1、未知病原菌的分离鉴定未知病原菌的分离鉴定 病原菌检测程序病原菌检测程序药物敏感试验药物敏感试验直接涂片、染色、镜检直接涂片、染色、镜检分离、鉴定分离、鉴定生化试验生化试验(书书p17-18)血清学试验血清学试验(玻片凝集法玻片凝集法)动物试验动物试验(产毒性、分离产毒性、分离)初步诊断初步诊断分子生物学技术分子生物学技术(核酸杂交、核酸杂交、PCR、基因芯片、基因芯片 核酸核酸 ) 其他检测技术其他检测技术观察培养观察培养特征特征、形态特征、形态特征病原菌抗原检测病原菌抗原检测形态结构形态结构临床标本中未知临床标本中未知病原性球菌病原性球菌的分离鉴定程序的分离鉴定程序 临床标本临床标本直接涂片
2、、革兰染色、镜检直接涂片、革兰染色、镜检( (形态形态, ,排列排列, ,染色性染色性) ) 血琼脂平板血琼脂平板/ /巧克力血琼脂平板巧克力血琼脂平板( (菌落性状菌落性状, ,溶血性溶血性, ,色素色素) )可疑菌落可疑菌落 涂片涂片, ,染色染色, ,镜检镜检 纯培养纯培养 生化反应生化反应 致病性测定致病性测定 药敏试验药敏试验 思考：思考：如何从脓拭子、咽拭子中分离并鉴定病原性球菌？如何从脓拭子、咽拭子中分离并鉴定病原性球菌？查病原查病原标本标本脓血便、肛拭子脓血便、肛拭子选择选择/鉴别培基鉴别培基生化反应生化反应血清学鉴定血清学鉴定双糖发酵双糖发酵, 橘橼酸橘橼酸盐利用试验盐利用试
3、验, ,尿素尿素, ,靛基质试验靛基质试验玻片凝玻片凝集试验集试验SSSS平板平板, ,中国兰中国兰, ,EMBEMB未知肠道杆菌的分离鉴定程序未知肠道杆菌的分离鉴定程序 伊红美蓝平板伊红美蓝平板- EMBEosin-methylene blue agar,EMB克氏双糖铁试验克氏双糖铁试验Double sugar iron slant枸橼酸盐利用试验枸橼酸盐利用试验Citrate slant吲哚试验吲哚试验Indole broth玻片凝集玻片凝集一、材料：一、材料： 5人人/组组 1.待检标本：待检标本： 脓拭子、咽拭子、尿液标本、肛拭子脓拭子、咽拭子、尿液标本、肛拭子1#、肛拭子、肛拭子2
4、# 2.培养基：培养基：血平板血平板 3块块/组组 EMB平板平板 3块块/组组 克氏双糖铁斜面克氏双糖铁斜面 3支支/组组 动力动力-靛基质靛基质-尿素半固体尿素半固体3支支/组组3.其他：其他：革兰染液、玻片、革兰染液、玻片、10%胆盐、靛基质试剂、胆盐、靛基质试剂、NS、兔血浆、兔血浆、 3%H2O2、沙门氏菌多价血清、沙门氏菌多价血清、志贺氏菌多价血清志贺氏菌多价血清二、方法二、方法 (实验程序实验程序)三、结果三、结果四、讨论四、讨论设计性实验临床标本中病原菌的分离与鉴定实验目的实验目的 熟悉临床标本中常见病原菌的分离鉴定程序熟悉临床标本中常见病原菌的分离鉴定程序 学习脓汁、痰、粪便
5、、尿液等临床标本的检查方法学习脓汁、痰、粪便、尿液等临床标本的检查方法实验要求实验要求 针对病例，对临床标本中的病原菌进行分离和鉴定针对病例，对临床标本中的病原菌进行分离和鉴定 实验前制定方案，实验后写出实验报告实验前制定方案，实验后写出实验报告 实验分组实验分组 5人人/组组 1套标本套标本/组（脓汁、痰、尿液、粪便）组（脓汁、痰、尿液、粪便）进程安排进程安排 实验分实验分3次进行次进行实验材料脓汁脓汁 标本：脓拭子标本：脓拭子 培养基：血琼脂平板培养基：血琼脂平板 其他：其他：3%H2O2、兔血浆、生理盐水、革兰染液、兔血浆、生理盐水、革兰染液、玻片等玻片等 实验方案第第1次课次课第第2次
