1、基因工程研究所基因工程研究所1Enzyme第第 3 章章 酶酶赵蕊赵蕊 副教授副教授基因工程研究所基因工程研究所2基因工程研究所基因工程研究所3教教 学学 要要 求求【教学课时教学课时】 6 学时学时【掌握内容掌握内容】酶的概念、化学本质、分子组成，单纯酶和全酶；活性中酶的概念、化学本质、分子组成，单纯酶和全酶；活性中心、必需基团的分类及其作用；酶促反应的特点；心、必需基团的分类及其作用；酶促反应的特点；Km与与Vmax值的概念和意值的概念和意义；抑制剂对酶促反应的影响：不可逆抑制的作用，可逆性抑制包括竞争义；抑制剂对酶促反应的影响：不可逆抑制的作用，可逆性抑制包括竞争性、非竞争性、反竞争性抑
2、制的动力学特征及其生理学意义；酶原与酶原性、非竞争性、反竞争性抑制的动力学特征及其生理学意义；酶原与酶原激活的过程与生理意义；变构酶和变构调节的概念、机理和动力学特征。激活的过程与生理意义；变构酶和变构调节的概念、机理和动力学特征。酶的共价修饰的概念和作用特点；同工酶的概念、生理意义。酶的共价修饰的概念和作用特点；同工酶的概念、生理意义。【熟悉内容熟悉内容】酶促反应的机理、中间产物学说；酶浓度、底物浓度、温酶促反应的机理、中间产物学说；酶浓度、底物浓度、温度、度、pH、激活剂对酶促反应的影响；酶活性的测定与酶活性单位概念；酶、激活剂对酶促反应的影响；酶活性的测定与酶活性单位概念；酶含量的调节特
3、点和调控。含量的调节特点和调控。基因工程研究所基因工程研究所4主主 要要 内内 容容1354酶的分类与命名酶的分类与命名酶的分子结构与功能酶的分子结构与功能酶促反应动力学酶促反应动力学酶的工作原理酶的工作原理酶的调节酶的调节26酶与医学的关系酶与医学的关系基因工程研究所基因工程研究所5酶学研究简史酶学研究简史公元前两千多年，我国已有酿酒记载。公元前两千多年，我国已有酿酒记载。1857年，年，Pasteur提出提出酒精发酵酒精发酵是酵母细胞生命活动的是酵母细胞生命活动的结果结果“活力论活力论”。1878年，年，Khne首次提出首次提出Enzyme一词。一词。1897年，年，Eduard Buch
4、ner用不含酵母细胞的酵母提取用不含酵母细胞的酵母提取液，实现了发酵，证明液，实现了发酵，证明发酵不需要活细胞的存在发酵不需要活细胞的存在。1926年，美国康乃尔大学年，美国康乃尔大学Sumner（萨姆纳）首次从刀（萨姆纳）首次从刀豆中提纯出脲酶结晶，并指出豆中提纯出脲酶结晶，并指出酶是蛋白质酶是蛋白质。 基因工程研究所基因工程研究所61930年，美国的生物化学家年，美国的生物化学家Northrop分离得到了胃蛋分离得到了胃蛋白酶（白酶（pepsin）、胰蛋白酶（）、胰蛋白酶（trypsin）、胰凝乳蛋白）、胰凝乳蛋白酶（酶（chymotrypsin）结晶，）结晶，确立了酶的化学本质确立了酶的
5、化学本质。 1982年，年，Cech首次发现首次发现RNA也具有酶的催化活性，也具有酶的催化活性，提出提出核酶核酶(ribozyme)的概念。的概念。1995年，报道了具有年，报道了具有DNA连接酶活性连接酶活性DNA片段，称为片段，称为脱氧核酶脱氧核酶(deoxyribozyme)。基因工程研究所基因工程研究所7Eduard Buchner（1860-1917）Wilhelm Khne（1837-1900）He is best known today for coining the word enzymeThe Nobel Prize in Chemistry 1907 enzyme (“i
6、n yeast”)希腊文希腊文 en = in ， zyme = yeast布希纳布希纳 威廉威廉库内库内 基因工程研究所基因工程研究所8J. B. Sumner1/2 of the prize （1887-1955） The Nobel Prize in Chemistry 1946 J. H. Northrop1/4 of the prize （1891-1987） W. M. Stanley1/4 of the prize （1904-1971） 萨姆纳萨姆纳 斯坦利斯坦利 诺斯罗普诺斯罗普 “for their preparation of enzymes andvirus prote
