1、 大多数微生物室：40-60%/日 标本是否合格？ 定植菌？致病菌？ 生长不同种类细菌如何报告？ 生长不同数量细菌取舍？ 前后两天培养结果 培养结果与临床诊断标本最多判断难报告难不符合草绿色链球菌、奈瑟菌属嗜血杆菌属、莫拉菌属常见引起细菌性社区感染典型肺炎病原菌：上呼吸道正常菌群 肺炎链球菌 流感嗜血杆菌 金黄色葡萄球 卡他莫拉菌肺炎支原体肺炎/鹦鹉热衣原体嗜肺军团菌柯克斯体（Q热）痰的来源？是否被上呼吸道污染？细胞内病原引起非典型肺炎：卫生部临床检验中心陕西省人民医院安徽省立医院卫生部北京医院北京大学人民医院中国医学科学院北京协和医院首都医科大学附属北京友谊医院解放军总医院浙江省温州医科大学
2、附属第二医院胡继红任健康马筱玲胡云建王辉徐英春苏建荣罗燕萍李向阳1 美国微生物学会:临床微生物学操作手册（第3版）.2019.（Clinical Microbiology Procedures Handbook）2 美国微生物学会:下呼吸道感染临床微生物学检验技术及操作系列丛书.20193 叶应妩, 等.全国临床检验操作规程(第3版). 20194 美国微生物学会:临床微生物学手册(第10版).20115 美国微生物学会:临床微生物学手册(第9版).20196 Nagendra, S., P.Bourbeau, S.Brecher, M.Dunne, M.LaRocco, and G.Doer
3、n.2019.Samplingvariability in the microbiological evaluation of expectorated sputa and endotrachealaspirates. J. Clin. Microbiol.39:2344-2347.7 Roson,B.,J.Carratala,R.verdaguer,J.Dorca,F.Manresa,and F.Gudiol.2000.Prospective study ofsputum Gram stain in the initial approach to community-acquired pne
4、umonia requiringhospitalization.Clin.Infec.Dis.31:869-874.8 Gleckman,R.,J.DeVita,D.Hibert,C.Pelletier,and R.Martin.1988.Sputum gram stain assessmentin community-acquired bacteremic pneumonia.J.Clin.Microbiol.26:846-849.应用范围：针对医疗机构微生物实验室； 检验项目：常规细菌培养检测下呼吸道感染病原菌； 操作流程：按分析前、分析中和分析后的顺序书写； 引言：是全篇的背景知识； 三
5、个“规范性附录”：结果报告的重要依据。 内容 定性培养痰/气管吸出物； 定量培养支气管纤维镜采集标本； 快速排除和鉴别重要致病菌的方法； QC培养基和试剂的质量控制； 细菌培养报告需结合革兰染色涂片结果；报告的临床意义和格式内容。（1）明确：下呼吸道标本 适合诊断的病原和检验项目 ；（ 2 ）规定：细菌培养项目需同时做革兰染色涂片（ 培养 + 药敏 + 涂片）；（ 3 ）规范：痰培养 / 气管吸出物的 定性培养 程序、气管镜采集标本的 定量培养 程序；（ 4 ）明确：报告 的临床意义和格式内容 。分析前分析中标本的采集、运送定性、定量培养、涂片流程标本初筛、合格判断病原菌筛查和鉴定、质量控制分