6、课次课实验操作与观察触酶实验触酶实验+-触酶实验触酶实验：1.1.挑取菌落置玻片上；挑取菌落置玻片上；2.2.滴加滴加1 12 2滴滴3%H3%H2 2O O2 2，观察结果；，观察结果；实验操作与结果血浆凝固酶实验血浆凝固酶实验+-凝固酶实验：凝固酶实验：1.1.取生理盐水于玻片上，挑取待检菌置于生理取生理盐水于玻片上，挑取待检菌置于生理盐水中，制成菌悬液，观察有无自凝现象。盐水中，制成菌悬液，观察有无自凝现象。2.2.向菌悬液中加向菌悬液中加1 1滴兔血浆并混合，观察结果。滴兔血浆并混合，观察结果。实验材料痰痰 标本：标本：咽拭子咽拭子 培养基：血琼脂平板培养基：血琼脂平板 其他：生理盐水
7、、其他：生理盐水、10%胆盐、胆盐、Optochin纸片、纸片、革兰染液、玻片等革兰染液、玻片等 实验方案第第1次次第第2次次第第3次次实验操作奥普托辛实验：奥普托辛实验：1. 挑取菌落涂于血平板上，将挑取菌落涂于血平板上，将optochin纸片贴于接种处；纸片贴于接种处；2. 37培养培养1824小时，观察结果。小时，观察结果。胆汁溶菌实验（平板法）：胆汁溶菌实验（平板法）：1.1.在血平板上标记单个菌落在血平板上标记单个菌落2.2.直接在菌落上加一接种环去氧胆酸纳溶液直接在菌落上加一接种环去氧胆酸纳溶液3.3.将平板将平板3737孵育孵育20203030分钟，观察结果分钟，观察结果实验操作
8、实验操作荚膜染色：荚膜染色：石炭酸复红单染石炭酸复红单染 1.1.涂片、自然干燥、火焰固定；涂片、自然干燥、火焰固定； 2.12.1滴石炭酸复红，立即冲去，镜下观察。滴石炭酸复红，立即冲去，镜下观察。实验操作实验操作实验材料尿尿 标本：尿液标本：尿液 培养基：培养基： EMB平板平板 克氏双糖铁斜面培养基克氏双糖铁斜面培养基 动力动力-靛基质靛基质-尿素半固体琼脂培养基尿素半固体琼脂培养基 其他：革兰染液、靛基质试剂、玻片等其他：革兰染液、靛基质试剂、玻片等 实验方案第第1次次第第2次次第第3次次实验材料粪便粪便 标本：肛拭子（标本：肛拭子（1#、2#） 培养基：培养基： EMB平板平板 克氏
9、双糖铁斜面培养基克氏双糖铁斜面培养基 动力动力-靛基质靛基质-尿素半固体琼脂培养基尿素半固体琼脂培养基 其他：生理盐水、靛基质试剂、沙门菌多价血其他：生理盐水、靛基质试剂、沙门菌多价血清、志贺菌多价血清、玻片等清、志贺菌多价血清、玻片等实验方案第第1次次第第2次次第第3次次讨论内容讨论内容针对实验步骤的讨论；针对实验步骤的讨论；对结果的分析；对结果的分析；还需要进一步做哪些实验；还需要进一步做哪些实验；此次实验成功或需要改进的地方；此次实验成功或需要改进的地方；其他其他预习：预习：肥达反应肥达反应实验报告实验报告 临床标本中病原菌的分离与鉴定临床标本中病原菌的分离与鉴定 班级 _ 组别 _ 姓
10、名 _ 学号 _ 日期 _ 材料材料 1. 待检标本： 2. 培养基： 3. 其他： 方法方法 结果结果 讨论讨论（包括对结果的分析、结论以及尚需追加实验等） 肥达试验肥达试验 (Widal test) 用已知的用已知的伤寒沙门菌伤寒沙门菌O O、H H抗原抗原、甲型副伤寒沙门菌甲型副伤寒沙门菌、肖氏肖氏、希希氏沙门菌氏沙门菌H H抗原抗原的诊断菌液，与的诊断菌液，与患者患者血清血清作作定量凝集试验定量凝集试验，检测，检测患者血清中的相应抗体，患者血清中的相应抗体，辅助诊辅助诊断伤寒、副伤寒断伤寒、副伤寒。Widal test正常值正常值： 诊断伤寒：诊断伤寒：O凝集效价凝集效价1:80, H
