1、第四章 目的基因的制备第一节 目的基因1. 基因的组成 基因：基因：染色体上具有遗传功能的DNA片段，它包括结构基因和相关的调控序列。 脱氧脱氧核糖核糖磷酸磷酸T目的基因：目的基因：决定生物的优良性状、具有应用价 值或应用前景，并被用于构建物种新特性的基因。 结构基因：结构基因：包括从5端mRNA转录位点开始到3端mRNA转录终止信号结束的全部功能单位。这些功能单位包括：转录启动区、核糖体识别和结合区、编码区（起始密码，开读框、终止密码）、转录终止区。1) 原核生物的基因组成操纵子（操纵子（OperonOperon）：）：功能密切相关的基因聚 集在一起，处于同一个转录启动区的调控 之下，并具有
2、相同的转录终止区. 启动区启动区：RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。 SDSD序列序列：核糖体识别和结合的序列，通常位于起译密码子上游4-9bp处。序列特征为：AGGAGG, 它与核糖体核糖体16S rRNA的3序列3 UCCUCC 5互补配对，从而使核糖体与mRNA结合,启动翻译过程。编码区：编码区： 翻译起始密码（ATG）：位于SD序列后4-9bp 多肽链编码区： 翻译终止密码（TAG，TGA,TAA）：某些基因后面只有一个终止密码，某些基因后面有两个终止密码.转录终止区转录终止区终止子：原核生物基因在转录终止前的一段提供 转录终止信号的DNA序列（Terminator）.
3、 特点：回文结构，转录后可形成发夹状的结 构，从而使聚合酶减慢或停止前进. a）不依赖于终止因子的终止子（简单终止子） 含有寡聚T序列和一段富含GC的序列 b）依赖于终止因子（）的终止子. 不含寡聚T序列，回文结构不含富GC的序列终止因子：帮助RNA聚合酶识别终止信号的 辅助因子（Termination factor） 终止子发夹结构2) 真核生物基因组成 真核生物基因组的一般特点真核生物基因组的一般特点 a）基因位于染色体上，基因之间存在较长 的非编码区 b）一个结构基因内有一个或多个非编码的 间隔序列转录启动区：转录启动区：真核生物的三类RNA(rRNA, mRNA, tRNA)分别由RN
4、A聚合酶I、II和III进行转录.它们启动子的结构也不相同.编码蛋白质的启动子由RNA聚合酶II识别.基因区：基因区：特点：a）无类似于原核基因中的核糖体识别区 b）含有不编码的间隔序列转录终止区：转录终止区：含有高度保守序列AATAAA，该序列与mRNA转录后3端加poly（dA）尾有关3) 其它基因组的特点病毒（噬菌体）基因组的特点 a）编码的基因位于DNA或RNA上 b）以多顺反子进行转录（SV40） c）部分基因重叠并含有内含子线粒体基因组的特点线粒体基因组的特点 a）DNA编码的蛋白与能量代谢有关 b）以多顺反子进行转录 c）无S.D序列 d）动物线粒体基因无内含子，某些植物线粒 体
5、基因有内含子叶绿体基因组的特点叶绿体基因组的特点 a）DNA编码与光合作用有关的蛋白或酶 b）以多顺反子进行转录 c）含有类似于原核基因组的启动子和S.D序列2. 基因的特殊排列对于大多数基因来说，基因组中的基因一个接一个排列在DNA分子上，在基因之间存在长度不等的间隔区，但某些生物基因组中的基因存在重叠，重复，加倍和重排等现象1）基因重叠一个基因内包含另一个基因的现象 a）部分重叠 ：两个基因的序列部分重叠 b）完全重叠：一个基因完全包含在另一个基因内2）重复基因在某些生物基因组中，某些基因存在多个拷贝的现象* 真核生物基因组中组蛋白基因3）加倍基因同一细胞中至少含有两套完全或基本相同的基因
6、* 高等生物含有两倍以上的染色体* 细菌质粒DNA* 蓝藻染色体4）基因重排在生物的发育过程中，同一基因簇中的基因在不同的细胞中的排列顺序发生改变的现象.它与细胞功能的分化及表达有关.* 蓝藻细胞中的营养细胞和异形胞中的nif基因存在重排现象第二节 目的基因的制备1.目的基因的直接分离 1) 限制性核酸内切酶酶切分离：对于已知序列的DNA分子，根据DNA分子上的酶切位点进行切割，然后分离所需片断。 2) 物理化学分离法：根据不同DNA或RNA分子特性的差异，采用密度梯度离心、分子杂交等方法将目的基因分离出来。 3) 免疫法分离编码特异性蛋白基因：核糖体沿mRNA进行转译时产生多肽链，通过特异性
