1、蛋白质的化学修饰蛋白质的化学修饰用化学修饰的方法研究蛋白质的结构与功能已经成为一种重要的基础手段，蛋白质侧链基团的修饰是通过选择性的试剂或亲和标记试剂与蛋白质分子侧链上特定的功能基团发生化学反应而实现的，这是蛋白质化学基础研究的一个方向。广义上，凡涉及共价或部分共价键的形成或破坏的转变都可看作是蛋白质的化学修饰，其内容也应当包括质子转移、氢同位素交换、金属螯合、酶底物结合以及氢键合等。狭义上，特指选择性化学修饰。即在较温和的条件下，以可控制的方式使一种蛋白质同某些化学试剂起特异反应，以引起单个氨基酸残基或其功能基发生共价的化学变化。优点在于：单个修饰的实验条件远较多个修饰易于控制，实验结果也容
2、易解释。侧链基团化学修饰的一个非常重要的作用是用来探测活性部位的结构。反应试剂与蛋白质分子接触并发生化学反应，与蛋白质分子的侧链氨基酸残基共价连接形成某些可探测的报告基团。理想情况下，修饰试剂只是有选择地与某一特定的残基反应，很少或几乎不引起蛋白质分子的构象变化。在此基础上，从该基团的修饰对蛋白质分子的生物活性所造成的影响，就可以推测出被修饰的残基在该蛋白质分子中的功能。在20种构成蛋白质的常见氨基酸中，只有具有极性的氨基酸残基的侧链基团才能够进行化学修饰，这些基团的反应性取决于它们的亲核性。很多因素都可以影响亲核性的大小，这些因素对蛋白质的化学修饰反应会造成较大的影响。化学修饰的主要作用化学
3、修饰的主要作用(1)探测酶和蛋白质的必需氨基酸残基的性质和数目。蛋白质的化学修饰可以很快地揭示蛋白质分子中哪些侧链基团是表现酶活性所必需的。这对于目前空间结构尚未搞清楚的蛋白质分子尤为重要。它可以帮助人们初步认识该蛋白质分子中哪些残基能处于活性部位并为其表现功能所必需。这将为空间结构的解析提供重要的信息。(2)用于蛋白质纯度分析与鉴定。(3)用于蛋白质一级序列的测定。如在蛋白质序列分析时，首先必须了解N-末端的残基。多肽链N-末端残基的分析常用的修饰试剂有二硝基氟苯、丹氟酰氯，即二甲基氨基萘磺酰氯(DNS)和苯异硫氰酸酯(PITC)。PITC也是测定蛋白质序列的Edman降解法的关键试剂。此外
4、，在氨基酸组成分析中的半胱氨酸残基的测定、二硫键的断裂、侧链基团的保护等均采用各种方法的化学修饰。(4)探测蛋白质分子的构象变化和运动性。利用化学修饰试剂的反应，探测某些基因的暴露程度，以分析蛋白质分子的构象变化，如利用5,5-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)测定不同去折叠状态的反应巯基数目，可以探测其去折叠的程度，还可以通过监测A412随时间的变化探测去折叠的动力学。(5)利用亲和标记探测活性部位局部区域的构象状态。有些化学试剂可专一性地修饰酶的活性部位的侧链基团，从而在活性部位引入探测基团(如具有荧光性或顺磁性基团)，以探明活性部位的构象状态及构象变化。(6)探索蛋白质和酶作用的化学机
5、理。通过化学修饰可以探明哪些侧链基团参与了酶的催化作用，为探明其作用的化学机理和催化历程起了重要的作用，也为药物设计提供了分子基础。(7)利用共价交联技术研究蛋白质分子的拓扑学、构象的运动性以及寡聚蛋白质的亚基结合状态。(8)利用蛋白质晶体的重金属衍生物(也属于一种化学修饰)，进行X衍射晶体结构分析。(9)用于蛋白质和酶分子的固定化。在蛋白质和酶分子的固定化技术中，除部分用物理方法固定外，主要的还是采用化学方法的固定化。其本质是蛋白质和酶的化学修饰，其中包括载体偶联法和共价交联法。这类化学修饰希望只修饰非必需基团，设法避免必需基团的破坏，以保持蛋白质和酶的活性。(10)定向改造蛋白质分子的性质
