1、Wechat:yinzx2003Emily Whitehead奇迹奇迹2010.5, 5岁诊断急性淋巴细胞白血病岁诊断急性淋巴细胞白血病(ALL)，化疗。，化疗。2011.10，复发。，复发。2012.2 骨髓移植前骨髓移植前2周前复发。周前复发。2012.4 参加参加CAR-T实验。实验。-EmilyW20142016.4癌细胞自身有标签。癌细胞自身有标签。患者免疫细胞可能不能识别这些标签。患者免疫细胞可能不能识别这些标签。把能触知癌细胞标签的把能触知癌细胞标签的“小手小手”装到免疫细胞装到免疫细胞-CAR-T。但是正常的但是正常的B淋巴细胞表面也有淋巴细胞表面也有CD19分布。分布。 嵌合
2、抗原受体嵌合抗原受体-T肿瘤治疗肿瘤治疗基因编辑技术结合基因编辑技术结合CAR-TCAR-TLayla Richards14周诊断急性淋巴细胞白血病。周诊断急性淋巴细胞白血病。化疗，骨髓移植，但复发。化疗，骨髓移植，但复发。2015年年11月月Qasim结合基因编辑与结合基因编辑与CAR-T技术，技术，“关闭关闭”导致排异反应的基因，制导致排异反应的基因，制成通用成通用CAR-T） 第第20章章常用分子生物学技术常用分子生物学技术的原理及应用的原理及应用内内 容容1.1. 核酸分子杂交核酸分子杂交2.2. PCRPCR3.3. DNADNA序列分析（基因结构分析）序列分析（基因结构分析）4.4
3、. DNADNA文库和文库和cDNAcDNA文库文库第一节第一节 核酸分子杂交核酸分子杂交molecular hyridization一、原理一、原理复性复性RNADNAn分子杂交分子杂交 ：不同核酸的单链分子间存在一定同源性时，在复性过不同核酸的单链分子间存在一定同源性时，在复性过程中，可按碱基互补配对原则形成双链。程中，可按碱基互补配对原则形成双链。1.1.核酸探针核酸探针 一段与待测核酸分子互补的核酸一段与待测核酸分子互补的核酸单链单链，带有可被检测的，带有可被检测的标记标记。 CGTTAGCGCTCTAAGGCAATATCGCGGATTG探针与待测探针与待测基因不完全配对基因不完全配对
4、u 只要存在一个碱基不配对，就会明显影响杂交双链的稳定性。只要存在一个碱基不配对，就会明显影响杂交双链的稳定性。 ATCGCGGGATTCGTTAGCGCCCTAAGGCAAT探针与待测探针与待测基因完全配对基因完全配对标记标记标记标记 DNA探针：探针： cDNA探针探针: RNA探针探针 寡核苷酸探针寡核苷酸探针 探针的标记物探针的标记物 探针探针 放放射性标记：同位素射性标记：同位素-32P 非放射性标记：生物素、地高辛、荧光素非放射性标记：生物素、地高辛、荧光素（二）应用（二）应用DNA印迹杂交印迹杂交（Southern blotting）基本过程基本过程16斑点印迹 (dot blo
5、tting)(dot blotting) 核酸变性后直接点在膜上，用探针与之杂交。核酸变性后直接点在膜上，用探针与之杂交。 用途：特定基因的定性分析。用途：特定基因的定性分析。17原位杂交（in situ hybridization，ISH） 将探针与细胞或组织切片中的核酸杂交。对原位表达的mRNA进行定位。优点：保持组织或细胞的形态，准确地反映组织细胞的功能状态。18小鼠大脑皮层mRNA原位杂交细胞原位杂交19DNA芯片 将多种已知序列的DNA排列固相支持物，检测样品中的核酸种类。1.1. 核酸分子杂交核酸分子杂交2.2. PCRPCR3.3. DNADNA序列分析（基因结构分析）序列分析（
6、基因结构分析）211.1. 核酸分子杂交核酸分子杂交2.2. PCRPCR3.3. DNADNA序列分析（基因结构分析）序列分析（基因结构分析）聚合酶链反应聚合酶链反应如何获得大量的目的基因？如何获得大量的目的基因？25变性变性95C95C延伸延伸Klenow片段片段退火退火Tm-5C问题：问题：DNA聚合酶循环一次后失活聚合酶循环一次后失活Taq DNA聚合酶在聚合酶在100C下仍不会下仍不会变性失活，变性失活，72C活性最大活性最大 耐热的耐热的DNA聚合酶聚合酶 5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5
7、 5 5 5 5 5 313 3限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列启动子序列启动子序列定点突变定点突变探针标记探针标记（放射性元素或非放射性物质，如生物素、（放射性元素或非放射性物质，如生物素、地高辛等）。地高辛等）。引物引物 3端的碱基要求严格配对（不能做任何端的碱基要求严格配对（不能做任何修饰）引物修饰）引物5端可修饰端可修饰32引物设计软件引物设计软件 Primer Premier 5.0 Primer Premier 5.0 OligoOligo Primer expressPrimer express primer 3primer 3 MethPrimerMethPrime
8、r mRNAcDNA37 TaqManTaqMan探针的结构探针的结构 35RQ33553551. 荧光标记探针法荧光标记探针法38TaqManTaqMan探针定量原理探针定量原理reverse primerRQforward primer33553551. 聚合probeRQ33553552. 链取代Q33553553. 探针被切断R3553554. 聚合完成QRR = 报告基团报告基团ReporterQ = 淬灭基团淬灭基团Quencher339与与DNA结合时发光结合时发光游离时不发光游离时不发光 2. SYBR Green I染料法染料法SYBR Green I 是是一种一种DNA小小
9、沟结合染料沟结合染料40在在PCR过程中染料与过程中染料与DNA结合发光结合发光聚合完成聚合完成聚合开始聚合开始45二、PCR技术的主要用途目的基因的克隆基因的体外突变DNA和RNA的微量分析DNA序列测定基因突变分析 2 11.1. 核酸分子杂交核酸分子杂交2.2. PCRPCR3.3. DNADNA序列分析（基因结构分析）序列分析（基因结构分析） Walter GilbertFrederick Sanger 60目前所用测序技术的缺点1、原理基于DNA链终止法，故测序长度受限，目前为1000 nt左右。2、测序反应费时费力 科学家们完成第一个人类基因组测序整整花了13年的时间，耗费了30亿
10、美元的费用。3、测序准确度不高 DNA聚合酶造成的碱基错配，造成判读错误。4、测序基于PCR反应，需要引物，故有些结构复杂的难于进行PCR反应的片段不能测序。61二代测序技术下一代测序技术（next generation sequence,NGS)next generation sequence,NGS)62基本流程： 将基因组DNA随机切割成为小片段DNA； 在所获小片段DNA分子的末端连上接头，然后变性得到单链模板文库； 固定于固体表面； 对固定片段进行克隆扩增，从而制成polony芯片。 针对芯片上的DNA，利用聚合酶或连接酶进行一系列循环反应，通过读取碱基连接到DNA链过程中释放出的光学信号而间接确定碱基序列。68第三代测序技术第三代测序技术 第四节第四节 基因文库基因文库Gene Library 基因组基因组DNA文库文库 (genomic DNA library) cDNA文库文库(cDNA library) 是指一个包含了某一生物体全部是指一个包含了某一生物体全部DNADNA序列序列的克隆群体。的克隆群体。n基因组文库和基因组文库和cDNA文库的构建和筛选文库的构建和筛选