7、ins in a pure form”“for his discovery that enzymes can be crystallized”基因工程研究所基因工程研究所9 Urease crystals Sumner, J. B. (1926) “The isolation and crystallization of the enzyme urease” J. Biol. Chem. 69:435-441. Pepsin crystalsNorthrop, J. H. (1930) “Crystallin pepsin, 1: Isolation and tests of purity”
8、J. Gen . Physiol. 13:739-766.基因工程研究所基因工程研究所10核酶（核酶（ribozyme） 1982年美国年美国T. Cech等人发现四膜等人发现四膜虫的虫的rRNA前体能在完全没有蛋白质的前体能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，发现情况下进行自我加工，发现RNA有催化有催化活性活性 。Thomas Cech University of Colorado at Boulder, USA 基因工程研究所基因工程研究所12 1983年美国年美国S.Altman等研究等研究RNaseP（由（由20%蛋白质和蛋白质和80%的的RNA组成），发现组成），发现RNaseP
9、中的中的RNA可催化可催化E. coli tRNA的前体的前体加工。加工。 Sidney Altman Yale University New Haven, CT, USA 基因工程研究所基因工程研究所15生物催化剂生物催化剂(biocatalyst)：酶和核酶酶和核酶 核酶核酶(ribozyme)：具有高效、特异催化作用：具有高效、特异催化作用的核酸，主要参与的核酸，主要参与RNA的剪接。的剪接。酶酶是一类由活细胞产生的，对其特异底物是一类由活细胞产生的，对其特异底物具有高效催化作用的蛋白质。具有高效催化作用的蛋白质。What is the difference between an enz
10、yme and a protein?ProteinRNAEnzymes All enzymes are proteins except some RNAs and not all proteins are enzymes基因工程研究所基因工程研究所17几个有关名词几个有关名词底物底物(substrate, S)：酶作用的物质。：酶作用的物质。 产物产物(product, P)：反应生成的物质。：反应生成的物质。酶促反应：酶催化的反应。酶促反应：酶催化的反应。酶活性：酶催化化学反应的能力。酶活性：酶催化化学反应的能力。 -酮戊二酸转氨酶丙酮酸Ala + Glu基因工程研究所基因工程研究所18第一
11、节第一节酶的分子结构与功能酶的分子结构与功能The Molecular Structure and Function of Enzyme 基因工程研究所基因工程研究所19酶的不同形式酶的不同形式单体酶单体酶(monomeric enzyme) 仅具有三级结构的酶。仅具有三级结构的酶。寡聚酶寡聚酶(oligomeric enzyme) 由多个相同或不同亚基以由多个相同或不同亚基以非共价键连接组成的酶。非共价键连接组成的酶。多酶体系多酶体系(multienzyme system) 由几种不同功能的酶由几种不同功能的酶彼此聚合形成的多酶复合物。彼此聚合形成的多酶复合物。多功能酶多功能酶(multif
12、unctional enzyme)或串联酶或串联酶(tandem enzyme) 一些多酶体系在进化过程中由于基因一些多酶体系在进化过程中由于基因的融合，多种不同催化功能存在于一条多肽链中，这类酶称的融合，多种不同催化功能存在于一条多肽链中，这类酶称为多功能酶。为多功能酶。基因工程研究所基因工程研究所20一、酶的分子组成中常含有辅助因子一、酶的分子组成中常含有辅助因子蛋白质部分：酶蛋白蛋白质部分：酶蛋白 (apoenzyme)辅助因子辅助因子(cofactor) 金属离子金属离子小分子有机化合物小分子有机化合物全酶全酶(holoenzyme)结合酶结合酶 (conjugated enzyme)
13、单纯酶单纯酶 (simple enzyme)基因工程研究所基因工程研究所21全酶分子中各部分在催化反应中的作用全酶分子中各部分在催化反应中的作用酶蛋白酶蛋白决定反应的特异性决定反应的特异性辅助因子辅助因子决定反应的种类与性质决定反应的种类与性质基因工程研究所基因工程研究所22金属酶金属酶(metalloenzyme)金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易丢失。丢失。金属激活酶金属激活酶(metal-activated enzyme) 金属离子为酶的活性所必需，但与酶的结金属离子为酶的活性所必需，但与酶的结合不甚紧密。合不甚紧密。 金属离子是最多见的辅助因子金属