6、。用基因定点突变技术，改变蛋白质主链的化学结构，在蛋白质的肽链结构中删去、替换或增加某些氨基酸残基，以研究其结构与功能的关系，并可定向地进行蛋白质的改造。此外，还可以通过侧链基团的化学修饰，改造蛋白质分子的性质，如使其激活、失活，或使其稳定性提高等。总之蛋白质化学修饰仍然作为一种有效的研究手段广泛地应用于基础性研究和应用研究。化学修饰中的问题化学修饰中的问题化学修饰具有复杂性，其结果解释不易 对一定类型的功能基很少有绝对的特异修饰剂。换言之，被同一种试剂修饰的氨基酸残基，会因其存在的状态不同而出现反应差异。能修饰同类氨基酸的试剂，其本身的反应性也有不同，修饰的结果往往要受不同类型实验的影响。
7、设计能对酶的催化部位、底物的结合部位起作用的修饰剂常常是非常困难的，有时是不可能的。 在了解修饰剂与酶失活的关系上，除应注意其活性部位残基的直接修饰外，还必须考虑修饰过程中引起的酶蛋白位阻的间接影响，分析是否有同酶活性无关的残基起非特异性反应等等。但无论如何，应该记住一个基团的修饰反应所需的特定反应条件暗示了蛋白质分子内的特定的环境。关键问题关键问题设计和筛选出某些使单独一类氨基酸残基或功能基发生有效修饰的特异性试剂，即选择性化学修饰剂（基团选择性试剂）选择性修饰试剂首先必须要能够与某一特定的氨基酸残基的侧链基团发生化学反应，并形成紧密的共价连接。人们已经找到许多不同氨基酸残基侧链基团的特定的
8、修饰试剂并应用到蛋白质的化学修饰的研究中。然而目前这类反应试剂的专一性不够，即使试剂对某一基团的反应是专一性的，也仍然有多个同类残基与之进行反应，使得对某个特定残基的选择性修饰非常困难。解决方法解决方法为了克服这一缺陷，人们开始使用亲和性标记试剂，这些化合物是具有化学反应性的蛋白质分子的底物或配体的类似物。由于结构的相似性，它们对底物或配体的结合部位具有一定的亲和性，因而能够选择性地结合在蛋白质分子的特定部位。另外，由于它们的化学反应性，能够与蛋白质分子共价地结合。这类反应试剂具有饱和性，与底物或天然配体竞争蛋白质分子的结合位点。由于这些试剂对结合部位的亲和性，即高度的位点专一性，因此能否与某
9、一特定的氨基酸残基侧链基团反应已经不是主要问题。亲和性标记试剂中最重要的是光亲和标记和自杀性抑制剂两种类型。光亲和标记试剂的反应可以用光照来引发，因此它们的反应性可以被很好地控制，其参与反应的成分为自由基，可以与它们附近几乎所有的基团反应，这些标记试剂也可以与非极性的侧链基团相结合。自杀性抑制剂作为底物是没有反应活性的，一旦它们转变成产物，就会产生1个可反应基团，因此它们标记的是活性部位附近的侧链基团。由于它们的这种特性，自杀性抑制剂可以被用来作为治疗某些疾病的有效药物。酰化及其相关反应酰化及其相关反应这类化学修饰试剂如乙酰咪唑、二异丙基磷酰氟、酸酐磺酰氯、硫代三氟乙酸乙酯和O-甲基异脲等，它
10、们在室温(2025)，pH 4.59.0的条件下可与蛋白质的某些侧链基团发生酰基化反应。被作用的蛋白质分子侧链基团有氨基、羟基、巯基以及酚基等。烷基化反应烷基化反应这类试剂的特点常常是带有活泼的卤素原子，由于卤素原子的电负性，使烷基带有部分正电荷，很容易导致蛋白质分子的亲核基因(例如-NH2，-SH等)发生烷基化。属于这类修饰试剂的有：2,4-二硝基氟苯、碘代乙酸、碘代乙酰胺、苯甲酰卤代物和碘甲烷等。被作用的蛋白质分子的侧链基团有氨基、巯基、羧基、硫醚基和咪唑基等。氧化和还原反应氧化和还原反应这类试剂具有氧化性，能将侧链基团氧化，属于这类试剂的有H2O2，N-溴代琥珀酰亚胺等，有些试剂具有很强
11、的氧化性，往往容易使肽链断裂，因此在修饰反应中要控制好氧化条件。光敏剂存在下的光氧化是一种比较温和的氧化作用。易受氧化作用的侧链基团有巯基、硫醚基、吲哚基、咪唑基以及酚基等。另外还有一类主要作用于二硫键的还原剂。这类修饰试剂有2硫基乙醇、硫基乙酸和二硫苏糖醇(DTT)等。值得提出的是连四硫酸钠或连四硫酸钾(Tetrathionate)是一种温和的氧化剂，因此在化学修饰反应中常用来作为-SH的可逆保护剂。芳香环取代反应芳香环取代反应蛋白质氨基酸残基的酚羟基在3和5位上很容易发生亲电取代的碘化和硝化反应。这类修饰反应的一个典型的例子是四硝基甲烷(TNM，Tetranitro-methane)，它可