7、抗体与核糖体mRNA多肽链复合体结合，然后分离纯化抗体核糖体mRNA多肽链复合体，获得特定基因的mRNA。 4)酶促反转录分离特定基因：在反转录酶的作用下，合成双链DNA，获得一定大小的基因片断。2. 原核生物基因组文库的构建基因组文库基因组文库（Genomic library)：某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体储存于某一受体菌的群体中，这个群体就称为该生物基因组的文库。 目的：a）分离有用的目的基因 b）保存某种生物的全部基因1) 原核生物基因组DNA的提取 染色体DNA 质粒DNA pUC载体系统：制备的基因组片段 100 kb *采用常规的基因组DNA的制备方法 载体系统：制备的
8、基因组片段200 k bp *采用常规的基因组DNA的制备方法 要求：制备的DNA的长度为100-200kb， 防止在制备过程中的机械断裂2) 基因组DNA的不完全酶切 根据实验需要选择合适的限制性内切酶 a) 四个识别位点限制酶出现的几率: 1/256 b) 六个识别位点限制酶出现的几率: 1/1024 分离目的酶切片段大小的确定 a) 克隆单个基因： 10 kb b) 克隆基因族：99% . 文库理论克隆子数基因组总长片段平均长度 文库实际克隆子数（） （） 片段平均长度 基因组的总长基因组大小酶切片段大小文库克隆子数的关系基因组大小酶切片段大小文库克隆子数的关系3) 酶切片段与克隆载体连
9、接酶切片段的分离与纯化a）低熔点琼脂糖回收目的片段b）试剂盒回收目的片段酶切片段与克隆载体连接克隆载体的选择 a）质粒载体可承载10 kb片段 b）载体可承载20 kb DNA片段 c）Cosmid 载体可承载10M bp * 染色体分带技术将各个染色体分离 载体系统：制备的基因组片段200 k bp *采用常规的基因组DNA的制备方法2) 真核基因组DNA一级文库的构建（YAC文库） a) 染色体DNA的部分酶切 获得平均长度为200-500 kb的DNA片段 *多切点限制性内切酶：EcoR I，BamH I 特点：有较多重叠克隆子 *稀切点限制性内切酶：Not I，Mlu I 特点：重叠克
10、隆子较少 b) 酶切片段与YAC克隆载体连接YAC克隆载体 pYAC4C) C) 酶切片段与载体连接酶切片段与载体连接*d)重组YAC载体转化酵母球形体 1 g基因组DNA 500个转化体 e) YACe) YAC文库的筛选文库的筛选 1）探针杂交法：以特异性的探针分子与 文库的克隆子进行杂交 2）PCR筛选法：f)YAC基因组文库的保存活化菌体：将含重组载体的阳性克隆（AB1380 菌株）划线接种于AHC平板上，于30 oC培 养至长出1-3mm的红色菌落。短期保存：parafilm膜将平板周围封起来于4 oC 保存4-6周。长期保存：接种一个单独的YAC克隆子于3 ml YPD培养基中，在
11、30 oC摇床振荡过夜，然 后加入1ml 80%的甘油，混匀后分装于-80 oC保存。3) 真核基因组亚文库的构建（ DNA载体的文库）转导转导E.coliE.coli4. cDNA4. cDNA文库的构建文库的构建cDNAcDNA文库文库：某种生物基因组转录的全部mRNA 经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组，储存于某种受体菌中，该群体就称该生物基因组的cDNA文库(cDNA Library）.原理原理：将带poly（A）的mRNA经酶促反应转变为双链DNA，再与原核载体连接.1) 制备用于克隆cDNA的mRNAa)mRNA的制备 动物细胞mRNA的制备 植物细胞mRNA的制备b)m
12、RNA的来源 选用mRNA含量高的组织材料，或通过药物等 方法提高mRNA的含量c)mRNA完整性的检测 * mRNA在无细胞翻译体系指导合成高分子量 蛋白质的能力(见下页图)哺乳动物mRNA在红细胞裂解液中翻译SDS-PAGE analysis of proteins translated by cell-free translation system. Lane 1: protein marker; Lane 2,without mRNA; Lane 3 to 7: translation products of total mRNA from mammalian cells* mRNA在
