1、第十五章第十五章 酵母菌基因工程酵母菌基因工程酵母菌是一群以芽殖或裂殖方式进行酵母菌是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物。共有无性繁殖的单细胞真核生物。共有5656属和属和500500多个种组成。酵母是最成熟多个种组成。酵母是最成熟的真核生物表达系统。的真核生物表达系统。第一节第一节 简介简介一一发展历程发展历程1.1.19741974，Rlarck-walkerRlarck-walker和和MiklosMiklos发现发现在大多数酵母中存在质粒。在大多数酵母中存在质粒。2.2.19781978，HmnenHmnen将来自一株酿酒酵母的将来自一株酿酒酵母的leu 2leu 2基因
2、导入另一株酿酒酵母，弥基因导入另一株酿酒酵母，弥补了后者的补了后者的Leu2Leu2缺陷，标志着酵母表缺陷，标志着酵母表达系统的建立。达系统的建立。3.3.19811981，HinnenHinnen等用酵母基因表达系统等用酵母基因表达系统表达了人干扰素。表达了人干扰素。4.4.19831983，我国首次用酵母菌表达了乙型，我国首次用酵母菌表达了乙型肝炎病毒表面抗原基因。肝炎病毒表面抗原基因。5.5.19961996，完成了第一个真核生物，完成了第一个真核生物酿酿酒酵母全基因组的测序。酒酵母全基因组的测序。二二酵母菌是外源基因最成功的真核生物表达系统酵母菌是外源基因最成功的真核生物表达系统1.优
3、势在于：优势在于：安全无毒，不致病；安全无毒，不致病；有较清楚的遗传背景，容易进行遗有较清楚的遗传背景，容易进行遗传操作；传操作；易进行载体易进行载体DNADNA的导入。的导入。DNADNA转化技转化技术的不断发展优化，多数酵母菌可术的不断发展优化，多数酵母菌可以取得较高的转化率；以取得较高的转化率；培养条件简单，容易进行高密度培养条件简单，容易进行高密度发酵；发酵；能将外源基因表达产物分泌到培能将外源基因表达产物分泌到培养基中；养基中；有类似高等真核生物的蛋白质翻有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能。译后的修饰功能。2.缺陷在于：缺陷在于：表达效率相对低；表达效率相对低；酵母常有密码子
4、偏爱性，真核基酵母常有密码子偏爱性，真核基因在其中表达时需要人工修正。因在其中表达时需要人工修正。三三酵母基因工程的发展现状酵母基因工程的发展现状目前酵母基因工程中发展和应用较目前酵母基因工程中发展和应用较多有酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母等，多有酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母等，其应用主要体现在以下两方面：其应用主要体现在以下两方面：1.酿酒酵母的自身改造：酿酒酵母的自身改造：将葡萄糖淀粉酶基因导入酿酒酵母将葡萄糖淀粉酶基因导入酿酒酵母（可自身分泌葡萄糖淀粉酶）。（可自身分泌葡萄糖淀粉酶）。将外源的蛋白水解酶基因导入酿酒酵将外源的蛋白水解酶基因导入酿酒酵母（可自身分泌蛋白水解酶）母（可自身分泌蛋白水解酶
5、）将将- -葡聚糖酶基因导入酿酒酵母葡聚糖酶基因导入酿酒酵母（可有效降解麦芽汁中的（可有效降解麦芽汁中的- -葡聚葡聚糖，改善啤酒的过滤效率）糖，改善啤酒的过滤效率）将将ATPATP硫酸化酶和腺苷酸硫酸激酶硫酸化酶和腺苷酸硫酸激酶在酿酒酵母体内表达（促进在酿酒酵母体内表达（促进SOSO2 2的的生成，维持啤酒风味的稳定）生成，维持啤酒风味的稳定）将人血清清蛋白（将人血清清蛋白（HASHAS）基因转化）基因转化到酿酒酵母（生产出富含到酿酒酵母（生产出富含HASHAS的啤的啤酒新品种）酒新品种）2.2.酵母表达异源蛋白酵母表达异源蛋白表达水平表达水平: :酵母表达系统主要用酵母表达系统主要用于表达
6、外源基因，表达水平的高于表达外源基因，表达水平的高低直接关系到其应用价值。酵母低直接关系到其应用价值。酵母的高效表达从三方面实现：的高效表达从三方面实现：A.A.通过开发高效的启动子提高和控制通过开发高效的启动子提高和控制外源基因的转录水平。外源基因的转录水平。B.B.提高表达载体在细胞中的稳定性。提高表达载体在细胞中的稳定性。C.C.通过多次同源重组以及通过多次同源重组以及rDNArDNA介导的介导的整合两种方式提高表达基因在细胞整合两种方式提高表达基因在细胞中的拷贝数。中的拷贝数。表达质量：除表达水平外，外源表达质量：除表达水平外，外源基因表达质量的好坏也直接关系基因表达质量的好坏也直接关