12、以作用于酪氨酸的酚羟基，形成3-硝基酪氨酸的衍生物。这种产物有特殊的光谱，可用于直接的定量测定。蛋白质肽链的裂解蛋白质肽链的裂解另外还有一些蛋白质与化学试剂的重要反应，如溴化氰裂解，在自发和诱导重排的条件下主要导致肽键的断裂。溴化氰(CNBr)裂解甲硫氨酸残基的羧基侧链肽键的反应机理如下图所示：巯基的化学修饰巯基的化学修饰由于巯基具有很强的亲核性，成为蛋白质分子中最容易反应的侧链基团，因此人们最先研究它的特异性修饰试剂并研究了巯基在酶催化过程中的重要作用以及在一些蛋白质中对维持亚基间相互作用所做的贡献。烷基化试剂是一种重要的巯基修饰试剂，特别是碘乙酸和碘乙酰胺。在蛋白质的氨基酸组成分析和测序前
13、，通常要用碘乙酸来使巯基基团羧甲基化，以防止半胱氨酸的降解，而且羧甲基化的半胱氨酸很容易被氨基酸分析仪所识别。其它一些卤代酸和卤代酰胺如溴代乙酸也被应用来修饰巯基，但反应比碘乙酸和碘乙酰胺要慢。然而，在卤代酸与巯基反应的同时，尽管反应能力比较弱，咪唑基团也会与卤代酸结合，核糖核酸酶中咪唑基团的反应就是一个明显的例子。N-乙基马来酰亚胺是一种有效的巯基修饰试剂。该反应具有较强的专一性并伴随光吸收的变化，可以很容易通过光吸收的变化确定反应的程度。另外，N-取代马来酰亚胺自旋标记物可以作为自旋探针来研究蛋白质分子构象变化的情况，如曾经用来有效地研究了丙酮酸脱氢酶复合体系臂的运动性。5,5-二硫-2-
14、硝基苯甲酸(DTNB)，又称为Ellman试剂，目前已成为最常用的巯基修饰试剂。DTNB可以与巯基反应形成二硫键，使蛋白质分子上标记1个2-硝基-5-硫苯甲酸(TNB)，同时释放1个有颜色的TNB阴离子。该阴离子在412 nm具有很强的吸收( =1.36104(molL)-1cm-1，pH =8.0)，可以很容易通过光吸收的变化来监测反应的程度。DTNB也可以用来定量检测溶液中硫化氢的含量，只是l mol硫化氢与1 mol DTNB反应将产生2 mol TNB和1 mol硫。由于定点诱变的迅速发展，在目前蛋白质的结构与功能的研究中，特别是半胱氨酸的侧链基团的化学修饰有被定点诱变的方法取代的趋势
15、。 但Ellman试剂仍然是目前最常用的定量测定蛋白质分子巯基数目试剂，用以研究巯基改变程度和巯基所处环境的探测。Ellman试剂还被用于探测蛋白质分子去折叠与再折叠时的构象变化状态以及跟踪构象变化的过程。由于TNB的pKa为4.4，在pH 8.0附近时带负电荷，与处于碱性环境中的巯基很难反应，而在pH较低的情况下，不能再用412nm处的光吸收定量，使得DTNB不适于作为酸性介质条件下的滴定剂或反应探针。为此，使用含有2-二硫砒啶和4-二硫砒啶的试剂来克服，如对称结构的2,2-二硫二砒啶，4,4-二硫二砒啶，6,6-二硫二尼克酸和2,2-二硫对(5-硝基砒啶)。这些巯基试剂作为“双质子状态”亲
16、电子试剂，很容易与由于环境中其它基团造成的高pH条件下解离的巯基或硫醇阴离子反应，与硫蛋白共价联结，并产生光谱效应。上述替代DTNB的试剂中， 2,2-二硫二砒啶(2-PDS)和4,4-二硫二砒啶(4-PDS)用得较为广泛。每修饰1分子巯基，同时释放1分子砒啶硫酮。对于2-PDS释放的2-砒啶硫酮(2-TP)在343nm处有光吸收；而4 -砒啶硫酮(4-TP)在324nm处有光吸收。用4-PDS滴定人肌肌酸激酶的差吸收光谱由于4,4-二硫二砒啶在324nm处无吸收，产生的4-砒啶硫酮在280nm也没有明显的吸收，而试剂与蛋白质侧链巯基的反应又是定量进行的，因此可以不分离未反应试剂而直接滴定蛋白
