成稀释摇匀，制成稀释10倍的土壤菌液。倍的土壤菌液。 分别取分别取1ml1ml上清液，上清液，mlml无菌水的试无菌水的试管中，制成不同稀释倍数的菌液。管中，制成不同稀释倍数的菌液。取取6 6支试管，分别加入支试管，分别加入9ml9ml无菌水。无菌水。1、将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中 滴滴2、取少量稀释液（不超过0.1ml ），滴加到培养基表面 灼灼3、将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8-10s。涂涂4、用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动
10、培养皿，使涂布均匀各梯度分别涂布3个平板1个不涂布作空白对照浸浸平板：平板：放入放入3737恒温箱中培养恒温箱中培养1 12d2d5 5）培养与观察）培养与观察稀释稀释10103 3倍倍稀释稀释10104 4倍倍稀释稀释10105 5倍倍空白对照空白对照恒温培养箱恒温培养箱（三）微生物的数量测定稀释涂布平板法除用于分离微生物外，也常用于统计样品中活菌数。在稀稀释涂布平板法除用于分离微生物外，也常用于统计样品中活菌数。在稀释度足够高时，培养基上表面生长的释度足够高时，培养基上表面生长的一个单菌落来源于样品稀释液中的一一个单菌落来源于样品稀释液中的一个活菌个活菌，通过统计平板上的菌落数，可推测出样
11、品中大约有多少活菌。，通过统计平板上的菌落数，可推测出样品中大约有多少活菌。1、原理：2、计数原则：一般选择菌落数在一般选择菌落数在3030300300的平板上进行计数。的平板上进行计数。为增强实验说服力与准确性，设计实验时，需要为增强实验说服力与准确性，设计实验时，需要涂布至少三个平板涂布至少三个平板作为重复组。作为重复组。分析实验结果时，要考虑重复组分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近结果是否接近，如果相差太大，意味着操作，如果相差太大，意味着操作 有误，需重新实验。有误，需重新实验。实例分析实例分析1：甲同学做此实验在稀释倍数甲同学做此实验在稀释倍数105获得获得3个平板，菌落数分别
12、个平板，菌落数分别是是80、90、100，涂布平板时均使用，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？每克样品中的菌落数(CV)M其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数平均菌落数，V V代表代表涂布平板时所用的稀释液的涂布平板时所用的稀释液的体积体积(ml)(ml)，M M代表代表稀释倍数。稀释倍数。（80+90+10080+90+100）/3/30.10.1 10 105 5 =9 =9 10107 7个个 两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释两
13、位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释 倍数为倍数为10106 6的培养基中，得到以下两种统计结果。的培养基中，得到以下两种统计结果。 1 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230230。 2 2、乙同学在该浓度下涂布了、乙同学在该浓度下涂布了A A、B B、C C三个平板，统计的菌落数分别为三个平板，统计的菌落数分别为2121、 212212、256256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163163作为统计结果。作为统计结果。 你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题
14、，错在哪？你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？ 甲：没有重复实验（至少涂布甲：没有重复实验（至少涂布3 3个平板）个平板） 乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。实例分析实例分析2 2：1 1、显微镜直接计数：、显微镜直接计数：这种方法是利用特定这种方法是利用特定细菌计数板细菌计数板或或血细胞计数板血细胞计数板，在显微镜下，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量计算一定容积里样品中微生物的数量（比例计数法）待测样品待测样品等量的已知含量的红细胞等量的已知含量的红细胞 混匀混匀涂抹
15、涂抹测定：测定： 红细胞数目红细胞数目细菌数目细菌数目计算单位体积内的细菌数目计算单位体积内的细菌数目 将含已知数目的红细胞液体与待测的菌液按将含已知数目的红细胞液体与待测的菌液按1 1：1 1均匀混合，在显微均匀混合，在显微镜下数出各自的数目，然后求菌液中的细胞数目。镜下数出各自的数目，然后求菌液中的细胞数目。细菌红细胞2、显微镜直接计数是测定微生物的方法。举例：已知红细胞浓度为M个/mL，从体积为N mL的大肠杆菌培养液中取出大肠杆菌液与红细胞液等量均匀混合后，涂片，染色，镜检。在同一视野中发出有红细胞W个，大肠杆菌Y个，求NmL大肠杆培养液中大肠杆菌的个数X是多少？XNM YW(个)观察
16、到的红细胞平均数/观察到的细菌平均数红细胞含量/细菌含量 公 式 思考-讨论土壤中分解尿素的细菌的分离和计数尿素的立体结构土壤取样制备培养基样品稀释与取样涂布微生物的培养与观察1、土壤取样1）取样的位置： 土壤含有大量的微生物，是微生物的天然培养基。细菌适宜在酸碱度接近 中性的 潮湿土壤中生长，绝大多数的细菌分布距地表3 8cm的土壤层。2）取样要求：先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 2、制备培养基制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。3、样品的稀释测土壤中细菌数量，一般选用1x104 、1x105 和1x106倍的稀释液进行平板培养。4、微生物的培养与观察30-37
17、0C温度下培养1-2d，每隔24h统计一次菌落数。3、操作提示2）无菌操作3）做好标记本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，使用前要做好标记4）制定计划对于耗时较长的生物实验，要事先规划时间，以便提高工作对于耗时较长的生物实验，要事先规划时间，以便提高工作效率，在操作时更加有条不紊效率，在操作时更加有条不紊1）不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。a a、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。b b、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入 锥形瓶中，塞好棉塞。
18、锥形瓶中，塞好棉塞。c c、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。结果分析与评价1、结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。2、你是否获得了某一稀释度下菌落数目在30-300的平板？在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近？3、你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少？到社会中去1、空气中微生物总数的检测？2、水中细菌总数的检测？3、牛奶中细菌的分离与计数？4、土壤中真菌（或放线菌）的分离与计数？不同菌落的颜色与形状微微生生物物的的培培养养基础知识基础知识实验操作实验操作结果分析与评价结果分析与评价培养基培养基定义：定义：分类分类：无菌技术无菌技术定义：定义：消毒与灭菌消毒与灭菌常用灭菌方法常用灭菌方法制备选择培养基制备选择培养基纯化酵母菌纯化酵母菌小结小结
