1、柱柱 层层 析析 简简 介介李 正 邦2007-10.17目 录v 层析的基本原理层析的基本原理层析的基本原理层析的基本概念层析的分类v 柱层析的基本操作柱层析的基本操作原理几个基本概念基本操作步骤 硅胶柱、大孔吸附树脂柱、聚酰胺柱v 柱层析常见问题与对策柱层析常见问题与对策吸附剂的选择洗脱剂的选择操作方式一、层析的原理一、层析的原理( (一一) ) 层析的基本原理层析的基本原理 层析法（chromatography）又称色谱法，是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中
2、的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。（二）（二） 层析的基本概念层析的基本概念v固定相固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。v流动相流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。v系数系数K： 是物质在两相中的浓度比。K值大，则在固定相中吸附牢，K值小吸附差。各物质间的K值差别大，则易被分离。不同类型层析的K值含义不同，可视为
3、吸附平衡常数，分配常数或离子交换常数等。（三）（三） 层析的分类层析的分类1、按操作形式、按操作形式：柱层析柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离；纸层析纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的；薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定；2、根据移动相种类的不同、根据移动相种类的不同： 气固层析(GSC) 液液层析(LLC) 气相层析 液相层析 气液层析(GLC) 液固层析(LSC)3、按层析的机理：、按层析的机理：吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的； 分配层析：利用不同组分在
4、流动相和固定相之间的分配系数不同，使之分离； 离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同；凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。 以上划分无严格界限，有些名称相互交叉，如亲和层析应属于一种特殊的吸附层析，纸层析是一种分配层析，柱层析可做各种层析。 二、柱层析的基本操作 柱色谱一般有吸附色谱和分配色谱两种。前者常用氧化铝和硅胶作固定相，在分配柱色谱中以硅胶、硅藻土和纤维素作为支持剂，以吸收一定量的液体作固定相，而支持剂本身不起分离作用。实验室中最常用的是吸附色谱。根据混合物中各组分对吸附剂（即固定相）的吸附能力，以及对洗脱剂（即流动相）的溶解度不同将各组分分离。（一
5、）（一） 原理原理层析柱分离物质的示意图层析柱分离物质的示意图 固定相为固体颗粒，装在层析柱内，高5cm，固定相周围充满液体流动相，每厘米柱中液相体积为1cm3。若在柱顶加入1cm3溶剂,其中含32mg样品，同时应有相同体积的溶剂从柱底流出，此时样品处于柱中A位置。若样品的分配系数是1，则它在固相与液相间等量分配。若再有1cm3的溶剂加到柱上，A部分中的溶剂带着16mg的物质向下移动到B，A和B中的物质都将发生再分配A ABCDE321616 8 16 8 4 4 12 12 2 2 8 12 8不同物质分配系数不同时不同物质分配系数不同时不同组分的含量不同组分的含量 不同组分在柱中的位置不同
