1、1破解呼吸道感染病原学诊断破解呼吸道感染病原学诊断的困境：需要你我他的困境：需要你我他王 辉北京大学人民医院检验科Email：L.CN.MKT.GM.04.2016.50592内 容n 呼吸道感染病原学n 困境和挑战n 可能的破解之道23William Osler, The Principles and Practice of Medicine, 1892Diagnosis! Diagnosis! Diagnosis! Medicine is a science of uncertainty and an art of probability. 最重要的是不要看远方模糊的事，而是做好手头清楚的
2、事 4欧洲流调：CAP的主要病原体病原体检出率(%)一项1996年11月至2008年7月在西班牙进行的CAP流调研究，纳入3,524例CAP患者(15%门诊患者,85%住院患者) ，其中1,463例患者病原学呈阳性反应。Cillniz C, et al. Thorax. 2011;66(4):340-346. 肺炎链球菌和非典型病原体是CAP最主要致病菌，混合感染占重要地位N=14635我国CAP的主要致病菌病原体检出率(%)入选2003年12月至2004年11月中国7个城市12个中心的665例CAP患者并进行病原体检测 2006年我国CAP的大型流调研究显示：肺炎支原体是我国CAP的最主要致
3、病菌，其次为肺炎链球菌1 在我国已经完成的另两项全国多中心成人CAP调查中，肺炎支原体感染的比例分别达到了20.7%和38.9%，均已超过了肺炎链球菌(分离率分别为10.3%和14.8%)，成为成人CAP最常见的致病原2,3 混合感染在社区呼吸道感染中占有重要地位，以细菌合并非典型病原体混合感染居多11.刘又宁 陈民钧 赵铁梅等. 中华结核和呼吸杂志.2006;29(1):3-8； Liu Y et al. BMC Infectious Diseases. 2009;9:31.3. Tao LL et al. Chin Med J (Engl). 2012;125(17):2967-2972.
4、6成人病毒性肺炎发病率高，但长期被忽视n每年新发病毒性肺炎约200万例，其中成人和儿童各100万例n10项成年人CAP综述（共2910例），病毒性肺炎占22%Jennings LC , et al. Thorax 2008; 63:42-8. Ruuskanen O. Lancet 2011;377:1264-75.6病毒科病毒种核酸类型正粘病毒科流感病毒单股RNA副粘病毒科呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、人类偏肺病毒单股RNA披膜病毒科风疹病毒单股RNA小RNA病毒科鼻病毒、柯萨奇病毒和埃可病毒的部分型别单股RNA腺病毒科腺病毒双股DNA冠状病毒科人类冠状病毒、SARS冠状
5、病毒单股RNA疱疹病毒科单纯疱疹病毒、带状疱疹、EB和CMV双股DNA细小病毒科人类博卡病毒单链DNA呼肠孤病毒科呼肠孤病毒（1，2，3，4型）双链RNA7Pathogen identifiedPatients n (%)Respiratory Viruses262 (27.5) Influenza virus A94 (9.9) Human rhinovirus41 (4.3) Adenovirus40 (4.2) Human metapneumovirus17 (1.8) Parainfluenza virus type 116 (1.7) Parainfluenza virus type
6、 314 (1.5) Parainfluenza virus type 211 (1.2) Influenza virus B6 (0.6) Human enterovirus5 (0.5) Respiratory syncytial virus type A5 (0.5) Respiratory syncytial virus type B4 (0.4) Coronavirus OC43/HKU14 (0.4) Coronavirus 229E/NL634 (0.4) Parainfluenza virus type 4 1 (0.1) Bocavirus0 (0.0)北京市成人CAP监测网