17、质溶液，并根据324nm处光吸收值来确定不同的修饰程度。样品光路为溶于50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)中的人肌肌酸激酶，酶浓度为12.5mol/L，参照光路为同样的缓冲液。图中的吸收光谱自下而上，其4-PDS与人肌肌酸激酶的分子比分别为0; 0.2; 0.4; 0.8; 1.2; 1.6; 2.4; 2.8; 3.2; 3.6; 4.0; 5.0 巯基的氧化也是一种专一性较高的化学修饰手段。过氧化氢一般用来氧化巯基形成二巯键或在较大量时形成磺酸。在一定的条件下，过氧化氢与蛋白质巯基反应也可以生成次磺酸。有机汞试剂是最早使用的巯基修饰试剂之一，其中最常用的是对氯汞苯甲酸，该化合物
18、溶于水中形成羧基衍生物，与巯基相互作用时在255nm处光吸收具有较大的增强效应。其中2-氯汞-4-硝基苯酚(MNP)与蛋白质分子中的侧链巯基反应很快，并在395nm处产生一负差吸收峰。另外，人们还利用溴代乙胺或氮丙啶将半胱氨酸残基转变成可水解的胰蛋白酶敏感的S-(2-氨基乙基)半胱氨酸残基。氨基的化学修饰氨基的化学修饰非质子化的赖氨酸的-氨基是蛋白质分子中亲核反应活性很高的基团。 -氨基的pKa值一般为10，由于微环境的影响，蛋白质分子中也可能存在低pKa值的赖氨酸残基，这些残基具有更强的可反应性，因而可以被选择性地修饰。在草酰乙酸脱羧酶中就存在一个pKa值为5.6的可反应赖氨酸残基。有许多化
19、合物都可用来修饰赖氨酸残基，三硝基苯磺酸(TNBS)就是其中非常有效的一种。TNBS与赖氨酸残基反应，在420nm和367nm能够产生特定的光吸收。有人用TNBS标记了GSH转移酶的1个反应活性很高的赖氨酸残基，证实了在酶的活性部位GSH结合区域存在一个赖氨酸残基，即Lys44。目前，氨基的烷基化已经成为一种重要的赖氨酸修饰方法，这些试剂包括有卤代乙酸、芳基卤和芳族磺酸，或者在氢的供体(如硼氢化钠，硼氢化氰或硼氨)存在的条件下使蛋白质分子与醛或酮反应，称为还原性烷基化。赖氨酸残基的还原性烷基化所使用的羰基化合物取代基的大小对修饰的结果具有很大的影响。在硼氢化钠的存在下，用不同的羰基试剂使卵类粘
20、蛋白、溶菌酶、卵转铁蛋白的赖氨酸残基烷基化，修饰程度为40100。其中丙酮、环戊酮、环己酮和苯甲醛为单取代，而丁醛有2050的双取代，甲醛则几乎为100的双取代。这3种蛋白的甲基化和异丙基化的衍生物仍是可溶性的，并且仍然具有几乎全部的生物活性。近来的研究表明硼氨及其衍生物可以作为还原性烷基化的各种还原剂，其中比较成功的两种结构为二甲硼氨和三甲硼氨。利用氰酸盐使氨基甲氨酰化也是一种常用的修饰赖氨酸残基的手段，这种方法的一个主要的优点是氰酸根离子很小，比较容易接近所要修饰的基团。氰酸盐也能够与半胱氨酸和组氨酸残基反应，形成不稳定的甲氨酰衍生物，也有报道说胰凝乳蛋白酶活性部位的丝氨酸也可被甲氨酰化。
21、维生素B6的天然衍生物磷酸砒哆醛(PLP)是一种非常专一的赖氨酸修饰试剂，可逆反应生成的席夫碱可通过硼氢化钠还原来固定，反应可通过光吸收(还原的磷酸砒哆衍生物的最大吸收位在325nm处)或3H-H2B还原来定量。一个典型的例子是用PLP确定磷酸葡萄糖异构酶的必需赖氨酸残基，并发现该酶的每一个亚基只能特定地结合一个分子的PLP。兔肌磷酸葡萄糖异构酶经5-磷酸砒哆醛和硼氢化钠处理后的吸收光谱氨基的化学修饰在蛋白质序列分析中占了极其重要的地位。在蛋白质序列分析中，首先必须测定整个肽链的N-末端和C-末端残基。用于多肽链N-末端残基的测定的化学修饰方法最常用的有：(1)2,4-二硝基氟苯(DNFB)法
22、DNFB与氨基的反应被广泛地应用于蛋白质分子的N-末端氨基酸残基的测定。多肽链N-末端的游离NH2与DNFB(Sanger试剂)反应后，生成DNP-多肽，由于DNFB与氨基酸形成的键对酸水解的稳定性远比肽键高，因此DNP-多肽经水解后，只有N-末端氨基酸为黄色的DNP-氨基酸衍生物，其余都是游离氨基酸，只要鉴别所生成的DNP-氨基酸，便可确定多肽链N-末端的氨基酸残基。虽然侧链的-NH2和酚基等也能与DNFB反应，但生成的侧链取代衍生物如： -DNP氨基酸当用有机溶剂(如乙酸乙酯)抽提时将与游离氨基酸一起留在水相中，因而容易和有机相中的-DNP氨基酸区分开来。待分析的DNP-氨基酸可用纸层析、