6、组分在柱中的位置 上部上部 中部中部 下部下部( (二二) ) 几个基本概念几个基本概念 如上图有：VtVoViVg， 由于Vg相对很小，可以忽略不计，则有：VtVoVi。外水体积外水体积是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。内水体积内水体积是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体积。基质体积基质体积是指凝胶颗粒实际骨架体积。而柱床体积柱床体积就是指凝胶柱所能容纳的总体积。洗脱体积洗脱体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。（三）基本操作步骤（三）基本操作步骤 装柱加样洗脱和分离收集各组分鉴定与检测1 1、装柱、装柱 色谱柱的大小规格
7、由待分离样品的量和吸附难易程度来决定。一般柱管的直径为0.5-10cm，长度为直径的10-40倍。填充吸附剂的量约为样品重量的20-50 倍，柱体高度应占柱管高度的3/4。柱子过于细长或过于粗短都不好。装柱前，柱子应干净、干燥，并垂直固定在铁架台上。将少量洗脱剂注入柱内，取一小团玻璃毛或脱脂棉用溶剂润湿后塞入管中，用一长玻璃棒轻轻送到底部，适当捣压赶出棉团中的气泡，但不能压得太紧，以免阻碍溶剂畅流（如管子带有筛板，则可省略该步操作）。再在上面加入一层约0.5cm 厚的洁净细砂，轻扣击柱管，使砂面平整。 常用的装柱方法有干装法和湿装法两种（1）干装法 在柱内装入2/3 溶剂，在管口上放一漏斗，打
8、开活塞让溶剂慢慢地滴入锥形瓶中，接着把干吸附剂经漏斗以细流状倾泻到管柱内，同时用套在玻璃棒（或铅笔等）上的橡皮塞轻轻敲击管柱，使吸附剂均匀地向下沉降到底部。填充完毕后，用滴管吸取少量溶剂把粘附在管壁上的吸附剂颗粒冲入柱内，继续敲击管子直到柱体不再下沉为止。柱面上再加盖一薄层洁净细砂，把柱面上液层高度降0.11cm，再把收集的溶剂反复循环通过柱体几次，便可得到沉降得较紧密的柱体。（2）湿装法 基本方法与干装法类似，所不同的是，装柱前吸附剂需要预先用溶剂调成淤浆状，在倒入淤浆时，应尽可能连续均匀地一次完成。如果柱子较大，应事先将吸附剂泡在一定量的溶剂中，并充分搅拌后过夜（排除气泡），然后再装。其优
9、点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。 无论是干装法，还是湿装法，装好的色谱柱应是充填均匀，松紧适宜一致，没有气泡和裂缝，否则会造成洗脱剂流动不规则而形成“沟流”，引起色谱带变形，影响分离效果。2 2加样加样 上样也有干法和湿法之分：干法就是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶，拌匀后再旋去溶剂。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。干法上样较麻烦，但可以保证样品层很平整。湿法上样就是用少量溶剂（最好就是展开剂，如果展开剂的溶解度不好，则可以用一极性较大的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁均匀加入。加完后，用少量溶剂把容器和滴管冲洗净并全部加到柱内
10、，再用溶剂把粘附在管壁上的样品溶液淋洗下去。慢慢打开活塞，调整液面和柱面相平为止，关好活塞。如果样品是液体，可直接加样。3 3洗脱与检测洗脱与检测 在洗脱过程中，柱内不断地发生解吸、吸附，再解吸、再吸附的过程。 当我们选定好洗脱液后，洗脱的方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱三种。 简单洗脱简单洗脱：柱子始终用同样的一种溶剂洗脱，直到层析分离过程结束为止。如果被分离物质对固定相的亲合力差异不大，其区带的洗脱时间间隔（或洗脱体积间隔）也不长，采用这种方法是适宜的。但选择的溶剂必须很合适方能使各组分的分配系数较大。否则应采用下面的方法。 分步洗脱分步洗脱：这种方法按照递增洗脱能力顺序排列的几种洗