7、系到酵母表达系统的应用价值。到酵母表达系统的应用价值。3.酵母基因工程的发展趋势酵母基因工程的发展趋势解决酵母基因工程中还存在的缺解决酵母基因工程中还存在的缺陷；陷；在人类基因组计划中的应用研究在人类基因组计划中的应用研究是一个重要的发展方向；是一个重要的发展方向；利用酵母基因工程筛选更多的制利用酵母基因工程筛选更多的制药；药；改造酿酒酵母自身，降低生产酒改造酿酒酵母自身，降低生产酒精的成本；精的成本；酵母的生理承受极限研究将引起酵母的生理承受极限研究将引起人们的关注。人们的关注。广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌提高重组异源蛋白产
8、率的诱变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌抑制超糖基化作用的突变宿主菌 减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 内源性蛋白酶缺陷型的突变受体菌内源性蛋白酶缺陷型的突变受体菌 第二节、酵母菌的宿主系统第二节、酵母菌的宿主系统一一广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌目前已广泛用于外源基因表达的研究的酵母菌包括：目前已广泛用于外源基因表达的研究的酵母菌包括：其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最详尽，但其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想 属名属名
9、 举例举例酵母属酵母属 酿酒酵母酿酒酵母克鲁维酵母属克鲁维酵母属 乳酸克鲁维酵母乳酸克鲁维酵母毕赤酵母属毕赤酵母属 巴斯德毕赤酵母巴斯德毕赤酵母裂殖酵母属裂殖酵母属 非洲酒裂殖酵母非洲酒裂殖酵母汉逊酵母属汉逊酵母属 多态汉逊酵母多态汉逊酵母二二提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌使啤酒酵母中异源蛋白产量提高和质量改善的突变使啤酒酵母中异源蛋白产量提高和质量改善的突变利用经典诱变技术筛选分离酿酒酵母的核突变株或细利用经典诱变技术筛选分离酿酒酵母的核突变株或细胞质突变株，可以提高重组异源蛋白在酵母菌中的合胞质突变株，可以提高重组异源蛋白在酵母菌中的合成产率。然而，有些在
10、表型上能提高某种特定异源蛋成产率。然而，有些在表型上能提高某种特定异源蛋白表达的突变株未必具有促进其它外源基因表达的能白表达的突变株未必具有促进其它外源基因表达的能力，因为提高一种特定异源蛋白合成和分泌的影响因力，因为提高一种特定异源蛋白合成和分泌的影响因素极其复杂，其中包括表达产物本身的生物化学和生素极其复杂，其中包括表达产物本身的生物化学和生物物理特性，只有那些能促进任何外源基因分泌表达物物理特性，只有那些能促进任何外源基因分泌表达的基因型稳定突变株，才能用作理想的基因工程受体的基因型稳定突变株，才能用作理想的基因工程受体细胞。细胞。 许多真核生物的蛋白质在其天门冬许多真核生物的蛋白质在其
11、天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，常常影酰胺侧链上接有寡糖基团，常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖链两部分组成。由糖基核心和外侧糖链两部分组成。三三抑制超糖基化作用的突变宿主菌抑制超糖基化作用的突变宿主菌酵母菌普遍拥有完整的糖基化系统，酿酵母菌普遍拥有完整的糖基化系统，酿酒酵母细胞内的天门冬酰胺侧链糖基修酒酵母细胞内的天门冬酰胺侧链糖基修饰和加工系统对来自高等动物和人的异饰和加工系统对来自高等动物和人的异源蛋白活性表达是极为有利的，但野生源蛋白活性表达是极为有利的，但野生型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很难控制，呈
12、超糖基化倾向，因此超糖基难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖基化缺陷菌株非常重要。化缺陷菌株非常重要。突变类型突变类型 生物效应生物效应 mnn mnn 甘露糖生物合成缺陷型甘露糖生物合成缺陷型 alg alg 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷天门冬酰胺侧链糖基化缺陷 och och 外侧糖链添加缺陷型外侧糖链添加缺陷型这些突变菌株不能在异源蛋白的天门冬酰这些突变菌株不能在异源蛋白的天门冬酰胺侧链上延长甘露多聚糖长链，这是酿酒胺侧链上延长甘露多聚糖长链，这是酿酒酵母超糖基化的一种主要形式。酵母超糖基化的一种主要形式。含有含有mnn9mnn9突变的酵母菌细胞缺少能聚合外侧突变的酵母菌细胞缺少能聚合外侧糖链的