14、离子是最多见的辅助因子基因工程研究所基因工程研究所23金属离子的作用：金属离子的作用：参与催化反应，传递电子；参与催化反应，传递电子；在酶与底物间起桥梁作用；在酶与底物间起桥梁作用；稳定酶的构象；稳定酶的构象；中和阴离子，降低反应中的静电斥力等。中和阴离子，降低反应中的静电斥力等。基因工程研究所基因工程研究所24基因工程研究所基因工程研究所25辅助因子按其与酶蛋白结合的紧密程度分为辅助因子按其与酶蛋白结合的紧密程度分为 辅酶辅酶 (coenzyme):与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去。方法除去。 辅基辅基 (prosthetic group):与酶蛋
15、白结合紧密，不能用透析或超与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超滤的方法除去滤的方法除去。基因工程研究所基因工程研究所27二、酶的活性中心是酶分子中执行其催化二、酶的活性中心是酶分子中执行其催化功能的部位功能的部位酶分子中氨基酸残酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中基侧链的化学基团中，一些与酶活性密切相关一些与酶活性密切相关的化学基团的化学基团。必需基团必需基团(essential group)基因工程研究所基因工程研究所28指必需基团在空间结构上彼此靠近，组指必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异成具有特定空间结构的区域，能与底物特异结合并将底物转化为产物。结合并将底
16、物转化为产物。酶的活性中心酶的活性中心 (active center)基因工程研究所基因工程研究所29p活性中心内的必需基团活性中心内的必需基团结合基团结合基团binding group催化基团催化基团(catalytic group)催化底物转变成产物催化底物转变成产物 维持酶活性中心应有的空间构象和作为调节维持酶活性中心应有的空间构象和作为调节剂的结合部位所必需。剂的结合部位所必需。p活性中心外的必需基团活性中心外的必需基团p 构成酶活性中心的常见基团：构成酶活性中心的常见基团：His的咪唑基、的咪唑基、Ser的的-OH、Cys的的-SH、Glu的的-COOH。基因工程研究所基因工程研究所
17、30底底 物物 活性中心以外活性中心以外的必需基团的必需基团结合基团结合基团催化基团催化基团 活性中心活性中心 基因工程研究所基因工程研究所31溶菌酶的活性中心溶菌酶的活性中心溶菌酶的溶菌酶的活性中心活性中心是一裂隙，可以容是一裂隙，可以容纳纳肽多糖肽多糖的的6个单个单糖基（糖基（A，B，C，D，E，F），并与），并与之形成氢键和之形成氢键和van derwaals力。力。催化基团催化基团是是35位位Glu，52位位Asp；101位位Asp和和108位位Trp是是结合基团结合基团。63基因工程研究所基因工程研究所32三、同工酶是催化相同化学反应但一级结三、同工酶是催化相同化学反应但一级结构不同
18、的一组酶构不同的一组酶同工酶同工酶(isoenzyme)是指催化相同的化是指催化相同的化学反应，而酶蛋白的分子结构、理化性质乃学反应，而酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。至免疫学性质不同的一组酶。基因工程研究所基因工程研究所33 根据国际生化学会的建议，同工酶是由根据国际生化学会的建议，同工酶是由不同基不同基因编码因编码的多肽链，或由的多肽链，或由同一基因转录同一基因转录生成的不同生成的不同mRNA所翻译的不同多肽链组成的蛋白质。所翻译的不同多肽链组成的蛋白质。 同工酶存在于同一种属或同一个体的不同组织同工酶存在于同一种属或同一个体的不同组织或同一细胞的不同亚细胞结构中，它
19、使不同的组织或同一细胞的不同亚细胞结构中，它使不同的组织、器官和不同的亚细胞结构具有不同的代谢特征。、器官和不同的亚细胞结构具有不同的代谢特征。这是同工酶用于诊断不同器官疾病的理论依据。这是同工酶用于诊断不同器官疾病的理论依据。 基因工程研究所基因工程研究所34举例举例1：乳酸脱氢酶：乳酸脱氢酶(LDH1 LDH5)基因工程研究所基因工程研究所35LD5基因工程研究所基因工程研究所36基因工程研究所基因工程研究所37临床意义临床意义心肌梗死和肝病病人血清心肌梗死和肝病病人血清LDH同工酶谱的变化同工酶谱的变化1 1酶酶活活性性心肌梗死酶谱心肌梗死酶谱正常酶谱正常酶谱肝病酶谱肝病酶谱2 23 3