11、脱液，进行逐级洗脱。它主要对混合物组成简单、各组分性质差异较大或需快速分离时适用。每次用一种洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。 梯度洗脱梯度洗脱：当混合物中组分复杂且性质差异较小时，一般采用梯度洗脱。它的洗脱能力是逐步连续增加的，梯度可以指浓度、极性、离子强度或pH值等。最常用的是浓度梯度。 对洗脱液接收时，有色物质，按色带进行收集，但色带之间两组分会有重叠。对无色物质的接收，一般采用分等份连续收集，每份流出液的体积毫升数等于吸附剂的克数。若洗脱剂的极性较强，或者各成分结构很相似时，每份收集量就要少一些，具体数额的确定，要通过薄层色谱检测，视分离情况而定。现在，多数用分步接收器自动控制接收。
12、洗脱完毕，采用薄层色谱法对各收集液进行鉴定，或紫外光检测，以洗脱液体积对被洗脱物质浓度作图，可得到洗脱曲线把含相同组分的收集液合并，除去溶剂，便得到各组分的较纯样品。（四）（四） 硅胶柱、大孔吸附树脂柱、聚酰胺柱硅胶柱、大孔吸附树脂柱、聚酰胺柱1 1、硅胶柱、硅胶柱 . . 装柱装柱 活化硅胶：活化硅胶：100100110110O OC,0.5hC,0.5h； 层析主经长比：层析主经长比：1 1：20203030； 样品与吸附剂比例：样品与吸附剂比例：1 1：30306060； 沉降平衡。沉降平衡。 .上样上样 干法：样品难溶于洗脱剂时，用少量适当溶剂拌适量硅胶溶解、挥干，上干法：样品难溶于洗
13、脱剂时，用少量适当溶剂拌适量硅胶溶解、挥干，上柱；柱； 湿法：样品溶于洗脱剂时湿法：样品溶于洗脱剂时。 .洗脱：洗脱：溶剂选择见下（洗脱剂的选择）溶剂选择见下（洗脱剂的选择） .常压与加压：常压与加压：硅胶粒度细时，为了保证洗脱速度可以适当加压。硅胶粒度细时，为了保证洗脱速度可以适当加压。2.2.大孔吸附树脂柱大孔吸附树脂柱 大孔吸附树脂是一种具有大空结构的有机高分子共聚体，是一类人工合成的有机高聚物吸附剂，因其具有多孔性结构而具有筛选性，又通过表面吸附、表面电性或形成氢键而具有吸附性。 一般粒度2060目，分为非极性、中级性、极性、强极性。采用大孔吸附树脂分离纯化中药的有效成分，应根据欲处理
14、成分的理化性质考虑以下因素：适合的树脂、树脂预处理、吸附溶质的浓度、吸附流速与温度、解吸附剂种类、解吸附时流速与温度等。.树脂前处理树脂前处理 新购树脂中可能含有未聚合的单体、分散剂、致孔剂、引发剂、惰性溶剂等化学残留，所以使用前必须进行预处理以保证最后药用安全。一般方法：乙醇浸泡24h，连续加热回流数次(更换新溶剂)后湿法上柱，用乙醇洗脱至流出液与水(1:2)混合不产生浑浊，再用水冲至无醇味，水浸泡备用。注意不同型号树脂处理方法不同，请按照厂商提供方法处理。.装柱与上样装柱与上样 方法同前，亦有干法湿法。上样液最好澄清，故上样前影进行一定的处理，如预先沉淀、滤过处理、PH处理、使部分杂质在处
15、理过程中除去，以免堵塞树脂床或在洗脱时混入洗脱液中。 .洗脱洗脱 化合物经树脂吸附之后，在树脂表面或内部还残留许多非极性或水溶性较大的强极性杂志成分，一般用水洗去。为避免损失影同步检测，然后再用解吸附剂洗脱。注意若解吸附剂中有机部分浓度较高，应采用梯度洗脱，逐步增大浓度，否则，树脂床中易产生大量气泡而影响洗脱。注：注： .解析条件的确定要考虑解析条件的确定要考虑：解析剂(解吸附曲线，尖锐不拖尾)；解析剂的PH；解析速度(脱附曲线，流速慢，脱附效果好，但周期长)；解析温度(一般升温有利于脱附，但可能使杂质混入洗脱液)。 .影响上样吸附的因素影响上样吸附的因素 层析主选用不当(:L)；装柱不当(送
16、进均匀、顶端平整)；药液处理不当(前处理、反洗、黏性)；上样流速控制不当(快-吸附不完全，慢-效率低)；树脂型号选用不当(动态吸附、静态吸附)。3. 3. 聚酰胺柱聚酰胺柱v 聚酰胺是通过酰胺键聚合的一类高分子化合物，对碱较稳定而对酸不稳定，其酰胺键可以与酚类、酸类、醌类和硝基化合物等形成氢键而被吸附，从而与不能形成氢键的化合物分离。聚酰胺具有”双重色谱”的性能：正向和反向分配色谱。常用于分离酚类、黄酮类、醌类以及脱鞣处理等。v 聚酰胺使用前必须预处理：过筛，再以90-95%乙醇浸泡，不断搅拌，除去气泡后装入柱中。用3-4BV的90-95%乙醇洗脱，洗至洗脱液透明并在蒸干后无残渣(或极少残渣)