13、糖链的a-1,6-a-1,6-甘露糖基转移酶活性，而甘露糖基转移酶活性，而och1och1突变株则不能产生膜结合型的甘露糖基转移突变株则不能产生膜结合型的甘露糖基转移酶。尽管其它类型的突变株尚未进行有效的酶。尽管其它类型的突变株尚未进行有效的鉴定，但它们却能使异源蛋白在天门冬酰胺鉴定，但它们却能使异源蛋白在天门冬酰胺侧链上进行有限度的糖基化作用，基本上杜侧链上进行有限度的糖基化作用，基本上杜绝了糖基外链无节制延长的超糖基化副反应。绝了糖基外链无节制延长的超糖基化副反应。4.4.减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 泛素介导的蛋白质降解作用泛素
14、介导的蛋白质降解作用A.A.第一类基因含有多个泛蛋白因子编码第一类基因含有多个泛蛋白因子编码重复序列，各重复序列头尾相连形成重复序列，各重复序列头尾相连形成多拷贝结构；多拷贝结构；酵母菌的泛蛋白因子编码基因分为两大类：酵母菌的泛蛋白因子编码基因分为两大类：B.B.第二类基因为单一泛蛋白因子编码序第二类基因为单一泛蛋白因子编码序列与另一个不相关的多肽编码序列的列与另一个不相关的多肽编码序列的融合基因，后者称为羧基延伸蛋白融合基因，后者称为羧基延伸蛋白（CEPCEP），它也有两种大小不同的序列，），它也有两种大小不同的序列，其中其中CEP52CEP52由由5252个氨基酸残基组成，而个氨基酸残基组
15、成，而CEP76-80CEP76-80则由则由76-8076-80个氨基酸残基组个氨基酸残基组成。成。 在酵母菌中共有四个基因编码泛蛋白因子：在酵母菌中共有四个基因编码泛蛋白因子：UBI1UBI1和和UBI2UBI2编码融合蛋白泛蛋白编码融合蛋白泛蛋白-CEP52-CEP52UBI3UBI3编码泛蛋白编码泛蛋白-CEP76-CEP76UBI4UBI4则编码一个五聚体泛蛋白因子则编码一个五聚体泛蛋白因子UBI1UBI1、UBI2UBI2和和UBI3UBI3基因均能在酵母菌对基因均能在酵母菌对数生长期内表达，当菌体进入稳定期后数生长期内表达，当菌体进入稳定期后便自动关闭，便自动关闭，UBI4UBI
16、4的表达时序与前三种的表达时序与前三种基因恰好相反，这说明四种基因编码产基因恰好相反，这说明四种基因编码产物的生物学功能并不完全相同。物的生物学功能并不完全相同。 A.A.第一类基因包括第一类基因包括UBC4UBC4、UBC5UBC5和和UBC7UBC7，其，其编码产物只拥有相应的保守结构域，多编码产物只拥有相应的保守结构域，多肽序列的其它区域并没有明显的同源性，肽序列的其它区域并没有明显的同源性，这些蛋白形成泛蛋白这些蛋白形成泛蛋白- -靶蛋白共价接合物靶蛋白共价接合物的活性严格依赖于的活性严格依赖于E3E3蛋白的存在；蛋白的存在；几个编码泛蛋白因子接合酶系统的酵母菌基因（几个编码泛蛋白因子
17、接合酶系统的酵母菌基因（UBCUBC）B.B.第二类基因包括第二类基因包括UBC1UBC1、UBC2UBC2、UBC3UBC3和和UBC6UBC6，它们的表达产物具有天然的，它们的表达产物具有天然的C C端端延伸活性，不需要延伸活性，不需要E2E2蛋白的参与便可蛋白的参与便可进行泛蛋白的接合反应。进行泛蛋白的接合反应。 如果外源基因表达产物在酵母菌如果外源基因表达产物在酵母菌中具有对泛蛋白依赖型降解作用中具有对泛蛋白依赖型降解作用的敏感性，则可通过下列方法使的敏感性，则可通过下列方法使这种降解作用减少到最低程度：这种降解作用减少到最低程度：A.第一种方法是以分泌的形式表达第一种方法是以分泌的形
18、式表达重组异源蛋白，异源蛋白在与泛重组异源蛋白，异源蛋白在与泛蛋白因子形成共价结合物之前，蛋白因子形成共价结合物之前，迅速被转位到分泌器中，即可有迅速被转位到分泌器中，即可有效避免降解作用；效避免降解作用；B.B.第二种方法是将外源基因的表达置第二种方法是将外源基因的表达置于一个可诱导的启动子控制之下，于一个可诱导的启动子控制之下，由于异源蛋白质在短期内集中表达，由于异源蛋白质在短期内集中表达，分子数占绝对优势的表达产物便能分子数占绝对优势的表达产物便能逃脱泛蛋白因子的束缚，从而减少逃脱泛蛋白因子的束缚，从而减少由降解效应带来的损失；由降解效应带来的损失；C.C.第三种方法是使用泛蛋白因子生物
