1、慢性乙型肝炎慢性乙型肝炎 主要内容主要内容 乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒 荧光定量荧光定量PCR技术技术 HBV-DNA与临床与临床什么是乙肝？什么是乙肝？乙肝：乙肝：是指由是指由乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒引起的，以肝脏损引起的，以肝脏损害为主的一组全身性传染病。害为主的一组全身性传染病。临床表现：临床表现：以疲乏、食欲减退、厌油、肝功能异以疲乏、食欲减退、厌油、肝功能异常为主，部分病例呈现黄疸。常为主，部分病例呈现黄疸。一、形态和生物学特性：一、形态和生物学特性：HBV 感染者血清中存在三种形式的病毒颗粒：感染者血清中存在三种形式的病毒颗粒：大球形颗粒（大球形颗粒（Dane）：完整的病毒颗粒，含量
2、最少）：完整的病毒颗粒，含量最少 包膜：包膜：HBsAg，糖蛋白，脂质，糖蛋白，脂质 核心：核心：DNA，DNA聚合酶，聚合酶，HBcAg 是病毒复制的主体。是病毒复制的主体。小球形颗粒：小球形颗粒： 仅仅HBsAg ，无核酸，无感染性，含量最多，无核酸，无感染性，含量最多管形颗粒：仅管形颗粒：仅HBsAg ，无核酸，无感染性，无核酸，无感染性HBV抵抗力很强，在血清中抵抗力很强，在血清中30-32可保存可保存6个月，个月，-20可保存可保存15年。年。电镜下HBV颗粒HBV病毒结构示意图三、抗原抗体系统三、抗原抗体系统HBsAg是是HBV感染的主要标志，感染的主要标志，2-12周出现。只有抗
3、原性，无传周出现。只有抗原性，无传染性。染性。目前感染，患者或病毒携带者。目前感染，患者或病毒携带者。抗抗-HBs保护性抗体，保护性抗体，曾感染或免疫曾感染或免疫HBeAgHBV复制及强感染性的指标，仅见于复制及强感染性的指标，仅见于HBsAg阳性患者，阳性患者，HBeAg阳性标本阳性标本HBV DNA检出率检出率90左右，两者有着良好左右，两者有着良好的相关性的相关性抗抗-HBe有一定的保护作用，有一定的保护作用，感染恢复期，传染性低，病情趋于稳感染恢复期，传染性低，病情趋于稳定，定，预后良好预后良好抗抗-HBc非保护性抗体，非保护性抗体，曾感染，病情趋于稳定。曾感染，病情趋于稳定。HBcA
4、b-IgM提示提示HBV处于复制状态处于复制状态HBcAg主要存在于主要存在于感染的肝细胞感染的肝细胞核心，血循环中游离的极少。核心，血循环中游离的极少。与与HBV DNA呈正相关，呈正相关，HBV复制及强感染性的指标。复制及强感染性的指标。 四、分子生物学标记四、分子生物学标记1.HBV-DNA:主要存在于主要存在于Dane颗粒中，是病毒复制和传染性颗粒中，是病毒复制和传染性的直接标志。的直接标志。2. HBV-DNA多聚酶：位于核心部位，血清中多聚酶：位于核心部位，血清中HBV-DNA多聚多聚酶活力是判断病毒复制、传染性高低的指标之一。酶活力是判断病毒复制、传染性高低的指标之一。流行病学流
5、行病学1.传染源传染源：急、慢性乙型肝炎患者，病毒携带者；2.传播途径传播途径：母婴传播、血液及血制品传播、破损的皮肤和黏膜及性接触传播，日常工作或生活接触一般不会传染 HBV ；经吸血昆虫传播未证实；3.易感人群易感人群：抗HBs阴性者。婴幼儿是获得HBV感染的最危险时期。 全球20亿曾感染HBV，慢性HBV感染者3.5亿 我国属 HBV 感染高流行区，一般人群 HBsAg阳性率为9.09%，总感染率为57.6%（包括既往感染和现症感染）。接种与未接种乙型肝炎疫苗人群的HBsAg阳性率分别为4.51%和9.51%。 男性高于女性，有家庭聚集现象，婴幼儿感染多见。自然史自然史4/9/20221