17、。再依次用2-2.5BV的5%NaOH水溶液、1BV的蒸馏水、2-2.5BV的10%醋酸水溶液洗脱，最后用蒸馏水洗脱至pH中性，备用。v 装柱加样：同大空树脂。上样量约1.52.5g/100ml，上样药液浓度20%30%v 洗脱：先用水洗，再用醇洗，醇浓度递增，直至无水乙醇或甲醇，若仍有物质未被洗脱，可以用稀氨水或甲酰胺洗脱，分段收集。三、柱层析常见问题与对策三、柱层析常见问题与对策 柱层析成败的关键是选择合适的吸附剂、洗脱剂和操作方式。( (一一) ) 吸附剂的选择吸附剂的选择v 一般要求吸附剂具备以下条件：表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强和成本低廉等性能。v 目前常用的吸附剂吸附
18、极性化合物能力的顺序为：纸纤维素淀粉糖类硅酸镁硫酸钙硅酸硅胶氧化镁氧化铝活性炭。 v 在选择具体吸附剂时，主要是根据吸附剂本身和被吸附物质的理化性质进行的。一般来说， 极性强的吸附剂易吸附极性强的物质，非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。但是为了便于解吸附，对于极性大的分离物，应选择极性小的吸附剂，反之亦然。理想的吸附剂必需经过多次试验才能获得。 1. 硅胶硅胶 最常用的吸附剂,通常用SiO2.xH2O表示,是具有硅氧交联结构,表面有许多硅醇基的多孔性微粒.硅醇基可与极性化合物或不饱和化合物形成氢键而使硅胶具较强的吸附力.硅胶具有微酸性,适用于分离酸性和中性物质,如有机酸、氨基酸、甾体等.水能与
19、硅胶表面羟基结合而使其失去活性,经加热可被除去的水称自由水,若自由水含量达17%以上,则吸附力极低,此时,硅胶只能用于分配层析.若将硅胶在105-110加热30min,吸附能力显著增强，这一过程称为活化.如果将硅胶加热到500，硅醇基结构会变成硅氧烷结构，吸附能力显著下降。 2. 氧化铝氧化铝 分酸性、碱性和中性三种，酸性氧化铝(pH4-5)适合于分离酸性化合物，碱性氧化铝(pH9-10)适合于分离碱性化合物，中性氧化铝(pH7)适合于分生物碱、挥发油、萜类、甾体及在酸、碱中不稳定的甙类、酯类等化合物.氧化铝用前也需脱水活化，通常于400高温下加热6h,使氧化铝的含水量在0%-3%之间,可得到
20、级或级氧化铝，但温度过高也会破坏氧化铝的内部结构。3. 大孔吸附树脂聚酰胺大孔吸附树脂聚酰胺 大孔吸附树脂广泛应用于制药及天然植物中活性成分,如皂甙、黄酮、内脂、生物碱等大分子化合物的提取分离；聚酰胺在黄酮类物质、茶多酚、醌以及贵金属分离提取中有着广泛的应用。4. 羟基磷灰石羟基磷灰石Ca5(PO4)3OH2，简称HA的吸附容量高，稳定性好(在T85，pH5.5-10.0均可使用)，因此在制备及纯化蛋白质、酶、核酸、病毒和其它生命物质方面得到了广泛的应用。( (二二) ) 洗脱剂的选择洗脱剂的选择 洗脱剂指的是溶解被吸附样品和平衡固定相的溶剂。洗脱剂的选择基本按照“相似相溶”的原则，即：即欲洗
21、脱极性大的组分，选择极性大的洗脱剂（如水、乙醇、氨等）；极性小的组分宜选用极性小的洗脱剂（如石油醚、乙醚等），并应符合下列条件： 纯度较高；稳定性好；能较完全洗脱所分离的成分；黏度小；易和所需要的成分分开。 常用洗脱剂按极性大小顺序可排列如下： 石油醚（低沸点高沸点）环己烷四氯化碳三氯甲烷乙醚甲乙酮二氧六环乙酸乙酯正丁醇乙醇甲醇水吡啶乙酸。v 洗脱剂可根据分离物中各成分的极性、溶解度和吸附剂的活性来选择。所用洗脱剂的浓度大小和极性强弱的选择，需通过试验确定。 v 在实践中，选择洗脱剂的顺序是由极性小到极性大(正向层析)。当把极性小的洗脱剂换成极性大的时，宜先将极性大的和极性小的洗脱剂混合使用，