19、第三种方法是使用泛蛋白因子生物合成缺陷的突变株作为外源基因表合成缺陷的突变株作为外源基因表达的受体细胞。达的受体细胞。 A.A.UBI4UBI4缺陷型：在酿酒酵母菌中，泛素缺陷型：在酿酒酵母菌中，泛素主要由主要由UBI4UBI4基因表达，基因表达，UBI4-UBI4-突变株正突变株正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低的多，因此度比野生株要低的多，因此UBI4UBI4缺陷缺陷突变株是外源基因表达理想的受体。突变株是外源基因表达理想的受体。减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌：减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌：泛素降解途径衰减的酿酒酵
20、母泛素降解途径衰减的酿酒酵母B.B.UBA1UBA1缺陷型：缺陷型：UBA1UBA1编码泛素激活酶编码泛素激活酶E1E1，UBA1UBA1突变株式致死性的，但其突变株式致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解。也能削弱泛素介导的蛋白降解。C.C.Ubc4-ubc5Ubc4-ubc5双突双突变型：七个泛素变型：七个泛素连接酶基因的突连接酶基因的突变对衰减蛋白降变对衰减蛋白降解作用同样有效。解作用同样有效。五五内源性蛋白酶缺陷型的突变受体菌内源性蛋白酶缺陷型的突变受体菌 酿酒酵母拥有二十多种蛋白酶，酿酒酵母拥有二十多种蛋白酶，尽管不是所有
21、的蛋白酶都能降解外源尽管不是所有的蛋白酶都能降解外源基因表达产物，但实验结果表明有些基因表达产物，但实验结果表明有些蛋白酶缺陷有利于重组异源蛋白的稳蛋白酶缺陷有利于重组异源蛋白的稳定表达。定表达。将大肠杆菌的将大肠杆菌的lacZlacZ作为报告基因分别导入两作为报告基因分别导入两株具有相同遗传背景的酿酒酵母菌中，其中一株具有相同遗传背景的酿酒酵母菌中，其中一株含有编码空泡蛋白酶基因株含有编码空泡蛋白酶基因PEP4PEP4的野生型菌株，的野生型菌株，另一株则为另一株则为pep4-3pep4-3突变株，比较这两株菌中突变株，比较这两株菌中b-b-半乳糖苷酶的活性，在同等试验条件下半乳糖苷酶的活性，
22、在同等试验条件下pep4-3pep4-3突变株中的突变株中的b-b-半乳糖苷酶活性明显高于半乳糖苷酶活性明显高于PEP4+PEP4+的野生菌，而且在间歇式发酵罐中，的野生菌，而且在间歇式发酵罐中，pep4-3pep4-3突突变株也能长到相当高的密度。变株也能长到相当高的密度。PEP4PEP4蛋白酶除了具有降解蛋白质的功能外，还蛋白酶除了具有降解蛋白质的功能外，还能对某些重组异源蛋白进行加工。例如，能对某些重组异源蛋白进行加工。例如，MFa1-MFa1-人神经生长因子（人神经生长因子（hNGFhNGF）原前体的融合蛋白只能）原前体的融合蛋白只能在在pep4pep4突变株细胞中进行正确的加工剪切，
23、这说突变株细胞中进行正确的加工剪切，这说明明PEP4PEP4蛋白酶或者细胞内其它一些被蛋白酶或者细胞内其它一些被PEP4PEP4蛋白酶蛋白酶激活和修饰的蛋白酶系统与重组异源蛋白的正确激活和修饰的蛋白酶系统与重组异源蛋白的正确加工剪切过程有关。加工剪切过程有关。第三节、酵母菌的载体系统第三节、酵母菌的载体系统载体的一般结构：载体的一般结构：选择标记选择标记复制子复制子表达盒表达盒启动子启动子先导序列先导序列终止子终止子有用的蛋白结构域有用的蛋白结构域一一酵母菌种的野生型质粒酵母菌种的野生型质粒1.1.酿酒酵母中的酿酒酵母中的22环状质粒环状质粒几乎所有的酿酒酵母都含有几乎所有的酿酒酵母都含有22
24、双双链环状质粒，拷贝数维持链环状质粒，拷贝数维持50-10050-100个。个。IrsIrs反向重复序列反向重复序列600bp600bp，重组，重组FLPFLP编码产物驱动编码产物驱动IrsIrs的同源重组，的同源重组，REPREP编码产物控制质粒的稳定性，编码产物控制质粒的稳定性，STBSTB是是REPREP的结合位点。的结合位点。接合酵母属中的接合酵母属中的pSRIpSRI、pSR1pSR1、pSB2pSB2和和pSR1pSR1以及克鲁维酵母属中的以及克鲁维酵母属中的pKD1pKD1质粒等，均有类似的结构。质粒等，均有类似的结构。 2.乳酸克鲁维酵母中的线性质粒乳酸克鲁维酵母中的线性质粒乳
25、酸克鲁维酵母中含有两种不同乳酸克鲁维酵母中含有两种不同的双链线性质粒的双链线性质粒pGKL1pGKL1和和pGKL2pGKL2，拷贝数为拷贝数为50-10050-100个，分别携带个，分别携带K1K1和和K2K2两种能致死宿主细胞的毒素两种能致死宿主细胞的毒素蛋白基因。蛋白基因。二二酵母菌克隆表达质粒的构建酵母菌克隆表达质粒的构建能在大肠杆菌中克隆，并且具有能在大肠杆菌中克隆，并且具有较高的拷贝数，可使外源基因转较高的拷贝数，可使外源基因转化到酵母细胞之前先在大肠杆菌化到酵母细胞之前先在大肠杆菌中扩增；中扩增；1.酵母克隆表达质粒的特点：酵母克隆表达质粒的特点：含有在酵母中便于选择的遗传标记，