13、无细胞体系中指导合成目的多肽的能力。* mRNA分子的大小。哺乳动物mRNA长度为500- 8000 bp，大部分mRNA位于1.5-2.0kb之间。* 总mRNA指导合成cDNA第一链长分子的能力。利用哺乳动物细胞提取的poly(A)+RNA合成cDNALane 1: -HindIII-EcoRI; Lane 2: the first chain of cDNA; Lane 3: the second chain of cDNA; Lane 4: -HindIIId) mRNA在细胞中的丰度* 高丰度mRNA 目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA 量的50-90%, 该类mRNA在合
14、成和克隆cDNA之 前不需进一步纯化特定mRNA.* 低丰度mRNA 目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA 量的0.5%以下.2) mRNA的富集典型的哺乳动物细胞含有10 000-30 000种不同的mRNA分子,某些mRNA分子在细胞内的拷贝数很低甚至只有一个拷贝 mRNA的丰度与文库克隆子数的关系 N= ln(1-P) ln(1-1/n) N:所需克隆数; P: 要求的概率; n:一种 mRNA在总mRNA中的相对比例a) 按大小对mRNA进行分级分离* 通过琼脂糖凝胶电泳分离大小不同的mRNA分 子，该方法的分离效果最好，但从凝胶中回 收的得率较低.* 蔗糖梯度离心：加入破坏R
15、NA二级结构的变 性剂如氢氧化甲基汞等，再进行蔗糖梯度离 心以分离不同分子量的mRNA.b) cDNA的分级分离 mRNA通过反转录形成cDNA，在插入到克隆载 体前，通过琼脂糖凝胶电泳，将不同大小的 cDNA分子分离开来. 优点： * 避免了分离过程中mRNA被污染的RNA酶降解 * 增加了获得全长cDNA克隆的概率 * 获得更准确的分级分离效果（分子量）c）多聚核糖体免疫学纯化法* 使用抗体来纯化合成目的多肽的多聚核糖体. 将正在合成的新生多肽链的多聚核糖体结合 到免疫亲和柱（A蛋白-Sepharose柱）上，随 后用EDTA将多聚核糖体解离下来，并通过 Oligo(dT)层析分离mRNA
16、, 利用该方法可将目 的mRNA纯化数千倍. 目的mRNA在细胞中的 含量可为数十拷贝.3) cDNA第一链的合成利用反转录酶合成利用反转录酶合成cDNAcDNA的第一链的第一链4) cDNA第二链的合成a) 自身引导合成法自身引导合成法：单链cDNA的3端能够形成 发夹状的结构作为引物，在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下，合成cDNA的第 二链.* 缺点：在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构 时，会导致对应于mRNA 5端的地方的序列 出现缺失和重排.自身引导法合成双链自身引导法合成双链cDNAcDNAb) 置换合成法原理：以第一链合成产物cDNA：mRNA杂交体作为切口平
17、移的模板，RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口,产生一系列RNA引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I 的作用下合成cDNA的第二链.优点：a）合成cDNA的效率高 b）直接利用第一链的反应产物，不纯化 c）避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA置换法合成cDNA的第二链c)引物-衔接头法5) 双链cDNA分子的克隆a) a) 同聚物加尾法同聚物加尾法 利用小牛胸腺末端转移酶在双链cDNA和质粒 载体的3端都加上一个互补的同聚片段，通 过退火使两个片段连接成重组质粒，再将重 组质粒转化受体细胞同聚物加尾法克隆双链cDNAb) 接头-衔接头法c) mRNA-cDNA克隆法方法：在mRNA反转录合