22、浓度则由低到高。总之，选用洗脱剂的原则是能较完全地洗脱所要分离的成分，并力求用量少、洗脱时间短。 ( (三三) ) 操作方式操作方式1.1.装柱装柱 层析柱中基质应合乎填装均匀、松紧一致和没有气泡的标准。 装柱之前基质需要预处理。硅胶、氧化铝主要是高温脱水活化处理；新购树脂可能含有分散剂、致孔剂、惰性溶剂等化学残留，使用前用酸、碱、醇等进行预处理。 吸附剂的用量是根据其自身的操作容量和分离物中各成分的性质决定的。当操作容量高时， 吸附剂用量少。一般吸附剂的用量为被分离样品的30-50倍。若样品中各成分的性质相似难以分开时，则吸附剂用量应增大，有时大于样品的100倍。 柱子装好后，要用所需的缓冲
23、液（有一定的pH和离子强度）平衡柱子。气泡的产生与排除气泡的产生与排除v气泡产生原因气泡产生原因v由于溶剂和吸附剂之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到），容易产生气泡，这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚，二氯甲烷更为明显。虽然产生的气泡在加压的情况下不易察觉，但是，一旦撤去压力，如在上样、加溶剂等操作的时候，气泡就会释放出来，严重时，整个柱子变花。另外，在变换洗脱剂时，由于溶剂极性的改变页容易产生气泡；天气太热，溶剂挥发也易产生气泡。v排除对策排除对策：v 1.装柱之前应搅拌均匀，然后装柱；v 2.装柱尽可能一次性的装完，v 3.一定要用较多的溶剂“走柱子”，一定要到柱子的下端不再发烫，恢
24、复到室温后再撤去压力v 4.过柱的时候，你是否干过柱，这也会产生气泡；v 5.还有你在装完柱后，最好在硅胶上方加一片圆形滤纸，加上后再加一块棉花，这样加溶剂冲洗时，可以避免冲起硅胶，产生气泡；v如果气泡已经产生，可以：v 1.加压驱赶气泡；v 2. 先不要冲洗，放置过夜，第二天气泡就会到了上面，不过有的时候不行。v 3.如果还不行，就用高极性的溶剂冲下样品，收集，重新装柱。2. 2. 上样和洗脱上样和洗脱 加样量的多少直接影响分离的效果。一般讲，加样量尽量少些，分离效果比较好。通常加样量应少于20%的操作容量，体积应低于5%的床体积，对于分析性柱层析，一般不超过床体积的1%。当然，最大加样量必
25、须在具体条件下多次试验后才能决定。 洗脱条件的选择，也是影响层析效果的重要因素。当对所分离的混合物的性质了解较少时，一般先采用线性梯度洗脱的方式去尝试，但梯度的斜率要小一些，尽管洗脱时间较长，但对性质相近的组分分离更为有利。同时还应注意洗脱时的速率。速度太快，各组分在固液两相中平衡时间短，相互分不开，仍以混合组分流出。速度太慢，将增大物质的扩散，同样达不到理想的分离效果。若峰与峰之间有重叠，宜降低洗脱剂的强度，若峰间距离过大，或某些成分不能洗脱时，宜加大洗脱剂的强度(极性)，成分复杂时，可采用洗脱剂由弱到强的梯度洗脱。总之，只有多次试验才能得到最佳的洗脱条件 。吸附剂的再生v 许多吸附剂可以反
26、复使用多次，而且价格昂贵，所以层析后要回收处理，以备再用，严禁乱倒乱扔。这也是一个科研工作者的科学作风问题。v 大孔吸附树脂再生大孔吸附树脂再生：在容器内加入高于树脂层10cm的3%-5%HCl溶液浸泡2-4小时，然后进行淋洗通柱。继用3-4BV同浓度的HCl溶液通柱,然后用净水洗至接近中性；再用3%-5%NaOH溶液浸泡4小时。最后淋洗通柱,用同浓度的3-4BV的NaOH溶液通柱，最后用蒸馏水洗至PH值为中性,备用。v 聚酰胺再生聚酰胺再生: :5%NaOH溶液洗涤，然后水洗，再用10%AcOH溶液洗，最后用蒸馏水洗至PH值为中性即可。THANKS !THANKS !人有了知识，就会具备各种分析能力，明辨是非的能力。所以我们要勤恳读书，广泛阅读，古人说“书中自有黄金屋。”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识，培养逻辑思维能力；通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平，培养文学情趣；通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。有许多书籍还能培养我们的道德情操，给我们巨大的精神力量，鼓舞我们前进。