26、含有在酵母中便于选择的遗传标记，这些标记一般能和酵母相应的突变体这些标记一般能和酵母相应的突变体互补，如互补，如Leu+Leu+、His+His+、Ura+Ura+、Trp+Trp+等，等，有些还携带用于大肠杆菌的抗生素抗有些还携带用于大肠杆菌的抗生素抗性标记；性标记；含有合适的限制酶切位点，以便外源含有合适的限制酶切位点，以便外源基因的插入。基因的插入。ARSARS为酵母菌中的自主复制序列，大为酵母菌中的自主复制序列，大小在小在0.8-1.5Kb,0.8-1.5Kb,染色体上每染色体上每30-40bp30-40bp就有一个就有一个ARSARS元件。元件。2.2.含有含有ARSARS的的YRp
27、YRp和和YEpYEp质粒及其构建质粒及其构建由染色体由染色体ARSARS构成的质粒称为构成的质粒称为YRpYRp，而由而由22质粒构建的杂合质粒为质粒构建的杂合质粒为YEpYEp。上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达最高可达200200个，但是经过几代培养个，但是经过几代培养后，质粒丢失率达后，质粒丢失率达50%-70%50%-70%，主要由，主要由于分配不均匀所致。于分配不均匀所致。CENCEN为酵母菌染色体为酵母菌染色体DNADNA上与染色体上与染色体均匀分配有关的序列。将均匀分配有关的序列。将CENCEN插入到插入到ARSARS质粒中，获得的新载体称
28、为质粒中，获得的新载体称为YCpYCp。YCpYCp质粒具有较高的有丝分裂稳定质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数通常只有性，但拷贝数通常只有1-51-5个。个。3.3.含有含有CENCEN的的YCpYCp质粒的构建质粒的构建利用酵母菌的端粒利用酵母菌的端粒TEL.CEN.ARSTEL.CEN.ARS等等DNADNA元件构建人工酵母染色体，可以元件构建人工酵母染色体，可以克隆扩增大片段的外源克隆扩增大片段的外源DNADNA，这是构，这是构建建YACYAC载体的基本思路载体的基本思路YACYAC载体的装载量可高达载体的装载量可高达800kb800kb，适，适用于构建人的基因组文库。用于构建人的
29、基因组文库。4.4.含有含有TELTEL的的YACYAC质粒的构建质粒的构建5.5.整合型质粒载体整合型质粒载体YIPYIP及其构建及其构建YIP YIP 载体由大肠杆菌质粒和酵母的载体由大肠杆菌质粒和酵母的 DNA DNA 片段组成，可与受体或宿主的染色体片段组成，可与受体或宿主的染色体 DNA DNA 同源重组，整合进入宿主染色体中，酵母同源重组，整合进入宿主染色体中，酵母片段只提供选择性标志，没有复制起点。片段只提供选择性标志，没有复制起点。转化率低（只有转化率低（只有1-101-10转化子转化子/ /微克微克DNADNA），），但转化子遗传性稳定，多用于遗传分析。但转化子遗传性稳定，多
30、用于遗传分析。6.6.复制型质粒载体复制型质粒载体YRPYRP及其构建及其构建同时含有大肠杆菌和酵母的自主复制基同时含有大肠杆菌和酵母的自主复制基因，又称穿梭载体；因，又称穿梭载体；带有选择标记和复制子的酵母的带有选择标记和复制子的酵母的DNADNA片片段插入到大肠杆菌质粒中构成的。段插入到大肠杆菌质粒中构成的。优缺点：转化率高，拷贝也高，但不稳优缺点：转化率高，拷贝也高，但不稳定，易丢失。定，易丢失。7.7.附加体型质粒载体附加体型质粒载体YEPYEP及其构建及其构建由大肠杆菌质粒、由大肠杆菌质粒、2u2u质粒以及酵母染色质粒以及酵母染色体的选择标记构成。体的选择标记构成。2u2u质粒含有自
31、主复制起始区（质粒含有自主复制起始区（OriOri）和）和STBSTB区，区，STBSTB序列能够使质粒在供体细胞序列能够使质粒在供体细胞中维持稳定。中维持稳定。对酵母基因很高的转化活性，比对酵母基因很高的转化活性，比YRPYRP型型载体更稳定，拷贝数也高，是基因克隆载体更稳定，拷贝数也高，是基因克隆中的常用载体。中的常用载体。YEp13质粒载体载体PYF92PYF92：酵母的酵母的2 2质粒质粒pBR322pBR322质粒质粒酵母的酵母的His+His+基因基因8.8.酵母人工染色体载体（酵母人工染色体载体（ YAC YAC ）YAC YAC 载体是由酵母染色体中分离出来的载体是由酵母染色体