7、：病毒性肺炎27.5%2010-2012年本课题组牵头，联合北京市12家医院n954例成人CAP患者中，病毒性肺炎占27.5%。n重要病毒：流感病毒、鼻病毒、腺病毒、偏肺病毒和呼吸道合胞病毒。 JiuXin Qu. BMC Infect DIs 2015 online first 78上呼吸道标本类型及适应症8上呼吸道感染标本的采集9 用拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁（3-5次）n 咽拭子的采集方法n 咽拭子的采集正确拿咽拭子的方法正确拿咽拭子的方法错误拿咽拭子的方法错误拿咽拭子的方法上呼吸道感染标本的采集上呼吸道感染标本的采集11 请患者头部保持不动，将拭子轻轻转动缓缓插入患者鼻腔，不要用
8、力， 当遇到阻力后即到达后鼻咽，停留数秒吸取分泌物，轻轻旋转取出拭子鼻 拭 子 标 本 的 采 集l病毒：选用涤纶或人造棉头塑料柄的拭子（如：聚丙烯纤维头），不能用藻酸钙及木柄拭子，可使病毒失活或抑制PCR反应。脱脂棉拭子含有荧光物质，影响荧光定量PCR结果l细菌：选用藻酸钙拭子。棉拭子、尼龙拭子可抑制百日咳博德特菌生长l采样后用于病毒检测的拭子，将拭子头浸入含一定量采样液的螺口管中，尾部弃去，旋紧管盖，及时送检，如不能立即送检，可暂时储存于4冰箱内，严禁-20 冷冻。用于细菌检测的拭子插回采样管中或适宜的转运装置中，立即送检12上呼吸道感染标本的采集支原体保存液病毒采样拭子细菌采样拭子13下
9、呼吸道标本类型及适应症下呼吸道标本类型及适应症1314下呼吸道标本类型及适应症14下呼吸道标本中，下呼吸道标本中，痰痰& &支气管镜标本支气管镜标本最为重要！最为重要！Fukuyama et al. BMC Infectious Diseases 2014, 14:534标本的质量标本的质量Fukuyama et al. BMC Infectious Diseases 2014, 14:534标本的质量Fukuyama et al. BMC Infectious Diseases 2014, 14:534In conclusion, sputum Gram stain is highly sp
10、ecific for the etiologic diagnosis of CAP and HCAP and useful in guiding pathogen-targeted antibiotic treatment病例病例1 1 男性，64岁 既往史：既往史： 心肌梗死2次 严重的充血性心力衰竭，行双侧冠状动脉旁路移植手术 心脏移植（植入式心脏复律除颤器） 症状：症状：呼吸困难、干咳、低热 初步诊断：初步诊断： 支气管肺泡灌洗：无致病菌， 正常菌群（真菌和分枝杆菌） 胸片：右下肺局限性密度影肺癌？Seifert H. CID, 2009,48:S238-45手术，手术， 抗菌药物抗菌药
11、物 患者治愈患者治愈 血培养：血培养： 初次：类白喉杆菌（皮肤污染） 第二次：马红球菌（免疫缺陷宿主的条件致病菌） 最终诊断：最终诊断：细菌性肺炎 治疗：治疗：红霉素，3个月，治愈微生物结果条件致病菌感染诊断关键肺内肿块基本吸收Seifert H. CID, 2009,48:S238-4520医院获得性肺炎（医院获得性肺炎（HAPHAP）的微生物标本采集和送检要求）的微生物标本采集和送检要求病原检验项目最优标本转运要求；送检最佳时间铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、肠杆菌属、粘质沙雷菌、不动杆菌属、嗜麦芽窄食单胞菌、金黄色葡萄球菌和MRSA、流感嗜血杆菌血培养血培养已经注入标本的培养瓶室
12、温下尽快送抵实验室。革兰染色定量或半定量需氧和厌氧细菌培养痰；支气管抽吸物；支气管肺泡灌洗液；PSB；肺组织无菌杯或管，室温，2h肺炎链球菌同上尿液无菌容器，室温，2h混合厌氧菌（吸入）革兰染色培养PSB标本肺组织无菌管；无菌容器放组织；室温，2h曲霉菌属真菌涂片或其他真菌染色方法支气管抽吸物无菌杯或管，室温，2h真菌培养支气管肺泡灌洗液；PSB半 乳 甘 露 聚 糖（GM）1-3 -D葡聚糖（G）血清支气管肺泡灌洗液 促凝管，室温，立即送检无菌杯或管，室温，2h老年老年CAPCAP患者的病原学诊断患者的病原学诊断 20112011年年ERS/ESCMDERS/ESCMD指南建指南建议议所有住
13、院患者所有住院患者均应进行均应进行血培养血培养 北美指南建议对更严重的北美指南建议对更严重的患者进行血培养患者进行血培养 血培养有助于血培养有助于确诊潜在的确诊潜在的肺炎病原体和根据分离病肺炎病原体和根据分离病原菌对疾病进行重新评估原菌对疾病进行重新评估血培养血培养染色法染色法呼吸样本培养呼吸样本培养尿抗原检测尿抗原检测 对初始抗生素治疗方案调对初始抗生素治疗方案调整具有重要的影响作用整具有重要的影响作用 但同样的呼吸道标本但同样的呼吸道标本缺乏缺乏较高的预测较高的预测 老年患者存在功能障碍：老年患者存在功能障碍：无法获得可评价的痰液；无法获得可评价的痰液；口咽定植的口咽定植的G G- -菌、