18、成cDNA第一链后，将dA残基加到mRNA：cDNA杂交体上，然后与带dT尾的克隆载体连接，转化受体细在宿主细胞内，mRNA被降解并代之以DNA.缺点：克隆的效率低（为双链cDNA克隆的1/10）6) cDNA文库的筛选和鉴定a) 核酸杂交: 是最常用、最可靠的方法之一.可 大规模地分析文库的克隆子 * 同源探针：至少含有所需cDNA克隆的一部 分确切序列.常用于以一个部分克隆分离cDNA 文库中的全长克隆. * 部分同源探针：探针的序列与所要筛选的 cDNA克隆的序列相关但不相同.常用于克隆 家族基因.b) 特异性免疫学检测:在cDNA表达文库中，目的基因的表达产物能与特异性抗体发生免疫学反
19、应，通过酶学的方法加以检测.c) cDNA克隆的同胞检测:将cDNA文库分成若干组含有10-100个克隆子的易于处理的cDNA文库，对每组cDNA文库进行检测，当鉴定出阳性库后再不断将其分成更细的库进行检测，直到获得阳性单克隆 第三节第三节 目的基因的分离目的基因的分离1. 目的基因的目的基因的功能功能克隆克隆1) 1) 根据蛋白质氨基酸序列分离目的基因根据蛋白质氨基酸序列分离目的基因对于未知功能的蛋白质基因，其目的基因的分离可从蛋白质开始，通过蛋白质的分离纯化、蛋白质氨基酸序列的测定、相对应的基因片断序列的设计，制备PCR扩增引物或合成DNA探针，从总DNA中分离目的基因片断。或根据特异性蛋
20、白质制备特异性抗体，然后从表达文库中筛选克隆子从蛋白质到目的基因的分离2) 2) 功能互补克隆目的基因功能互补克隆目的基因 从某一基因组中提取总DNA，经限制性内切酶不完全酶切后，与克隆载体连接，转化某一种与目的基因功能互补的缺陷型受体细胞。当含有目的基因片断的重组质粒进入受体细胞后，细胞才能生长，从而很方便地将含目的基因的克隆子挑选出来。2.序列克隆法分离目的基因序列克隆法分离目的基因1) 1) 根据部分已知序列或同源序列分离目的基因根据部分已知序列或同源序列分离目的基因 如果知道某个基因的一部分序列，或知道某基因的家族基因的序列，则可根据已知序列或家族基因高度保守的同源序列合成DNA探针，
21、通过探针杂交技术，从DNA酶切片断或克隆子中筛选所要克隆的目的基因片断或克隆子。同源探针杂交克隆目的基因2) 2) 表达序列标签法分离目的基因表达序列标签法分离目的基因 利用基因序列中一段特异性的DNA片断（100- 500bp)作为该基因与其它基因差异的标签 （expressed sequence tag, EST)，然后以该标签 作为获得新基因的依据。3) 3) 基因表达系列分析法基因表达系列分析法基本原理：一个基因转录的mRNA上一段9-10个碱基的核苷酸序列（sequence tag, ST, 序列标签）代表一个特定的转录产物，它们能被识别位点为四个碱基的限制性核酸内切酶（anchor
22、ing enzyme, AE, 锚定酶）所切割。多个序列标签通过酶切和酶连后成为双标签序列的多联体，将多联体克隆到测序载体上。通过连续序列分析确定每个ST序列在转录产物中的拷贝数（频率）。通过与Genebank序列比较，确定某一种ST序列是新的基因或是已克隆的基因。基因表达系列分析法克隆分析目的基因3. 杂交法分离目的基因杂交法分离目的基因1) 1) 差别杂交法差别杂交法: : 对于两个不同生长状态的细胞群体，目的基因在其中一个细胞群体中得到表达，而在另一个细胞群体中没有表达，两个细胞群体的mRNA存在明显差异。利用可表达目的基因的mRNA构建cDNA文库，分别与两个细胞群体总mRNA反转录后
23、制备的cDNA探针进行杂交，根据杂交结果的差异，筛选阳性克隆子。差别杂交法筛选含目的基因的阳性克隆子2)2) 减法杂交分离目的基因减法杂交分离目的基因减法杂交（subtractive hybridization)：又称为扣除杂交或减数杂交。通过杂交技术除去两种细胞群体中普遍存在的基因序列，使目的基因序列得到有效的富集。适合于目的基因拷贝数较低的基因的分离。减数杂交分离目的基因4. 差示分析法分离目的基因差示分析法分离目的基因mRNAmRNA差异显示差异显示: : 根据真核生物mRNA带有poly(dA)的结构，合成poly(dT)MN引物与mRNA的3端互补，在反转录酶的作用下合成cDNAmR