6、55年病死率70-86%5年病死率14-20%青少年和成人期5-10%12-25%5年6-15%5年25-30%婴幼儿期 发生肝硬化的高危因素包括：病毒载量高、HBeAg持续阳性、ALT水平高或反复地波动、嗜酒、合并HCV、HDV或HIV感染等。HBeAg阳性患者的肝硬化发生率要高于 HBeAg 阴性者 HBV感染是HCC的重要相关因素。肝硬化患者发生HCC高危因素包括：男性、年龄、嗜酒、黄曲霉素、合并HCV或HDV感染、持续肝脏炎症、持续HBeAg阳性及HBV DNA持续高水平等发病机制发病机制HBV携带者携带者HBsAg(+)HBeAg(+)/抗-HBe(-)HBV DNA +ALT 肝活
7、检 -慢乙肝慢乙肝HBsAg(+)HBeAg(+)/抗-HBe(-)HBV DNA + ALT/AST + 肝活检 +HBeAg(-)(-)慢乙肝慢乙肝HBeAg(-)/抗-HBe(+)HBV DNA +ALT + 肝活检 +非活动状态非活动状态HBsAg携带者携带者HBeAg(-)/抗-HBe(+)HBV DNA -ALT/AST - 肝活检 - 乙肝或HBsAg阳性史超过6个月，现HBsAg和/或HBV DNA仍阳性者，可诊断为慢性HBV感染慢性慢性乙型肝炎乙型肝炎隐匿性隐匿性慢性乙肝慢性乙肝乙型肝炎乙型肝炎肝硬化肝硬化携带者携带者 慢性HBV携带(耐受)非活动性HBsAg携带HBeAg(
8、+)HBeAg(-)慢性慢性HBV感染感染代偿期失代偿期HBsAg(-)，HBV DNA(+)根据肝功能损害程度分为轻度/中度/重度分为活动期/静止期ALT正常（一）携带者 大三阳或小三阳， HBV DNA为阳性或阴性，但 1 年内连续随访 3 次以上 ALT和AST均在正常范围，肝组织学检查无异常（二） 慢性乙型肝炎 大三阳或小三阳，HBV DNA阳性，血清ALT持续或反复升高，或肝组织学检查有肝炎病变 (三)隐匿性慢性乙型肝炎 - 血清HBsAg阴性，但血清和(或)肝组织中HBV DNA 阳 性 ， 并 有 慢 性 乙 型 肝 炎 的 临 床 表 现 。 患 者 可 伴 有血清抗-HBs、
9、抗-HBe和(或)抗-HBc阳性 - 另约20%隐匿性慢性乙型肝炎患者除HBV DNA阳性 外，其余HBV血清学标志均为阴性 - 诊断需排除其他病毒及非病毒因素引起的肝损伤 HBsAg和和HBeAg均阳性而均阳性而HBV DNA阴性？阴性？干扰素或拉米夫定等治疗后病毒复制受抑制。PCR所用引物相应的DNA序列发生突变，此引物与突变DNA不能配对结合。病毒DNA整合于宿主肝细胞染色体而血中游离HBV DNA很少或缺乏。为什么要检测为什么要检测HBV-DNA？ “大三阳大三阳”、“小三阳小三阳”、“携带者携带者”等免疫学指标反应的是机体等免疫学指标反应的是机体的免疫反应状态，不能反应体内病毒复制水
10、平与感染程度。的免疫反应状态，不能反应体内病毒复制水平与感染程度。血血清学指标清学指标()不能排除不能排除HBV感染。因此，要准确知道感染。因此，要准确知道HBV是否是否处于复制状态，最准确的方法还是通过检测处于复制状态，最准确的方法还是通过检测HBV DNA来决定。来决定。HBV DNA是是HBV本身的遗传物质，是病毒存在和复制的最可靠、本身的遗传物质，是病毒存在和复制的最可靠、最 直 接 的 指 标 ， 也 是 患 者 具 有 传 染 性 的 标 志 。最 直 接 的 指 标 ， 也 是 患 者 具 有 传 染 性 的 标 志 。怎样检测怎样检测HBV-DNA？荧光定量PCR技术荧光定量荧
11、光定量PCR技术技术Polymerase chain reaction(PCR)，聚合酶链式反应，是一种DNA的快速扩增技术。PCR技术通过两个短的称为引物的DNA小片段和一种耐热酶（TaqDNA聚合酶）的作用，经过高温变性、低高温变性、低温退火、适温延伸温退火、适温延伸三个步骤在3个小时内反复循环30-40次，把特定的DNA片段扩增1000万倍。 每个PCR体系含4种主要成分：含有待扩增序列的含有待扩增序列的DNA模板模板引物引物TaqDNA聚合酶聚合酶脱氧核糖核酸三磷酸（脱氧核糖核酸三磷酸（dNTP） 实时荧光定量PCR技术，是指在反应体系中加入荧光标记，利用荧光信号积累实时检测整个PCR