20、4 45 5基因工程研究所基因工程研究所3812345酶活性酶活性迁移位置迁移位置酶活性酶活性迁移位置迁移位置ab (a) LDH同工酶电泳图谱同工酶电泳图谱 (b)（a）正常人）正常人LDH同工酶电泳图谱同工酶电泳图谱,（b）心肌梗塞病人血清）心肌梗塞病人血清LDH同工酶电泳图谱同工酶电泳图谱 12345基因工程研究所基因工程研究所39举例举例 2：肌酸激酶：肌酸激酶(CK1CK3) CK1(BB) CK2(MB) CK3(MM)脑脑 心肌心肌 骨骼肌骨骼肌 心肌梗塞后心肌梗塞后618小时，小时，CK2释放入血，而释放入血，而LDH的释放比的释放比CK2迟迟12天，因此可用于心肌梗天，因此可
21、用于心肌梗死的早期诊断。死的早期诊断。基因工程研究所基因工程研究所40第二节第二节 酶促反应的特点与机理酶促反应的特点与机理The Characteristic and Mechanism of Enzyme-Catalyzed Reaction 基因工程研究所基因工程研究所41p酶与一般催化剂的共同点酶与一般催化剂的共同点在反应前后没有质和量的变化；在反应前后没有质和量的变化；只能催化热力学允许的化学反应；只能催化热力学允许的化学反应；只能加速可逆反应的进程，而不改变反只能加速可逆反应的进程，而不改变反应的平衡点。应的平衡点。基因工程研究所基因工程研究所42（一）酶促反应具有极高的效率（一）
22、酶促反应具有极高的效率 一、一、 酶促反应的特点酶促反应的特点酶的催化效率通常比非催化反应高酶的催化效率通常比非催化反应高1081020倍，倍，比一般催化剂高比一般催化剂高1071013倍。倍。酶的催化不需要较高的反应温度。酶的催化不需要较高的反应温度。酶 加 速 反 应 的 机 理 是 降 低 反 应 的 活 化 能酶 加 速 反 应 的 机 理 是 降 低 反 应 的 活 化 能(activation energy)。酶比一般催化剂更有效。酶比一般催化剂更有效地降低反应的活化能。地降低反应的活化能。基因工程研究所基因工程研究所43 酶的特异性酶的特异性(specificity)：一种酶仅作
23、用于一种一种酶仅作用于一种或一类化合物，或一定的化学键，催化一定的化或一类化合物，或一定的化学键，催化一定的化学反应并生成一定的产物。酶的这种选择性称为学反应并生成一定的产物。酶的这种选择性称为酶的特异性或专一性。酶的特异性或专一性。（二）酶促反应具有高度的特异性（二）酶促反应具有高度的特异性 绝对特异性绝对特异性(absolute specificity) 相对特异性相对特异性(relative specificity) 立体结构特异性立体结构特异性(stereo specificity)基因工程研究所基因工程研究所44绝对特异性绝对特异性酶只作用于特定结构的底物，进行一种专一酶只作用于特定
24、结构的底物，进行一种专一的反应，生成一种特定结构的产物的反应，生成一种特定结构的产物 。如：如： OCNH2NH2+ H2O2NH3 + CO2尿素脲酶OCNHNH2+ H2O甲基尿素CH3脲酶基因工程研究所基因工程研究所45相对特异性相对特异性酶作用于一类化合物或一种化学键。酶作用于一类化合物或一种化学键。如：如：OHOHHHOHHOHCH2OHHCH2OHHCH2OHOHHHOHOO11OHOHHHOHHOHCH2HCH2OHHCH2OHOHHHOHOO11OOOHHHHOHHOHCH2OHH1蔗糖棉子糖蔗糖酶基因工程研究所基因工程研究所46立体结构特异性立体结构特异性酶仅作用于立体异构体
25、中的一种。酶仅作用于立体异构体中的一种。HCH3CCOOHOHHCH3COHCOOHABCABC基因工程研究所基因工程研究所47（三）酶促反应的可调节性（三）酶促反应的可调节性 酶促反应受多种因素的调控，以适应机体酶促反应受多种因素的调控，以适应机体对不断变化的内外环境和生命活动的需要。对不断变化的内外环境和生命活动的需要。对酶生成与降解量的调节对酶生成与降解量的调节酶催化效力的调节酶催化效力的调节通过改变底物浓度对酶进行调节等通过改变底物浓度对酶进行调节等基因工程研究所基因工程研究所48二、酶通过促进底物形成过渡态而提高反二、酶通过促进底物形成过渡态而提高反应速率应速率（一）更有效地降低反应