11、凝集效价凝集效价1:160; 诊断副伤寒：诊断副伤寒：O凝集效价凝集效价1:80, H凝集效价凝集效价1:80 才有诊断价值才有诊断价值.动态观察动态观察：抗体效价随病程延长而上升；：抗体效价随病程延长而上升； 双份血清升高双份血清升高4倍或以上；倍或以上；O与与H抗体的诊断意义抗体的诊断意义： O，H-肠热症肠热症(伤寒或副伤寒伤寒或副伤寒)的可能性大的可能性大 O，H-患病的可能性小患病的可能性小 O不高，不高，H-预防接种预防接种 / 非特异性回忆反应非特异性回忆反应 O，H不高不高-感染早期或与伤寒沙门菌感染早期或与伤寒沙门菌O抗原有抗原有 交叉反应的其他沙门菌感染交叉反应的其他沙门菌
12、感染少数病例在整个病程中，肥达试验始终呈少数病例在整个病程中，肥达试验始终呈“-”: 早期使用抗生素治疗或患者免疫功能低下早期使用抗生素治疗或患者免疫功能低下Widal test (5人人/组组)材料：材料：病人未知血清：病人未知血清：1#1#，2#2#，3#3#菌液：菌液：O O、H H、PAHPAH、PBHPBH（已知（已知AgAg）方法：方法：每组每组1 1块多孔板块多孔板/24/24支试管；支试管； 每人每人2 2支吸管；支吸管； 弃弃0.5ml于消毒缸于消毒缸 1 2 3 4 5 6 NS 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5ml未知血清未知血清(1:10) 0.5 0.5
13、 0.5 0.5 0.5菌液菌液(摇匀摇匀) 0.50.5 0.5 0.5 0.5 0.5ml (4种种,1种种/人人) 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 (阴性对照阴性对照) 37，水浴过夜（完成一个完整的检验），水浴过夜（完成一个完整的检验）方法方法 TO TH TAH TBH TCH TO TH TAH TBH TCH 意义意义 1:640 1:320 1:640 1:320 1:640 1:160 1:640 1:160 发病早期发病早期不久前患过伤寒不久前患过伤寒/ /菌苗接种菌苗接种/ /非特异回忆非特异回忆伤寒伤寒副伤寒甲副伤寒甲肖氏副伤寒肖氏副伤寒“O”抗
14、原凝集现象：抗原凝集现象：（呈颗粒状薄膜）（呈颗粒状薄膜）100100凝集凝集：“”： 上层清亮，底部完全凝集，呈颗粒状薄膜（有卷边）上层清亮，底部完全凝集，呈颗粒状薄膜（有卷边）。7575凝集凝集：“”： 上层不太清亮，底部凝集明显。上层不太清亮，底部凝集明显。5050凝集凝集：“”： 上层混浊，下层凝集。孔底中央中间约上层混浊，下层凝集。孔底中央中间约 5050白色沉淀，白色沉淀，周围膜状凝集，约周围膜状凝集，约5050。2525凝集凝集：“”：液体比较混浊，膜状凝集少。：液体比较混浊，膜状凝集少。0 0凝集凝集：“”：如第：如第6 6孔，混悬后，混浊均匀，底部无孔，混悬后，混浊均匀，底部
15、无凝集。凝集。“H”抗原凝集现象抗原凝集现象：（呈絮状凝集）：（呈絮状凝集） 100凝集凝集：“”：液体清亮，底部中央完全凝集，：液体清亮，底部中央完全凝集，呈蓬松絮状；混悬起来，液体仍然清亮，分散开的絮状凝集呈蓬松絮状；混悬起来，液体仍然清亮，分散开的絮状凝集块漂浮于液体中。块漂浮于液体中。 75凝集凝集：“”：上层不太清亮，底部絮状凝集明显。：上层不太清亮，底部絮状凝集明显。 50凝集凝集：“”：混悬后，上层均匀混浊，下层絮状凝：混悬后，上层均匀混浊，下层絮状凝集约集约50。 25凝集凝集：“”：混悬后，液体比较混浊，絮状凝集少。：混悬后，液体比较混浊，絮状凝集少。 0凝集凝集：“”：如第：如第6孔，混悬后，液体均匀混浊，底部孔，混悬后，液体均匀混浊，底部无凝集。无凝集。实验报告实验报告 班级 学号 姓名 日期 肥大反应肥大反应(Widal Test)一、实验目的要求：二、实验材料：三、方法：四、结果：抗原抗原抗体效价抗体效价 O H PAH PBH五、讨论