14、金黄色菌、金黄色葡萄球菌和葡萄球菌和MDRMDR菌较多菌较多 肺炎链球菌和嗜肺军团菌肺炎链球菌和嗜肺军团菌的细菌抗原采用尿免疫层的细菌抗原采用尿免疫层析技术检测析技术检测 肺炎链球菌抗原的敏感性肺炎链球菌抗原的敏感性约大于约大于60%60%，成人患者大成人患者大于于90%90% 军团菌抗原检测的敏感性军团菌抗原检测的敏感性大于大于90%90%老年老年CAPCAP患者的病原学诊断方法患者的病原学诊断方法Gonzlez-Castillo J,et al.Rev Esp Quimioter.2014;27(1)：69-8622指南中强调：血培养至少送2套 在发热开始的在发热开始的24 h内进行血内进
15、行血培养。培养。 尽力保证在尽力保证在抗感染治疗前抗感染治疗前获得获得首份首份血培养标本。血培养标本。 同时经同时经2个独立部位抽取血标本个独立部位抽取血标本，此结果比单一部位的血培养更有临床此结果比单一部位的血培养更有临床意义。意义。除外新生儿外，不建议只进行单套除外新生儿外，不建议只进行单套血培养血培养（级）。级）。 48-96 h后评估治疗效果后评估治疗效果，再次血培养不能单取，再次血培养不能单取1套，必须同时抽取套，必须同时抽取2套标套标本本（级）。级）。 但对怀疑但对怀疑血管内的感染血管内的感染，则应该间隔一段时间取，则应该间隔一段时间取不同部位不同部位的静脉穿刺抽的静脉穿刺抽血，有
16、助于诊断持续性菌血症（血，有助于诊断持续性菌血症（级）。级）。Crit Care Med 2008 Vol. 36, No. 4；CLSI指南；英国指南23“双抽四瓶”，每瓶8-10ml 标示“左侧”、“右侧” 无菌体液 如胸水等手 册 宣 讲24痰标本在病原学诊断中面临的困难 CAP患者40%以上患者无法或及时产生痰 痰标本合格率较低，甚至送检唾液 培养：痰培养阳性率受多种影响因素影响且影响极大，包括标本采集、运输、快速处理、合理应用细胞学判断标准、前期无抗生素治疗、解释技能 涂片革兰染色：最新数据表明，通过革兰染色辨别1669个CAP住院病人合格标本，只有14%可以辨别出主要形态类型24A
17、merican Thoracic Society, Infectious Diseases Society of America. Guidelines on the Management of Community-Acquired Pneumonia in Adults, 2007:44 (Suppl 2)25痰标本不同外观25唾液唾液脓痰脓痰粘液样痰粘液样痰带血痰带血痰2626标本质量评估痰涂片标本质量评估痰涂片Garbage in！唾 液27一个小调查 随机调查中国15家医院2014年痰标本数据2728痰标本判读标准的比较2829合格痰标本：吞噬很重要29WBC内吞噬：葡萄球菌30涂片项
18、目报告格式30普通细菌涂片及染色31 痰培养标本质量情况总数不合格不合格率儿科9777.78%内科2620188371.87%急诊64444168.48%血液科1501102067.95%外科39726767.25%妇产科231356.52%门诊26715056.18%ICU121555745.84% 13家医院，痰标本合格率不足50%32粒缺患者肺炎的致病菌Curr Opin Pulm Med 2015, 21:26027133对于确诊IA：GM的诊断效能Curr Opin Pulm Med 2015, 21:26027134粒缺肿瘤肺炎：微生物学评价BAL是很好的诊断工具Curr Opin
19、 Pulm Med 2015, 21:26027135恶性粒细胞减少患者的肺炎诊断 临床评估+微生物学评估+分子 微生物学评估：最可靠：从无菌部位分离or呼吸道分泌物中非共生菌BAL是首选下呼吸道标本，越早采集越好，尤其使用抗生素之前，但不能延误治疗支气管活检（TBBX）可揭示侵入血流感染，但培养不优于BAL，且因为恶性粒细胞减少继发血小板减少使得并发症风险高分子方法：半乳甘露聚糖分子试验测试侵袭性曲霉病（FDA已经批准）Scott E. Evans and David E. Ost, Pneumonia in the neutropenic cancer patient, Infectiou
20、s diseases, 2015,21(3):261-27136日均痰标本与BAL送检对比36BAL标本量要求 生理盐水总灌入量不少于100ml，分3-5份进行（标准为200-240ml，分4等份进行） 好的BAL标本，至少30%灌入液回收 30%回收率的被视作不合格，需要重新采集（尤其是10个菌落培养后菌落计数：相同形态菌落数103CFU/mL制作涂片（细胞离心)血平皿巧克力平皿麦康凯平皿若用接种环密涂平板， 生长的菌落数量会低于实际数量。但用 L 棒涂布平板计数， 定量培养结果更准确40肺泡灌洗液的涂片革兰染色 适量BALF标本进行细胞离心，经自然干燥、甲醇固定或火焰快速固定3次，革兰染色