26、活化能（一）更有效地降低反应活化能酶和一般催化剂一样，加速反应的作酶和一般催化剂一样，加速反应的作用都是通过降低反应的用都是通过降低反应的活化能活化能 (activation energy) 实现的。实现的。 基因工程研究所基因工程研究所49反应总能量改变反应总能量改变 非催化反应活化能非催化反应活化能 酶促反应酶促反应 活化能活化能 一般催化剂催一般催化剂催化反应的活化能化反应的活化能 能能量量 反反 应应 过过 程程 底物底物 产物产物 酶酶促促反反应应活活化化能能的的改改变变 活化能：活化能：底物分子从初态转变到活化态所需的能量。底物分子从初态转变到活化态所需的能量。基因工程研究所基因工
27、程研究所50过氧化氢分解反应所需活化能过氧化氢分解反应所需活化能催化剂催化剂每摩尔需活化能每摩尔需活化能无无18 000cal胶态钯胶态钯11 700cal过氧化氢酶过氧化氢酶2 000cal基因工程研究所基因工程研究所52（二）酶与底物的结合有利于底物形成过渡态（二）酶与底物的结合有利于底物形成过渡态 酶底物复合物酶底物复合物 E + S E + P ES 基因工程研究所基因工程研究所531. 诱导契合作用使酶与底物密切结合诱导契合作用使酶与底物密切结合 酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应，进而相互结合。这一过程称互变形和相互适应，进
28、而相互结合。这一过程称为酶为酶-底物结合的底物结合的诱导契合诱导契合(induced-fit) 。基因工程研究所基因工程研究所54锁钥学说锁钥学说基因工程研究所基因工程研究所55诱导契合假说诱导契合假说羧肽酶的诱导契合模式羧肽酶的诱导契合模式 底物底物基因工程研究所基因工程研究所57基因工程研究所基因工程研究所582. 邻近效应与定向排列使诸底物正确定位于酶邻近效应与定向排列使诸底物正确定位于酶的活性中心的活性中心 酶在反应中将诸底物结合到酶的活性中心，使它们酶在反应中将诸底物结合到酶的活性中心，使它们相互接近并形成有利于反应的正确定向关系。相互接近并形成有利于反应的正确定向关系。 这种这种邻
29、近效应邻近效应(proximity effect)与与定向排列定向排列(orientation arrange)实际上是将分子间的反应变实际上是将分子间的反应变成类似于分子内的反应，从而提高反应速率。成类似于分子内的反应，从而提高反应速率。 基因工程研究所基因工程研究所59 邻邻近近效效应应与与定定向向排排列列基因工程研究所基因工程研究所60 酶的活性中心多是酶分子内部的疏水酶的活性中心多是酶分子内部的疏水“口袋口袋”，酶反应在此疏水环境中进行，使底物分子酶反应在此疏水环境中进行，使底物分子脱溶剂化脱溶剂化 (desolvation)，排除周围大量水分子对酶和底物分，排除周围大量水分子对酶和底
30、物分子中功能基团的干扰性吸引和排斥，防止水化膜的子中功能基团的干扰性吸引和排斥，防止水化膜的形成，利于底物与酶分子的密切接触和结合。这种形成，利于底物与酶分子的密切接触和结合。这种现象称为现象称为表面效应表面效应(surface effect)。 3. 表面效应使底物分子去溶剂化表面效应使底物分子去溶剂化基因工程研究所基因工程研究所61（三）酶的催化机制呈多元催化作用（三）酶的催化机制呈多元催化作用1. 一般酸一般酸-碱催化作用碱催化作用(general acid-base catalysis) 2. 共价催化作用共价催化作用(covalent catalysis)3. 亲核催化作用亲核催化作
31、用(nucleophilic catalysis)基因工程研究所基因工程研究所62第三节第三节酶促反应动力学酶促反应动力学Kinetics of Enzyme-Catalyzed Reaction 基因工程研究所基因工程研究所63酶促反应动力学酶促反应动力学研究各种因素对酶促反应速率的影研究各种因素对酶促反应速率的影响。响。影响因素包括有影响因素包括有酶浓度、底物浓度、酶浓度、底物浓度、pH、温度、温度、抑制剂、激活剂等。抑制剂、激活剂等。基因工程研究所基因工程研究所64I.单底物、单产物反应单底物、单产物反应II. 酶促反应速度酶促反应速度用单位时间内底物的消耗量和用单位时间内底物的消耗量和
32、产物的生成量来表示产物的生成量来表示III. 反应速度取其初速度，即底物的消耗量很小反应速度取其初速度，即底物的消耗量很小（一般在（一般在5以内）时的反应速度以内）时的反应速度IV. 底物浓度远远大于酶浓度底物浓度远远大于酶浓度研究前提研究前提基因工程研究所基因工程研究所65一、底物浓度对反应速率影响的作图呈矩形一、底物浓度对反应速率影响的作图呈矩形双曲线双曲线在其他因素不变在其他因素不变的情况下，底物浓度的情况下，底物浓度对反应速率的影响呈对反应速率的影响呈矩形双曲线关系矩形双曲线关系。基因工程研究所基因工程研究所66当底物浓度较低时：当底物浓度较低时：反应速率与底物浓度成正比；反应为反应速