24、NA杂交分子。然后合成5随机引物，通过PCR扩增获得所有mRNA的cDNA分子。通过凝胶电泳检测出差异的cDNA条带。差别显示克隆目的基因5.5.功能结合法筛选目的基因功能结合法筛选目的基因 原理：在cDNA表达文库中，目的基因表达产物能与其它反应底物（探针）结合，形成一种稳定的可明显区别的特征，从而获得含有目的基因的克隆子。功能结合法筛选目的基因6. DNA6. DNA插入诱变分离目的基因插入诱变分离目的基因 原理：将一段特定的DNA序列（标签DNA)插入到植物某一基因内部或相邻位置，诱导该基因突变并形成突变体，再以标签DNA为探针从突变体基因组DNA文库中分离突变基因片断，再根据突变基因片
25、断制备探针，从野生型植株基因组中分离野生型目的基因。转座子标签法分离目的基因T-DNA标签插入诱变分离目的基因7. 基因定位克隆分离目的基因基因定位克隆分离目的基因 原理：根据目的基因在基因组上的位置特性对其进行克隆。 通过DNA连锁分析、染色体缺失等方法将目的基因或其突变体定位到染色体上。 在目的基因的一侧或两侧确定一条或一对紧密连锁的RFLP分子标记。 利用紧密连锁的DNA分子标记序列作为探针，通过染色体步查等将含目的基因的克隆分离。 对目的基因进行测序及相关分析。基因定位克隆分离目的基因的条件 构建含有大片断DNA的基因组文库。 YAC文库 BAC(Bacterial artificia
26、l chromosome)文库 TAC(Transformation-competent artificial chromosom)文库 与目的基因紧密连锁的DNA分子标记，分子标记与目的基因的遗传图距在数百个kb之内。 构建生物体基因组高密度RFLP或RAPD分子标记。1) 染色体步查法分离目的基因2) 染色体跳查分离目的基因8. 8. 基因定位候选法克隆目的基因基因定位候选法克隆目的基因 原理：利用染色体的表达图谱，直接寻找与某一功能密切相关的目的基因。 步骤： 1)将疾病相关基因定位于染色体的精细区段 2)通过数据库查找已定位该区段的各候选基因表达图谱。 3)通过对基因编码的蛋白质进行功
27、能分析，找出最可能的候选基因。 4)对候选基因进行突变分析，确定目的基因。9. 9. 染色体显微切割与微克隆分离目的基因染色体显微切割与微克隆分离目的基因 原理原理： 在显微操作条件下对特定染色体进行显微切割和分离，并建立特定区域DNA或cDNA文库，再从该文库中分离目的基因。 1)1)染色体切割与微分离染色体切割与微分离 玻璃针法玻璃针法：由细微的玻璃针对染色体进行切割 微束激光法：微束激光法：将染色体制备在涂有特殊薄膜的培养皿底面上，以激光对染色体进行切割并将非目标染色体片断清除。 载体接头介导的PCR法：染色体片断经酶切、与接头连接，再与载体连接、转化受体细胞，获得克隆子。 简单引物PC
28、R法：利用随机引物直接扩增切割 的染色体DNA，并对扩增产物进行克隆。 单一引物PCR法：利用一个专门设计的引物对切割片段进行不对称PCR扩增。2) 2) 染色体染色体DNADNA片断微克隆片断微克隆 利用染色体切割技术与杂交技术相结合，构建染色体片段或特异性区域cDNA文库。* 对染色体特异区域显微切割，以简并核苷酸引物进行PCR扩增、固定于膜上，与相应组织总RNA杂交。* 构建相应组织cDNA文库，并与杂交过的膜再次杂交，目的DNA或RNA形成杂合分子（DNA:cDNA, DNA:mRNA,cDNA:mRNA).* 将捕获的cDNA分离，通过PCR扩增构建染色体特异区域的cDNA文库。 3) cDNA3) cDNA微克隆微克隆：1010根据生物大分子间相互作用分离目的根据生物大分子间相互作用分离目的cDNAcDNA克隆克隆1 1）噬菌体表面显示技术）噬菌体表面显示技术 将目的基因克隆在特定的表达载体中，使其表达产物显示在活的噬菌体、细菌或细胞表面，然后根据表达产物的某些生物学活性来筛选、富集和克隆带有目的基因的噬菌体、细菌或细胞。噬菌体表面显示技术克隆目的基因2 2）酵母双杂合系统）酵母双杂合系统Thank YouThank You！