32、中分离出来的 DNA DNA 复制起始序列、着丝点、端粒以及酵母选择复制起始序列、着丝点、端粒以及酵母选择性标记组成的能自我复制的线性克隆载体。性标记组成的能自我复制的线性克隆载体。 YAC YAC 载体是以质粒的形式出现，长度约载体是以质粒的形式出现，长度约 11.4kb 11.4kb ，带有人工染色体所需的一切元件。，带有人工染色体所需的一切元件。每个每个 YAC YAC 载体可以装进载体可以装进 100 100 万碱基以上的万碱基以上的大片段大片段 DNA DNA ，比柯斯质粒的装载能力要大，比柯斯质粒的装载能力要大得多。得多。复制元件：复制元件：YAC YAC 载体的复制元件是其核心组
33、成成分载体的复制元件是其核心组成成分自主复制序列自主复制序列用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒两个端粒两个端粒标记基因：主要采用营养缺陷型基因，标记基因：主要采用营养缺陷型基因，Trp+Trp+、Leu+Leu+、His+His+、Ura+Ura+等等第四节、酵母菌的转化系统第四节、酵母菌的转化系统一一酵母菌的转化程序酵母菌的转化程序二二转化质粒在酵母细胞中的命运转化质粒在酵母细胞中的命运三三用于转化子筛选的标记基因用于转化子筛选的标记基因一一酵母菌的转化程序酵母菌的转化程序1.1.酵母菌原生质体转化法酵母菌原生质体转化法早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中早
34、期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质球转化法。在稳定的原生质球转化法。在CaCa2+2+和和PEGPEG的的存在下，转化细胞可达存活的原生质球总存在下，转化细胞可达存活的原生质球总数的数的1%-5%1%-5%。但是操作周期长，而且转化。但是操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约。效率受到原生质再生率的严重制约。酿酒酵母的碱金属细胞经碱金属离酿酒酵母的碱金属细胞经碱金属离子（如子（如Li+Li+等）、等）、PEGPEG热休克处理后，热休克处理后，也可高效吸收质粒也可高效吸收质粒DNADNA。2.2.碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化酵母
35、菌原生质体和完整细胞均可在电击酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒条件下吸收质粒DNADNA，但在此过程中应，但在此过程中应避免使用避免使用PEGPEG，它对受电击的细胞具有，它对受电击的细胞具有较大的负作用。其优势在于不依赖于受较大的负作用。其优势在于不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件适用范围体细胞的遗传特征及培养条件适用范围广，而且转化率高达广，而且转化率高达10105 5转化子转化子/gDNA/gDNA。3.3.酵母菌电击转化酵母菌电击转化二二转化质粒在酵母细胞中的命运转化质粒在酵母细胞中的命运1.单双链单双链DNA均可高效转化酵母菌，但均可高效转化酵母菌，但单链单链DNA
36、的转化率是双链的的转化率是双链的1030倍。倍。2. 含有酵母复制子的单链质粒进入细含有酵母复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制。胞后，能准确地转化为双链并复制。3.3.不含复制子的单链质粒进入细胞后，不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体，这对能高效地同源整合入染色体，这对于体内定点突变酵母基因组极为有于体内定点突变酵母基因组极为有利。利。4.4.同源重组的频率取决于整合型质粒同源重组的频率取决于整合型质粒与受体菌基因组之间的同源程度以与受体菌基因组之间的同源程度以及同源区域长度，一般来说，整合及同源区域长度，一般来说，整合子占转化子总数的子占转化子总数的5
37、080%。三三用于转化子筛选的标记基因用于转化子筛选的标记基因用于酵母菌转化子筛选的标记基因：用于酵母菌转化子筛选的标记基因：营养缺陷型互补基因营养缺陷型互补基因显性基因显性基因1.1.营养缺陷型的互补基因营养缺陷型的互补基因营养缺陷型互补基因主要由氨基酸和营养缺陷型互补基因主要由氨基酸和核苷酸生物合成基因如：核苷酸生物合成基因如：Leu Leu 、TrpTrp、 HisHis、 LysLys、 Ura Ura 、AdeAde。但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难。陷型的受体非常困难。2.显性标记基因显性标记基因显性标记基因的编码产物显性标记基因的