33、率与底物浓度成正比；反应为一级反应一级反应。SVVmax基因工程研究所基因工程研究所67随着底物浓度的增高随着底物浓度的增高反应速率不再成正比例加速；反应为反应速率不再成正比例加速；反应为混合级反应混合级反应。SVVmax基因工程研究所基因工程研究所68当底物浓度高达一定程度当底物浓度高达一定程度反应速率不再增加，达最大速率；反反应速率不再增加，达最大速率；反应为应为零级反应零级反应。SVVmax基因工程研究所基因工程研究所69基因工程研究所基因工程研究所70中间产物解释酶促反应中底物浓度和反应速率关系的解释酶促反应中底物浓度和反应速率关系的最合理学说是最合理学说是中间产物学说中间产物学说：E
34、 + S k1k2k3ESE + P（一）米（一）米-曼氏方程式揭示单底物反应的动力曼氏方程式揭示单底物反应的动力学特性学特性基因工程研究所基因工程研究所711913年年Michaelis和和Menten提出反应速率与底提出反应速率与底物浓度关系的数学方程式，即米物浓度关系的数学方程式，即米-曼氏方程式，曼氏方程式，简称简称米氏方程式米氏方程式 (Michaelis equation)。S：底物浓度底物浓度V：不同不同S时的反应速率时的反应速率Vmax：最大反应速率最大反应速率(maximum velocity) m：米氏常数米氏常数(Michaelis constant) VmaxS Km
35、+ S 基因工程研究所基因工程研究所72n反应是单底物反应反应是单底物反应nE与与S形成形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而复合物的反应是快速平衡反应，而ES分解为分解为E及及P的反应为慢反应，反应速率取决的反应为慢反应，反应速率取决于慢反应即于慢反应即 V = k3ES。 (1)nS的总浓度远远大于的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的的总浓度，因此在反应的初始阶段，初始阶段，S的浓度可认为不变即的浓度可认为不变即S =St。米米-曼氏方程式推导基于三个假设：曼氏方程式推导基于三个假设：基因工程研究所基因工程研究所73米米- -曼氏方程式推导过程曼氏方程式推导过程ES的生成速率的生成速率
36、 = ES的分解速率的分解速率当反应处于稳态时：当反应处于稳态时： E + S ES P + Ek1k2k3 反应速度反应速度 V=k3ES ES的生成速度的生成速度=消耗速度消耗速度 k1ES=k2ES + k3ES E的质量平衡方程的质量平衡方程 E=Et - ES基因工程研究所基因工程研究所74k2+k3= Km （米氏常数）（米氏常数） k1令：令：则则(2)变为变为: (EtES) S = Km ES(2)=(EtES)Sk2+k3ES k1整理得：整理得：k1 (EtES) S = k2 ES + k3 ESk1 ES = k2 ES + k3 ES E=Et - ES基因工程研究
37、所基因工程研究所75当底物浓度很高，将酶的活性中心全部饱和时，当底物浓度很高，将酶的活性中心全部饱和时，即即Et =ES，反应达最大速率，反应达最大速率Vmax = k3ES = k3Et (5)ES = EtSKm + S(3) 整理得整理得: :将将(5)代入代入(4)得米氏方程式：得米氏方程式：Vmax S Km + S V = 将将(3)代入代入(1) 得得k3EtS Km + S (4) V =基因工程研究所基因工程研究所76当当v=Vmax/2时时KmS 1. Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是的底物浓度，单位是mol
38、/L。2Km + S Vmax VmaxS（二）（二）Km与与Vmax是有意义的酶促反应动力学参数是有意义的酶促反应动力学参数基因工程研究所基因工程研究所77Km越越小小，亲和力越，亲和力越强。强。S很小时，反应速度很小时，反应速度就能达到很大。就能达到很大。当当K2 K3时，时， Km KsE + S ES P + Ek1k2k3 2. Km可近似表示酶对底物的亲和力可近似表示酶对底物的亲和力Km = k2 + k3 k1K Km mk2k2（解离能力）（解离能力）/ /k1k1（亲合能力）（亲合能力）=Kmk1k3k2+基因工程研究所基因工程研究所783. Km是酶的特征性常数之一是酶的特