12、过程，通过标准曲线对PCR终产物的分析，最终实现对未知的起始模版进行定量分析的一种技术，是迄今对已知基因序列的核酸测定中最灵敏的方法。PCRPCR反应过程反应过程5533d.NTPsTaq 酶酶Primers5353535353535353反应组分反应组分变变 性性535353535353延延 伸伸53535353353TaqTaq55重重 复复退退 火火5353535355335353循环循环2 24 4个拷贝个拷贝循环循环3 38 8个拷贝个拷贝53535353535353535353533553535353TaqMan探针5533d.NTPsTaq酶Primers535353535353
13、5353反应体系反应体系变变 性性535353535353Taql53RQProbe53RQ535353RQ退 火531. 链取代Taq3QR5533QTaqR52. 水 解3. 聚 合53QTaqR354. 检测荧光533QTaqR5l 每产生一条DNA链，就切断一条探针 每切断一条探针，就产生一个荧光信号 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比原理图原理图血清标本采集一次性无菌注射器抽取受检者静脉血一次性无菌注射器抽取受检者静脉血3-53-5毫升，注入红帽无菌管中毫升，注入红帽无菌管中室温（室温（222225C25C）放置）放置303060 60 分钟分钟血标本使用水平离心机，血标本使用水
14、平离心机，40004000转转/ /分，离心分，离心5 5分钟分钟吸取上层血清，转移至吸取上层血清，转移至1.5ml1.5ml灭菌离心管灭菌离心管 严禁使用肝素抗凝血标本，抑制严禁使用肝素抗凝血标本，抑制PCRPCR反应反应结果分析实验室检查常用指标？实验室检查常用指标？常用指标常用指标 免疫学检查免疫学检查 病毒学检查病毒学检查 肝功能检查肝功能检查指标指标HBsAg抗抗-HBsHBeAg抗抗-HBe抗抗-HBc诊断诊断结结果果+大三阳，急性或慢性现症感染，大三阳，急性或慢性现症感染，传染性强传染性强+小三阳，有无传染性应结合小三阳，有无传染性应结合HBV DNA检测结果检测结果+HBV感染
15、恢复期，或感染恢复期，或S基因突变，基因突变，+急性肝炎早期，传染性强急性肝炎早期，传染性强+既往感染，有无传染性需结合既往感染，有无传染性需结合HBV DNA+感染恢复期，有免疫力，无传染感染恢复期，有免疫力，无传染性性+窗口期，抗窗口期，抗-HBs即将出现；即将出现；HBV感染已过感染已过+注射疫苗后；遥远的过去有注射疫苗后；遥远的过去有过过HBV感染感染免疫学检查免疫学检查-乙肝五项分析乙肝五项分析 乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒DNA(HBV DNA103copy/ml) 乙肝病毒基因型检测乙肝病毒基因型检测 乙肝病毒基因型变异检测乙肝病毒基因型变异检测病毒学检查病毒学检查 肝功能检查肝功能
16、检查 - ALT、AST：一般可反映肝细胞损伤程度，最常用 - 血清胆红素(BIL)：通常与肝细胞坏死程度有关 - 凝血酶原时间(PT)：反映肝脏凝血因子合成功能 - 胆碱酯酶(ChE)：反映肝脏合成功能，可作参考 - 白蛋白(ALB)：反映肝脏合成功能，A/G可作参考 - 甲胎蛋白(AFP)：出现明显升高往往提示发生HCC如何治疗？如何治疗？目前极少能治愈！是可以治疗的！病毒DNA整合于宿主肝细胞染色体能治愈吗？ 谁需要治疗？谁需要治疗？不论是大三阳还是小三阳，有以下情况者均需治疗：不论是大三阳还是小三阳，有以下情况者均需治疗： 肝功能异常。肝功能异常。 有明显的肝炎症状：乏力、厌食、黄疸、
17、肝区隐痛不适有明显的肝炎症状：乏力、厌食、黄疸、肝区隐痛不适等。等。 HBV DNA103copy/ml) 抗病毒抗病毒：目前尚无一种能迅速、直接杀死清除乙肝病毒的药物，最好的抗病毒药物疗效也仅能达到50左右。目前国际医学界公认的治疗慢性乙肝有确切疗效的抗病毒药物主要有两大类： ：重组人-1b干扰素、- 2a、 -2b干扰素等。：拉米夫定、阿德福韦。 调节免疫调节免疫 保肝降酶保肝降酶乙型肝炎治疗原则 改善症状，恢复肝功能；改善症状，恢复肝功能； 抗病毒；抗病毒； 抗肝纤维化，延缓肝硬化的发生；抗肝纤维化，延缓肝硬化的发生； 预防和监控肝癌；预防和监控肝癌； 无症状携带者无需抗病毒治疗。无症状