23、薄层层析或高效液相色谱进行分离鉴定和定量测定。(2)丹磺酰氯(DNS)法DNS是二甲氨基萘磺酰氯，简称丹磺酰氯(Dansyl chloride)。其方法和原理同DNFB法，只是用DNS代替DNFB。由于丹磺酰氯具有强烈的荧光，灵敏度比DNFB高100倍，并且水解后的DNS-氨基酸不必提取，可直接用于纸电泳和薄层层析加以鉴定。(3)苯异硫氰酸酯(PITC)法：PITC能与多肽链的N-末端游离氨基反应，可鉴定N-末端残基。更重要的是它可以用于序列测定。此法首先是由.Edman于1950年提出的，因此此法后人称之为Edman降解法。PITC与多肽链的游离末端氨基作用时，反应可分为以下3步：第一步是偶
24、联(coupling)反应, 反应在弱碱性介质中进行，因为PITC只能与末质子化的基团反应：第二步是环化断裂反应：第一步反应中形成的PTC-肽在无水强酸介质如三氟乙酸中，最靠近PTC基的肽键将发生断裂，同时，PTC-氨基酸残基环化成噻唑啉酮苯胺衍生物。反应必须在无水条件下进行，否则，其它肽键也将被水解。第三步是转化反应：第二步中生成的ATZ不稳定，难于用来鉴定该氨基酸，因此，在酸性水溶液中将它转变为PTH-氨基酸。转化过程中实际又分两步进行，首先水解生成PTC-氨基酸，然后环化成PTH-氨基酸，这是一个非常稳定的化合物。所有PTH-氨基酸在紫外区有强吸收，最大吸收值在268nm处。PTH-氨基
25、酸可利用各种层析技术分离。由于PITC与肽链的游离末端氨基结合后，只是减弱紧挨PTC基的末端残基羧基侧的肽键，因此在无水强酸作用下，只切下与PITC反应的那个氨基酸残基，这时，剩下的减少了一个残基的肽链便在它的N端暴露出一个新的游离末端氨基，又可参加第二轮反应，然后再切下第二残基，如此循环。这样，如果进行n轮反应，就能测出n个残基的顺序。Edman降解法测定序列的操作现已实现自动化，一次能连续测出6070个残基的肽段顺序。此法灵敏度高，可用于微量分析，最低用量可在几个pmol水平上。羧基的化学修饰羧基的化学修饰由于羧基在水溶液中的化学性质使得蛋白质分子中谷氨酸和天门冬氨酸的修饰方法很有限，产物
26、一般是酯类或酰胺类。在一些情况下，它们也可与赖氨酸残基的-氨基通过酰胺键相连。水溶性的碳化二亚胺类特定修饰蛋白质分子的羧基基团，目前已成为一种应用最普遍的标准方法，它在比较温和的条件下就可以进行。14C甘氨酸乙酯酰胺化后在氨基酸分析仪上将会出现1个新的峰。在一定的条件下，14C甘氨酸乙酯也可以与丝氨酸、半胱氨酸和酪氨酸反应。抗冻糖肽8的末端羧基与1-乙基-3-(3-二甲氨正丙基)碳化二亚胺反应结合上乙醇胺成为N-(2-羟胺)，仍然具有90的剩余活力，说明该糖肽上羧基所带的电荷为非必需的。羧基也可以与硼氟化三甲烊盐(Trimethyloxonium fluoroborate)反应生成甲酯。胃蛋白
27、酶与14C硼氟化三甲烊盐在pH5.0的条件下反应，酶的活力完全丧失，研究结果表明该酶有两个羧基为其必需基团。也有报道硼氟化三甲烊盐可以与组氨酸和甲硫氨酸反应。用甲醇HCl的酯化反应咪唑基的化学修饰咪唑基的化学修饰组氨酸残基的咪唑基可以通过氮原子的烷基化或碳原子的亲核取代来进行修饰。由于组氨酸残基位于许多酶的活性中心，因此有大量关于组氨酸残基修饰的报道。组氨酸残基的咪唑基的修饰主要有两种方法，第一种是光氧化。然而，光氧化的特异性很低，不但与组氨酸残基反应，而且与甲硫氨酸、色氨酸以及少量的酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基进行反应。碱性亚甲蓝和玫瑰红是该方法常用的两种试剂。焦碳酸二乙酯(DPC，Dieth