39、征性常数之一 与与pH 、温度、离子强度、酶及底物种类有关，、温度、离子强度、酶及底物种类有关，与酶浓度无关，可以鉴定酶。与酶浓度无关，可以鉴定酶。酶酶底物底物Km(mmol/L)Km(mmol/L)脲酶脲酶尿素尿素2525溶菌酶溶菌酶6-N-6-N-乙酰葡萄糖胺乙酰葡萄糖胺0.0060.006葡萄糖葡萄糖-6-6-磷酸脱磷酸脱氢酶氢酶6-6-磷酸磷酸- -葡萄糖葡萄糖0.0580.058胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶苯甲酰酪氨酰胺苯甲酰酪氨酰胺2.52.5甲酰酪氨酰胺甲酰酪氨酰胺12.012.0乙酰酪氨酰胺乙酰酪氨酰胺32.032.0基因工程研究所基因工程研究所79定义：定义：Km等于酶促反应速率
40、为最大反应等于酶促反应速率为最大反应 速率一半时的底物浓度。速率一半时的底物浓度。意义：意义：pKm是酶的特征性常数之一，只与酶的结是酶的特征性常数之一，只与酶的结构、底物和反应环境（如，温度、构、底物和反应环境（如，温度、pH、离子强度）有关，与酶的浓度无关；离子强度）有关，与酶的浓度无关； pKm可近似表示酶对底物的亲和力；可近似表示酶对底物的亲和力；p同一酶对于不同底物有不同的同一酶对于不同底物有不同的Km值。值。Km值值基因工程研究所基因工程研究所80丙酮酸浓度较低时：丙酮酸浓度较低时：代谢哪条途径决定于代谢哪条途径决定于Km最小的酶最小的酶乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶（1.710-5）丙酮酸
41、脱氢酶丙酮酸脱氢酶（1.310-3）丙酮酸脱羧酶丙酮酸脱羧酶（1.010-3）丙酮酸丙酮酸乳酸乳酸乙酰乙酰CoA乙醛乙醛一底物多酶反应一底物多酶反应基因工程研究所基因工程研究所81练习：已知某酶的练习：已知某酶的Km值为值为0.05mol.L-1，要使，要使此酶所催化的反应速度达到最大反应速度的此酶所催化的反应速度达到最大反应速度的80时底物的浓度应为多少？时底物的浓度应为多少？ 计算一定速度下的底物浓度：计算一定速度下的底物浓度：如某一反应要求如某一反应要求的反应速度达到最大反应速度的的反应速度达到最大反应速度的99%，则，则S=99Km基因工程研究所基因工程研究所已知某种酶的Km值为25m
42、molL，欲使酶促反应达到最大反应速度的50，该底物浓度应为 A12.5 mmolL B25.0 mmolL C37.5 mmolL D50.0 mmolL E75.0 mmolL答案：答案：B 基因工程研究所基因工程研究所某一酶促反应的速度为最大反应速度的80时，底物浓度等于 A2Km B1Km C3Km D4Km E5Km答案：答案：D 基因工程研究所基因工程研究所844. Vmax定义：定义：Vmax是酶完全被底物饱和时的反应速度，是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。一定酶浓度下，酶对特与酶浓度成正比。一定酶浓度下，酶对特定底物的定底物的Vmax也是一个常数。也是一个常数。意
43、义：意义：Vmax=K3 E如果酶的总浓度已知，可从如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算计算酶的转换数酶的转换数(turnover number)，即动力学，即动力学常数常数K3。基因工程研究所基因工程研究所85定义定义 当酶被底物充分饱和时，单位时间内当酶被底物充分饱和时，单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。子数。意义意义 可用来比较每单位酶的催化能力。可用来比较每单位酶的催化能力。 酶的转换酶的转换数数基因工程研究所基因工程研究所86（三）（三）m值与值与max值的测定值的测定1. 双倒数作图法双倒数作图法(double reciprocal p
44、lot)，又称为，又称为 林林-贝氏贝氏(Lineweaver- Burk)作图法作图法（林（林-贝氏方程）贝氏方程） 两边同取倒数两边同取倒数Vmaxv1=Km.1S +Vmax1基因工程研究所基因工程研究所87酶动力学的双倒数图线酶动力学的双倒数图线基因工程研究所基因工程研究所882. Hanes作图法作图法在林在林-贝氏方程基础上，两边同乘贝氏方程基础上，两边同乘S-Km 基因工程研究所基因工程研究所89二、底物足够时酶浓度对反应速率的影响二、底物足够时酶浓度对反应速率的影响呈直线关系呈直线关系 在酶促反应系统中，当底物浓度大大超在酶促反应系统中，当底物浓度大大超过酶的浓度，酶被底物饱和