18、携带者无需抗病毒治疗。如何预防？如何预防？ 疫苗预防疫苗预防 阻断母婴传播阻断母婴传播 避免医源性传播避免医源性传播 乙型肝炎疫苗预防 - 自2005年6月，我国新生儿HBV疫苗接种完全免费 - 乙 肝 疫 苗 接 种 对 象 主 要 是 新 生 儿 ， 其 次 为 婴 幼 儿 和高危人群。全程共3针，按照0、1、6个月程序 - 新 生 儿 要 求 在 出 生 后 2 4 h r 内 接 种 。 单 用 疫 苗 阻 断母婴传播保护率87.8%，联合 HBIG 保护率95-97% - 接种后有抗体应答者保护效果一般至少持续12年 传播途径预防： 大力推广安全注射(包括针刺的针具)，对牙科器 械
19、、 内 镜 等 医 疗 器 具 应 严 格 消 毒 ； 严 格 防 止 医 源 性 传 播 ； 理 发 、 刮 脸 、 修 脚 、 穿 刺 和 纹 身 等 用 具 应 严 格 消 毒 ； 注 意 个 人 卫 生 ， 不 共 用 剃 须 刀 和 牙 具等用品；进行正确性教育；对HBsAg阳性孕妇， 应 避 免 羊 膜 腔 穿 刺 ， 并 缩 短 分 娩 时 间 ， 保 证 胎 盘 的完整性，尽量减少新生儿暴露于母血的机会 意外暴露HBV后预防 - 血清学检测：立即检测HBsAg、抗-HBs、ALT等， 并在3和6个月内复查。 - 主 动 和 被 动 免 疫 ： 如 已 接 种 过 乙 肝 疫 苗
20、 ， 且 已 知 抗-HBs10mIU/ml者，可不进行特殊处理。如未 接种过疫苗或虽接种过疫苗但抗-HBs10mIU/ml 或抗-HBs水平不详，应立即注射HBIG200-400IU， 并同时在不同部位接种第1针乙肝疫苗20g，于1 和6个月后分别接种第2针和3针乙肝疫苗各20g。 对患者和携带者的管理 - 对 慢 性 H B V 携 带 者 及 H B V 患 者 ， 除 不 能 献 血 和 国 家 法 律 规 定 不 能从事的特殊职业 ( 如服兵役 等 ) 以外，可照常生活、学习和工作，但要加强随访。 - 乙 肝 患 者 和 携 带 者 的 传 染 性 ， 主 要 取 决 于 血 液 中
21、 HBV DNA水平，与血清ALT/AST或胆红素水平无关。关于乙肝母婴传播？关于乙肝母婴传播？ 乙肝母婴传播的三种途径：乙肝母婴传播的三种途径： （1）宫内传播：是分娩以前在宫内通过胎盘等途径传播，这种情况较少。 （2）产时传播：发生在分娩过程中，由于母亲产道的血液、羊水和阴道分泌物中带有乙肝病毒，会使婴儿经口吞入或通过破损的皮肤黏膜而受传染，这种情况占绝大多数。 （3）产后传染：有可能通过哺乳或密切接触等途径传播，这种传播属于水平传播，比较常见。 乙肝患者怀孕的时机及注意事项：乙肝患者怀孕的时机及注意事项： 乙肝患者一定要在肝功能正常、HBV-DNA阴性，维持半年以上怀孕。一旦怀孕，应终止
22、使用各种具有肝毒性的药物，定期到医院进行孕期体检。合理调整饮食结构，主张均衡营养，避免体重增长过快，形成脂肪肝或造成肝脏负担。 HBsAg阳性孕妇分娩时应采取的预防措施：阳性孕妇分娩时应采取的预防措施： 分娩后对胎儿复苏动作应轻，防止损伤咽黏膜，造成感染。避免婴儿吞下可被污染的液体。如果孕妇HBsAg阳性，伴有HBeAg者，行剖腹产，避免胎儿经产道时吞入被污染的阴道分泌物。 HBsAg阳性孕产妇儿童应采取预防措施：阳性孕产妇儿童应采取预防措施： 乙肝表面抗原阳性孕产妇所生的新生儿，在出生后24小时内注射乙肝免疫球蛋白（100国际单位），并按照国家免疫规划要求，完成24小时内及1月龄合6月龄儿童的三次乙肝疫苗接种。等宝宝周岁到医院复查。乙肝妈妈母乳喂养有何禁忌：乙肝妈妈母乳喂养有何禁忌：肝功能正常、HBV-DNA阴性，孩子注射过乙肝免疫球蛋白和乙肝疫苗的情况才可以喂奶。但若婴儿口腔、咽喉、食道、胃肠粘膜等处有破损、溃疡或母亲乳头破裂者也应该尽可能避免给孩子哺乳。