28、ylpyrocarbonate)是最常用的修饰组氨酸残基的试剂。该试剂在接近中性的情况下表现出比较好的专一性，与组氨酸残基反应使咪唑基上的1个氮羧乙基化，并且使得在240nm处的光吸收增加。该取代反应在碱性条件下是可逆的，可以重新生成组氨酸残基。在水溶液中，特别是在高pH的情况下，该试剂的稳定性不够好。碘化反应碘化反应碘代乙酸碘代乙酸酚和脂肪族羟基的化学修饰酚和脂肪族羟基的化学修饰酪氨酸残基的修饰既可以是酚羟基的修饰，也可以是芳香环上的取代修饰。酚羟基的修饰一般是可逆的，一些甚至只能短暂的存在或者在除去反应试剂和纯化产品时就可逆回去了。简单的酯化反应是常用的一种方法，在弱碱性或羟胺溶液中就可以
29、重新生成酚羟基。有人曾用N-乙酰基咪唑对磷酸化酶 b进行化学修饰，发现别构抑制剂AMP对酶活性有明显的保护作用。与酚羟基修饰不同，芳香环取代则可以生成比较稳定的产物，比较早使用的最好的方法是碘化作用。在温和的条件下，碘也会与蛋白质分子的组氢酸和半胱氨酸残基发生反应；在剧烈的条件下，色氨酸和甲硫氨酸残基也会受到影响。四硝基甲烷(TNM)由于反应的高度专一性和反应条件比较温和，已经成为酪氨酸残基修饰最常用的修饰试剂，它与酪氨酸残基反应生成离子化的发色基团3-硝基酪氨酸衍生物。TNM也可以与蛋白质分子中的半胱氨酸残基反应，在一定的条件下，还可以与色氨酸、组氨酸和甲硫氨酸残基反应。苏氨酸和丝氨酸残基的
30、专一性化学修饰研究得相对比较少，它们的羟基一般都可被修饰酚羟基的修饰试剂所修饰，只是反应的条件要更严格一些，而一旦反应，生成的产物要比与酚羟基生成的产物更稳定。丝氨酸修饰比较著名的例子是在丝氨酸蛋白酶活性部位的丝氨酸残基对酰化试剂如二异丙基氟磷酸表现出的较高的反应性。用二异丙基氟磷酸修饰胰凝乳蛋白酶时，如果控制好温和的反应条件，胰凝乳蛋白酶分子中的全部丝氨酸残基(28个)中，只有1个Ser 195与试剂DFP作用，修饰后，酶活性也就丧失。可见，这个Ser195残基处于酶的活性部位的特殊结构中。胍基的化学修饰胍基的化学修饰精氨酸残基含有1个强碱性的胍基，在结合带有阴离子底物的酶的活性部位中起着重
31、要作用，因此对精氨酸残基的修饰研究是非常重要的。但是，由于精氨酸残基的强碱性，因而与大多数试剂很难发生修饰反应，反应所需的高pH值也会导致蛋白质结构的破坏，而一些二羰基化合物则能够在中性或弱碱性的条件下与精氨酸反应，所以关于精氨酸残基的化学修饰试剂的研究大多集中在二碳基化合物上。丁二酮和1,2-环己二酮与胍基反应可逆地生成精氨酸丁二酮复合物，该产物可以与硼酸结合而稳定下来。上述反应要在黑暗中进行，因为丁二酮可以作为光敏性反应试剂破坏其它残基，特别是色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基。苯乙二醛也是用来对精氨酸残基进行修饰的，通常是两个分子的苯乙二醛与1个精氨酸残基不可逆地结合，该试剂与-氨基也有一定的反
32、应性。由于14C-苯乙二醛比较容易合成，因此它与蛋白分子的结合就很容易跟踪。有人发现苯乙二醛与精氨酸模型化合物的反应在碳酸氢盐缓冲液中反应较快，并且在该条件下与-氨基不发生反应。一般认为，与带负电荷的底物或辅助因子作用的酶分子在它的结合位点上通常都含有带正电的精氨酸残基。用苯乙二醛、丁二酮和环己二酮修饰蛋白质分子的结果都证实了这一假说。用这些试剂修饰卵转铁蛋白和人血清转铁蛋白的精氨酸残基的结果表明，在每一个铁原子的结合位点都有1个必需的精氨酸残基。吲哚基的化学修饰吲哚基的化学修饰由于色氨酸的反应性要比一些亲核基团如巯基和氨基差，而且色氨酸残基一般是位于蛋白质分子的内部，所以色氨酸残基不与通常使