45、时，反应速率达过酶的浓度，酶被底物饱和时，反应速率达最大速率。此时，反应速率和酶浓度变化呈最大速率。此时，反应速率和酶浓度变化呈正比关系。正比关系。基因工程研究所基因工程研究所90当当SE，酶可被，酶可被底物饱和的情况下，反底物饱和的情况下，反应速率与酶浓度成正比应速率与酶浓度成正比关系式为：关系式为：V = k3 E当当SE时，时，Vmax = k3 E酶浓度对反应速率的影响酶浓度对反应速率的影响0 V E 基因工程研究所基因工程研究所91三、温度对反应速率的影响具有双重性三、温度对反应速率的影响具有双重性上图反映出温度如何影响酶活力？产产物物累累积积量量相相对对酶酶活活性性 最适温度最适温
46、度 最适温度最适温度w动物酶动物酶 3540w植物酶植物酶 4050w微生物微生物 大部分大部分 4050w个别高温菌个别高温菌 90以上以上基因工程研究所基因工程研究所92 双重影响双重影响 最适温度最适温度 (optimum temperature)：酶促反应速度最酶促反应速度最快时的环境温度。快时的环境温度。酶酶活活性性0.51.02.01.50 10 20 30 40 50 60 温度温度 C 温度对淀粉酶活性的影响温度对淀粉酶活性的影响基因工程研究所基因工程研究所93酶的最适温度不是酶的特征性常数，它与反酶的最适温度不是酶的特征性常数，它与反应进行的时间有关。应进行的时间有关。酶的活
47、性虽然随温度的下降而降低，但低温酶的活性虽然随温度的下降而降低，但低温一般不使酶破坏。温度回升后，酶又恢复其一般不使酶破坏。温度回升后，酶又恢复其活性。活性。 * * 低温的应用低温的应用基因工程研究所基因工程研究所94四、四、pH通过改变酶和底物分子解离状态影响通过改变酶和底物分子解离状态影响反应速率反应速率酶催化活性最高时反应体系的酶催化活性最高时反应体系的pH称为酶促反应称为酶促反应的的最适最适pH (optimum pH)。 0酶酶活活性性 pH胃蛋白酶胃蛋白酶 淀粉酶淀粉酶 胆碱酯酶胆碱酯酶 246810基因工程研究所基因工程研究所95最适最适pH不是酶的特征性常数，它受底物浓不是酶
48、的特征性常数，它受底物浓度、缓冲液种类与浓度、以及酶纯度等因度、缓冲液种类与浓度、以及酶纯度等因素的影响。素的影响。 基因工程研究所基因工程研究所96酶的抑制剂酶的抑制剂(inhibitor)凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质统称为酶的抑制剂。白变性的物质统称为酶的抑制剂。 区别于酶的变性区别于酶的变性抑制剂对酶有一定选择性，而变性的因抑制剂对酶有一定选择性，而变性的因素对酶没有选择性素对酶没有选择性五、抑制剂可逆地或不可逆地降低酶促五、抑制剂可逆地或不可逆地降低酶促反应速率反应速率基因工程研究所基因工程研究所97抑制作用的类型抑制作用的类型 不可
49、逆性抑制不可逆性抑制 (irreversible inhibition) 可逆性抑制可逆性抑制 (reversible inhibition)根据抑制剂和酶结合的紧密程度不同，根据抑制剂和酶结合的紧密程度不同，酶的抑制作用分为：酶的抑制作用分为：竞争性抑制竞争性抑制 (competitive inhibition)非竞争性抑制非竞争性抑制 (non-competitive inhibition)反竞争性抑制反竞争性抑制 (uncompetitive inhibition)基因工程研究所基因工程研究所98（一）不可逆性抑制剂主要与酶共价结合（一）不可逆性抑制剂主要与酶共价结合概念：概念：抑制剂通
50、常以共价键与酶活性中心的必需抑制剂通常以共价键与酶活性中心的必需基团相结合，使酶失活，基团相结合，使酶失活，不能用透析、超滤等不能用透析、超滤等方法予以除去。方法予以除去。举例：举例： 有机磷化合物有机磷化合物 羟基酶羟基酶解毒解毒 解磷定（解磷定（PAM）重金属离子及砷化合物重金属离子及砷化合物 巯基酶巯基酶解毒解毒 二巯基丙醇二巯基丙醇（BAL） 1. 专一性不可逆抑制剂专一性不可逆抑制剂 这类抑制剂选择性强，只能这类抑制剂选择性强，只能专一性地与酶活性专一性地与酶活性中心的某些基团中心的某些基团不可逆结合，引起酶的活性丧失。不可逆结合，引起酶的活性丧失。+E OHROPOXROROPOO