21、 标本质量判断以扁平鳞状上皮细胞占全部细胞比例1% 为合格标本 敏感度为104个细胞/mL，若每个油镜视野可见1个或多个细菌，报告革兰染色形态及白细胞结果，提示此菌与活动性肺炎相关。40Patrick RM. Manual of clinical microbiology. 9th ed. US: ASM Press, 2007: 307- 308中华人民共和国卫生行业标准下呼吸道感染细菌培养操作规范S.41肺泡灌洗液定量培养的意义 细菌性感染，浓度阈值104CFU/mL，低于阈值浓度时，定植可能性大; 高于阈值时，感染可能性大。 真菌性感染，目前没有BAL的诊断性阈值。 丝状真菌也没有阈值。
22、但丝状真菌在呼吸道分泌物中的价值远大于酵母菌属。该类菌在 EORTC /MSG 指南中有“临床诊断( probable diagnosis)”价值411. A Guide to Utilization of the Microbiology Laboratory for Diagnosis of Infectious Diseases: 2013 Recommendations by the Infectious Diseases Society of America (IDSA) and the American Society for Microbiology (ASM), 2013:57
23、(15 August)2. EORTC /MSG 42中华结核和呼吸杂志,2011,34(9)43哮喘患者：结晶和库什曼螺旋体44FilmArray Respiratory Panel第一个用单个标本同时检测病毒和细菌性呼吸道感染的测试2min上机时间，1h周转时间300l样本（鼻咽拭子即可）http:/www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm304177.htmhttp:/ 留取痰培养后，能否先肉眼评估一下标本质量 送检痰培养的目的是什么？微生物检验报告您参考吗？何时参考？ 少送痰！多采血！ 我们尽全力帮您找破案证据（病原菌
24、），前提是您提供一个好的案发现场（合格标本） 当您面对感染病人时，微生物室与您零距离！ 不要忘了病毒 不要用了抗生素之后，才想起送培养464748药敏报告共识概要 药敏试验的意义和基本原则 具体的专业要求 特殊耐药性和耐药表型的审核要点 报告形式49药敏试验的基本原则 药敏试验的前提条件 实验室的人员能力和客观条件 检测环节的规范标准，结果可信 具有解释结果的能力，能提供临床会诊 分离株应有临床意义v检测结果应准确 遵照CLSI文件 质控符合要求 定期参加室间比对 保留菌株50标本类型 脑脊髓液脑脊髓液 不报告：不能穿过血脑屏障的仅有口服剂型的抗菌药、一二代头孢菌素（除静脉用头孢呋辛）、头霉素
25、类、克林霉素、大环内酯类、四环素类、喹诺酮类 尿液尿液 仅在尿液标本报告的药：呋喃妥因 不报告：氯霉素呼吸道呼吸道 不报告：达托霉素51标本类型：粪便 X鹑鸡肠球菌鹑鸡肠球菌52药敏方法的选择和判定标准的规范化遵照CLSI要求选择采用近两年的折点每年评审本室的药敏折点范围采用新折点前，先进行临床验证 无法采用新折点，应补充相应耐药表型检测试验适用性：与菌种、药敏方法、检测条件、纸片含量、感染部位、药物有关。 CLSI M100未给折点的药，参考国内外专家共识、权威文献53常规测试和报告药物的选择 最重要的依据：CLSI文件（CLSI M100-S25M45） 菌种/药物测试报告组合 结合当地病
26、原谱、代表药、临床需求、实验室条件、充分听取临床科室意见 自动化药敏板：手工法补充无法满足的重要药物 连续性和灵活性：不同时期药物的可比性、满足临床需求 有选择地报告：同时报告多类敏感药、A/B/C/U类药物的意义 中国大陆最少必测药/菌种组合参考：CLSI M100-S25读书，使我们更加专业55一个真正的感染与微生物交流平台一个真正的感染与微生物交流平台关注订阅号关注订阅号 PIDMIC2016年11月18-20日第五届京港感染论坛，北京56 结 论 规范呼吸道标本送检：痰、BAL至关重要 提高血培养的送检意识！ 临床和实验室密切关注标本的质量、送检时间 实验室规范操作，包括评估标本质量、建立培养规范 快速、高通量分子技术渐入临床，但标本质量、性能评价、结果解读仍存在诸多问题 未来大家携手前行！