33、用的一些试剂反应。但色氨酸吲哚基可以与一些试剂发生取代反应或者被氧化裂解。光氧化反应光氧化反应一种常用的修饰色氨酸残基的试剂是N溴代琥珀酰亚胺(NBS)，可以使吲哚基团氧化成羟吲哚衍生物，反应可以通过280nm处光吸收的减少而进行监测。但是酪氨酸残基也可与该修饰试剂发生反应，并且干扰光吸收的测定。Koshland试剂：2-羟基-5-硝基苄溴(HNBB)作为色氨酸残基的修饰试剂。该试剂可以与色氨酸残基反应生成具有光吸收性的羟基硝基苯衍生物，并且光吸收对微环境的变化很敏感。但值得注意的是Koshland试剂不仅可以与色氨酸残基作用，而且也很容易与半胱氨酸巯基作用，而且两者的吸收光谱相似，因此在修饰
34、色氨酸残基时应对巯基进行可逆保护。 HNBB的水溶性较差，有时使修饰反应较难进行。最近发展起来一种溶解性较好的试剂是二甲基(-2-羟基-5-硝基苄基)溴化锍(dimethyl-(2-hydroxy-5-nitrobenzyl) sulfonium bromide)。这个试剂与2-羟基-5-硝基苄溴的作用相同，在蛋白质色氨酸残基上引入1个HNB基团，因此也称为Koshland试剂II。不同之处它是一种锍盐，易溶于水，有利于试剂与蛋白质分子的作用。当肌酸激酶用连四硫酸钠将巯基氧化保护起来，然后用二甲基(-2-羟基-5-硝基苄基)溴化锍处理保护后的肌酸激酶，在色氨酸残基被修饰后，分离掉过量的未反应试
35、剂，再用DTT将SH重新还原出来。4-硝基苯基硫氯也可用来修饰吲哚基。近来，4-硝基苯基硫氯的类似物异双功能反应试剂2-硝基-4-叠氮苯基硫氯被用来修饰色氨酸残基，可以在胰高血糖素的单个色氨酸残基上附加一个光反应性的叠氮硝基苯基团。胰高血糖素不含半胱氨酸残基，只有色氨酸残基被修饰。硫醚基的化学修饰硫醚基的化学修饰蛋氨酸残基的化学修饰主要是由于硫醚的硫原子的亲核性所引起的，尽管该残基的极性较弱。在温和的条件下，很难选择性地修饰蛋氨酸残基，但可以用几种试剂氧化使蛋氨酸成为蛋氨酸亚砜，更多剧烈的氧化剂使它氧化成砜。由于在氨基酸分析中亚砜在酸水解过程中通常会生成甲硫氨酸，因此很容易被忽略掉。 在中性和
36、弱碱性的条件下，N-氯琥珀酰亚胺(NCS)和N-氯-p-甲苯磺酰胺(氯胺-T)可以使蛋白质和肽段中的甲硫氨酸氧化成甲硫氨酸亚砜。氯胺-T的选择性要比NCS好，NCS与色氨酸残基反应，而氯胺-T则不与色氨酸残基发生作用，但是两者都与半胱氨酸残基反应。甲硫氨酸残基修饰的另外一种办法是通过卤化烷基酰胺使甲硫氨酸残基烷基化，如用碘乙酰胺进行修饰。由于硫原子在一定强度的酸性溶液中(如pH约为2)处于非质子状态，因此甲硫氨酸残基可以在pH小于4的情况下被选择性地烷基化。二硫键的化学修饰二硫键的化学修饰同巯基基团类似，二硫键具有其特性可以用来进行特异的修饰，通常是通过还原的方法。这些方法通常与某些巯基修饰方
37、法相结合以阻止再氧化成二硫键或计算断裂开的二硫键的数目。用巯基乙醇将二硫键还原成游离巯基是一种很常用的方法，具有高度的选择性和长的半衰期。为使二硫键充分还原，反应应该在有变性剂的存在下进行，并且由于反应的平衡常数接近于1，必须使用大大过量的巯基乙醇。应用二硫苏糖醇(DTT)和它的差向异构体二硫赤藓糖醇(DTE)，也称作C1eland试剂，一定程度上缓解了大过量的还原试剂使用的问题。由于第二步反应是分子内反应以及还原试剂形成一个空间上有利的环状二硫键，因此反应平衡向还原蛋白质分子二硫键的方向移动。羟基使得C1eland试剂的水溶性增强，溶液因巯基的原因具有少许的臭味。二硫键经还原剂处理后，被还原
38、为琉基，一般情况下很容易自动氧化回去，因而需要经过羧甲基处理，以防止重新氧化成二硫键。过甲酸对二硫键的氧化化学修饰反应条件的影响化学修饰反应条件的影响蛋白质分子的特性反映了它的氨基酸组成的变化，功能基团的解离状态的改变使得整个复杂的维持其整体构象的吸引和排斥力的网络发生改变，进而影响到蛋白质分子的生物学活性。由于许多化学修饰反应主要是由蛋白质分子的整体结构所控制，但也为所要修饰的单个或一类基团的情况所影响，因此这些化学反应对于所处的反应条件特别敏感。在设计化学修饰反应时，仔细的选择反应条件是很关键的一步。上述修饰氨基酸侧链基团的反应与大多数有机反应不同的一个重要的特征是反应试剂要温和得多。温和