38、编码产物标记基因标记基因 编码产物编码产物 遗传表型遗传表型 Aph 氨基糖苷转移酶氨基糖苷转移酶 抗抗G418 Cat 氯霉素乙酰转移酶氯霉素乙酰转移酶 抗氯霉素抗氯霉素 Dhfr 二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶 抗氨甲喋呤和磺胺抗氨甲喋呤和磺胺 Cup1 铜离子螯合物铜离子螯合物 耐受铜离子耐受铜离子 Suc2 蔗糖转化酶蔗糖转化酶 耐受高浓度蔗糖耐受高浓度蔗糖 Ilv2 乙酰乳糖合成酶乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草剂抗硫酰脲除草剂第五节、酵母菌的表达系统第五节、酵母菌的表达系统一一酵母菌启动子的基本特征和选择酵母菌启动子的基本特征和选择用于启动转录蛋白质结构基因的酵母菌用于启动转录蛋白质结构
39、基因的酵母菌型启动子的特征：型启动子的特征：基本区基本区调控区调控区TATATATA盒盒转录起始位点。转录起始位点。上游激活系列（上游激活系列（UASUAS）上游阻遏序列（上游阻遏序列（URSURS）1.利用启动子探针质粒可从酵母菌基因组中利用启动子探针质粒可从酵母菌基因组中克隆和筛选具有特殊活性的强启动子；克隆和筛选具有特殊活性的强启动子；2.从已有的启动子中构建杂合启动子。从已有的启动子中构建杂合启动子。1.1.利用启动子探针质粒可从酵母菌基因组中利用启动子探针质粒可从酵母菌基因组中克隆和筛选具有特殊活性的强启动子，所克隆和筛选具有特殊活性的强启动子，所使用的无启动子报告基因为疱疹单纯病毒
40、使用的无启动子报告基因为疱疹单纯病毒的胸腺嘧啶激酶基因（的胸腺嘧啶激酶基因（HSV1-TKHSV1-TK）。）。Thd + ATP TMP + ADP TK利用氨甲喋呤和对氨基苯磺酰胺抑制其利用氨甲喋呤和对氨基苯磺酰胺抑制其dTMPdTMP的的生物合成。生物合成。将将HSV1-TKHSV1-TK基因与基因与pJDB207pJDB207重组构建一个启动重组构建一个启动子探针质粒，在子探针质粒，在TKTK基因上游的单一限制性酶切基因上游的单一限制性酶切口处插入随机断裂的酵母菌基因组口处插入随机断裂的酵母菌基因组DNADNA片段，片段，从含有氨甲喋呤、对氨基苯磺酰胺以胸腺嘧啶从含有氨甲喋呤、对氨基苯
41、磺酰胺以胸腺嘧啶的选择培养基上即可获得含有启动子活性片段的选择培养基上即可获得含有启动子活性片段的阳性转化子。的阳性转化子。将酿酒酵母的乙醇脱氢酶将酿酒酵母的乙醇脱氢酶基因（基因（ADH2ADH2）所属启）所属启动子的上游调控区与甘油醛动子的上游调控区与甘油醛-3-3-磷酸脱氢酶基因磷酸脱氢酶基因（GAPDHGAPDH）所属启动子的下游基本区重组在一起，）所属启动子的下游基本区重组在一起，构建出构建出ADH2-GADPHADH2-GADPH型杂合启动子。型杂合启动子。ADH2ADH2启动子为启动子为葡萄糖阻遏并可用乙醇诱导，而葡萄糖阻遏并可用乙醇诱导，而GADPHGADPH启动子是启动子是酿酒
42、酵母细胞中最强的组成型表达启动子。酿酒酵母细胞中最强的组成型表达启动子。2.2.杂合启动子杂合启动子另一个相似的杂合启动子由丙糖磷酸另一个相似的杂合启动子由丙糖磷酸异构酶（异构酶（TPITPI）基因的强启动子和一）基因的强启动子和一个温度依赖型阻遏系统（个温度依赖型阻遏系统（sir3-8ts-sir3-8ts-MATa2MATa2）的操作子序列构成，这种杂）的操作子序列构成，这种杂合启动子的一个显著特征是可用温度合启动子的一个显著特征是可用温度诱导表达外源基因。诱导表达外源基因。 二酵母菌启动子的可调控表达系统1.1.温度控制性启动子温度控制性启动子酵母交配型转变酵母交配型转变酵母有两种交配类
43、型酵母有两种交配类型 a a 和和，单倍体孢，单倍体孢子子 a a 和和之间交配才产生之间交配才产生 a/ a/ 二倍体，二倍体，经减数分裂及产孢过程形成经减数分裂及产孢过程形成4 4 个单倍体个单倍体孢子；相同交配型的单倍体孢子之间不孢子；相同交配型的单倍体孢子之间不能发生交配。能发生交配。酿酒酵母的酿酒酵母的a a和和两种单倍体，分别由两种单倍体，分别由MATaMATa和和MATMAT两种等位基因决定。两种等位基因决定。MATMAT由顺反子由顺反子MAT1MAT1和和MAT2MAT2组成，前组成，前者决定者决定11的激活过程，后者决定的激活过程，后者决定22阻遏阻遏过程。过程。MATaMA