39、的反应条件是防止蛋白质分子变性的一个必要条件。除非在实验中或应用时不必考虑蛋白质生物学活性，才会采取比较剧烈的反应条件。例如，蛋白质作为某些商业粘合剂的粗原料时，其化学处理可以采用比较剧烈的条件。在所有影响蛋白质分子的化学修饰反应的条件中，pH值是最重要的一个条件，因为它决定了具有潜在反应能力的基团所处的可反应和不可反应的离子状态。温度也是一个必须要注意的条件，因为温度可以影响到活性巯基的微环境。仔细选择温度可以减小或防止一些竞争的基团反应。在低温(约-10)情况下用甲酸氧化蛋白质可以使反应限制在半胱氨酸、胱氨酸和甲硫氨酸残基上。而在较高的温度下，甲酸可以与色氨酸、酪氨酸、丝氨酸以及苏氨酸残基
40、发生反应。一些试剂在水溶液中不溶或者溶解的有限，因此需要一些有机溶剂来帮助溶解。不幸的是对于大多数蛋白质来说都不能用有机溶剂，因为有机溶剂可以使蛋白质变性，通常会产生沉淀。尽管大多数蛋白质是水溶性的，一些存在于膜上的蛋白质却只有在去垢剂的帮助下才能溶解。蛋白质化学修饰的目的各种各样，人们可以控制不同的修饰反应条件来实现不同的目的。如果研究被修饰的基团对生物学活性的影响，显然必须严格控制在温和的反应条件下进行，防止由于蛋白质分子变性而引起的失活。然而有些情况并不需要保持蛋白质的生物活性，如多肽链N-末端残基的测定，对特定残基进行荧光标记以及同位素标记后水解确定被标记的残基在序列中的位置等。 有的
41、情况下，用化学修饰的方法来定量测定蛋白质分子中某一残基的总数时，需将蛋白质分子充分伸展，以便使所有的残基暴露出来。使蛋白质分子充分伸展常用的手段是用变性剂变性。盐酸胍和脲是生物化学家所喜爱使用的变性剂。一般绝大多数球状蛋白质分子在8mol/L脲溶液中或在6mol/L盐酸胍溶液中就处于充分伸展的状态。某些残基数的测定是非常重要的，如在蛋白质氨基酸组成分析时，色氨酸残基和半胱氨酸残基在酸水解时被破坏。虽然半胱氨酸残基可通过氧化测定半胱磺酸的含量来实现，但Ellman试剂测定其含量仍广为应用，而色氨酸残基用Koshland试剂测定就更为重要。色氨酸残基往往是内埋于蛋白质分子的疏水内核，测定其总残基数
42、，必须要使蛋白质分子充分去折叠。蛋白质化学修饰的定量处理蛋白质化学修饰的定量处理用于蛋白质分子侧链基团化学修饰的试剂种类众多，但是，除少数试剂如DTNB等对被修饰基团具有高度专一性外，绝大多数试剂专一性很差，它们不仅可以修饰某一类侧链基团，同时还可以与其它类型的侧链基团反应。当然我们可以通过筛选专一性强的试剂、控制修饰反应条件以及采取对其它基因进行可逆的保护措施来提高修饰的专一性。然而，即便如此，还有一个问题，除了亲和标记外，基团专一性试剂可以不加区分地与处于蛋白质分子表面的可反应的所有同类基团作用，这些同类基团中有处于活性部位的必需基团，也有处于活性部位以外的非必需基团。这就使化学修饰的方法
43、在应用上具有很大的局限性，因此早期这一研究一直停留在定性描述的阶段，大量的实验数据不能进行定量的处理。直到本世纪60年代初，Ray-Koshland和邹承鲁分别建立了蛋白质功能基团的化学修饰与其生物学活性之间的定量关系，为化学修饰技术的应用注入了新的活力。Ray-Koshland方法建立在动力学的基础上，认为在蛋白质的化学修饰反应中，一般情况下，修饰试剂浓度远大于蛋白质的浓度，因此在修饰反应中修饰试剂的浓度变化可以忽略不计，反应均可按伪一级反应处理。这个方法的核心是分别测定蛋白质修饰反应中，基团被修饰的反应速度和蛋白质失活的反应速度。用半对数作图法比较两者反应速度常数，判断必需基团的性质和数目。邹承鲁的方法则是建立在统计学的基础之上，即根据必需和非必需基团与试剂作用的反应速度和其它性质的不同作出统计学上的处理然后作图。由于其简便、可靠、适用性广的优点，邹承鲁作图法在国际上已成为主要的方法而得到广泛的应用。