44、Ta中，中，a1a1和和a2a2蛋白共同决定蛋白共同决定a1- a2a1- a2阻阻遏遏交配型转换的遗传基础：交配型转换的遗传基础：控制交配型的控制交配型的MATMAT基因位于第基因位于第3 3染色体上，染色体上，MATaMATa：a a交配型，交配型，MATMAT：交配型；两交配型；两基因互为等位基因；在基因互为等位基因；在MATMAT基因两端有同基因两端有同源序列源序列HMLHML和和HMRaHMRa，由于两基因上游存，由于两基因上游存在沉默子，故不表达，但可分别与在沉默子，故不表达，但可分别与MATMAT、MATaMATa基因序列相同。基因序列相同。 遗传学家们发现了遗传学家们发现了4
45、4个不连锁的基因沉默交配型个不连锁的基因沉默交配型调节基因，调节基因，SIRSIR（silent information silent information regulatorregulator）1 1、2 2、3 3和和4 4，这些基因产物共同起，这些基因产物共同起反式作用（它们并不在同一条的染色体上）来阻反式作用（它们并不在同一条的染色体上）来阻止沉默交配型基因的表达。若这止沉默交配型基因的表达。若这4 4个个SIRSIR基因中任基因中任何一个基因失去作用的话，那么何一个基因失去作用的话，那么HMLHML和和HMRaHMRa基基因就会以因就会以MATMAT座位上的基因相同的速率进行转录。
46、座位上的基因相同的速率进行转录。 利用上述细胞类型决定簇的两种特异性利用上述细胞类型决定簇的两种特异性突变基因可以构建对克隆的外源基因表突变基因可以构建对克隆的外源基因表达进行温度控制的二元系统达进行温度控制的二元系统 ：A.A.温度敏感型突变体温度敏感型突变体sir3-8sir3-8tsts。B.B.2 2蛋白的突变体蛋白的突变体hmlhml2 2- -102102-导致它导致它在与在与a1a1蛋白交配时对蛋白交配时对MATMAT顺反子阻遏活顺反子阻遏活性的丧失，但仍保留性的丧失，但仍保留a-a-特异性基因的能力。特异性基因的能力。l 因此具有因此具有MATa-MATa-hmlhml2 2-
47、 -102102-HMRa-HMRa-sir3sir3- -8 8tsts基因型的酵母细胞在基因型的酵母细胞在2525培养时，应培养时，应具有具有a a交配类型，因为此时只有交配类型，因为此时只有MATaMATa基因基因能表达，能表达，hmlhml2 2- -102102和和HMRaHMRa均为均为SirSir蛋白蛋白所阻遏。所阻遏。D.D.当细胞生长在当细胞生长在3535时，时，MATMAT、HMLHML和和HMRHMR基因均能表达，只有基因均能表达，只有2 2基因被阻遏，因此细胞呈基因被阻遏，因此细胞呈现现交配型。交配型。A.A.当外源基因置于当外源基因置于a-a-特异性基因的启动特异性基
48、因的启动子控制之下时，子控制之下时，a a交配型的受体细胞在交配型的受体细胞在2525时可以表达该基因，但在时可以表达该基因，但在3535时时不表达。不表达。上述系统为外源基因的表达提供了一种上述系统为外源基因的表达提供了一种二元调控模式：二元调控模式：a型启动子B.B.如果外源基因与如果外源基因与- -特异性基因的启动特异性基因的启动子重组，则仅在子重组，则仅在3535时表达，而在时表达，而在2525不表达。不表达。型启动子2.超诱导型启动子超诱导型启动子当酿酒酵母生长在无半乳糖存在的当酿酒酵母生长在无半乳糖存在的培养基时，其培养基时，其GAL1GAL1、 GAL7GAL7、 GAL10GA
49、L10启动子受到阻遏；加入半乳启动子受到阻遏；加入半乳糖时，启动子活性被诱导糖时，启动子活性被诱导10001000倍。倍。3.3.严紧控制表达系统：启动子受某种因素严紧控制表达系统：启动子受某种因素的调节，使其表达控制在一定的水平。的调节，使其表达控制在一定的水平。一种以人雄激素受体为中心的严紧控制表达系一种以人雄激素受体为中心的严紧控制表达系统能有效地将外源基因的表达水平控制在一个统能有效地将外源基因的表达水平控制在一个合适的范围。此系统中，雄激素受体表达水平、合适的范围。此系统中，雄激素受体表达水平、雄激素浓度以及重组质粒拷贝数三者之间的平雄激素浓度以及重组质粒拷贝数三者之间的平衡，可以有
50、效作用于对雄激素具有应答能力的衡，可以有效作用于对雄激素具有应答能力的启动子。启动子。三三外源基因在酵母菌种表达的限制性因素外源基因在酵母菌种表达的限制性因素1.1.外源基因稳态外源基因稳态mRNAmRNA的浓度的浓度2.2.外源基因外源基因mRNAmRNA的翻译活性的翻译活性3.3.酵母菌对密码子的偏爱性酵母菌对密码子的偏爱性-在酿酒酵在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质中母中，高丰度的蛋白质中96%96%以上的氨以上的氨基酸是由基酸是由2525个密码子编码的个密码子编码的4.4.外源基因稳定态外源基因稳定态mRNAmRNA的半衰期的半衰期四四酵母菌表达系统的选择酵母菌表达系统的选择1.1.酿酒酵母