6、析后染色、培养结果报告（致病菌、非致病菌）、结果解释内容1.口咽部定植菌群变化对肺部感染的重要影响肺部感染的影响因素( 定植菌变化：健康人 G+ 免疫、基础病 /住院、用抗菌药物 G-b )2.肺部感染的常见机制主要机制：吸入定植菌；吸入气溶胶；血播性；附录 A: “下呼吸道感染的主要类型及主要病原菌”附录A汇总表3.痰涂片对下呼吸道感染病原菌诊断的重要作用痰培养：敏感性低 / 培养+ 涂片 ：提高特异性和敏感性4.支气管纤维镜标本定量培养的临床意义特异性 82% 91% ，诊断价值远高于痰标本；附录 B : “适合诊断的病原及检验项目”附录B汇总表5.下呼吸道感染细菌培养的局限性培养结果假阴
7、性、假阳性的原因1.2.3.人类口咽部定植：需氧菌、兼性厌氧菌和厌氧菌等微生物；菌群总数：1010 1012CFU/mL;健康人咽部定植菌特点：菌量最少；需氧的正常菌群组成：革兰阳性菌为主；影响因素：人体基础条件变化影响定植菌群的种类和数量；（微生态）举例：长期接触携带定植菌人群菌群会变化，如日托儿童的父母的肺炎链球菌、流感嗜血杆菌（具侵袭性）定植数量会增加；基础条件变化：使用免疫抑制剂、慢性肺病、广谱抗菌药物治疗或住院患者等人群中，革兰阴性杆菌的优势明显增加。常见因素：住院患者（48h后）：病毒感染抗菌药物损害侵入性仪器继发细菌感染杀死、抑制正常菌群，使G-b、耐药菌过度繁殖，如大肠埃希菌、
8、铜绿假单胞菌、不动杆菌、阴沟肠杆菌等；定植菌：肠道菌，MRSA，多重耐药菌机械通气（ICU）嗜麦芽窄食单胞菌鲍曼不动杆菌引起医院获得性感染1）肺部感染的最常见机制：肺泡内吸入了口咽部定植菌； 吸入性肺炎患者咽部菌群种类： 多侵袭性细菌或耐药细菌，如肺炎链球菌或革兰阴性杆菌。 清除机制：健康宿主吸入口腔定植菌后常无临床症状，细菌通常被粘液柱状纤维清除。 吸入能否引起肺部感染取决于： 吸入菌的致病性及数量；患者免疫系统；呼吸道功能等诸方面的因素。2）吸入气溶胶肺部感染占第二位： 主因：使用了不清洁的呼吸机。3）血液播散性肺炎占第三位：感染通常造成双肺下叶肺炎。由呼吸道感染引发的菌血症占12%，因此
9、对肺部感染的高热患者送检血培养，有利于发现肺部感染的病原菌。类型/免疫状态最常见病原菌少见病原菌1社区获得性 典型肺炎肺炎链球菌，流感嗜血杆菌，肺炎克雷伯菌金黄色葡萄球菌，卡他莫拉菌，脑膜炎奈瑟菌2社区获得性 非典型肺炎肺炎支原体，呼吸道病毒，流感病毒，肺炎衣原体，军团菌属沙眼衣原体，结核分枝杆菌，真菌等吸入性肺炎厌氧菌，金黄色葡萄球菌，需氧G-b医院获得性肺炎G-b (肠杆菌属/克雷伯菌属/不动杆菌属/假单胞菌属)，金黄色葡萄球菌，厌氧菌，社区获得性肺炎的典型菌军团菌，肺炎链球菌血液播散性肺炎金黄色葡萄球菌，链球菌需氧革兰阴性杆菌注1：肺炎链球菌和流感嗜血杆菌是引起儿童和老年人肺炎的最常见致
10、病菌；卡他莫拉菌、脑膜炎球菌多发于:基础病患者或病毒感染后的继发感染；金黄色葡萄球菌肺炎可引发肺脓肿；肺炎克雷伯菌大叶性肺炎常合并脓肿或肺粘连，死亡率较高。类型/免疫状态最常见病原菌少见病原菌免疫抑制宿主条件致病菌感染性肺炎社区获得性肺炎典型菌，奴卡菌属，念珠菌属，条件致病真菌，曲霉菌3环境暴露 引起的肺炎双相真菌、曲霉属、肺炎支原体、肺炎衣原体鼻疽假单胞菌，假鼻疽假单胞菌，鼠疫耶尔森菌，贝纳柯克斯体、图拉热弗朗西斯菌急性气管炎病毒，百日咳博德特菌，肺炎支原体和肺炎衣原体注2：通常可用分子生物学方法快速诊断，也可在感染后期用血清学方法检测肺炎支原体、肺炎衣原体和军团菌属抗体确诊。由生物恐怖病原
11、菌，如和鼠疫耶尔森菌引起的感染，血清学检测可作为辅助诊断方法。结核分枝杆菌可用罗氏培养基或快速结核杆菌液体培养仪培养，或分子诊断方法检测。注3：暴露在特殊气溶胶环境：与飞沫有关的结核分枝杆菌、与尘暴和鸟排泄物有关的双相真菌等。除引起社区非典型肺炎的病原不能常规培养外，其他常见肺部感染的病原菌均可常规培养方法分离；但培养方法敏感性低，无法判断分离菌的来源。 涂片革兰染色方法：评价痰标本是否合格；提高病原菌诊断的特异性；涂片还可发现培养不能生长的细菌。涂片方法提高了培养方法的特异性及敏感性。敏感性特异性当有大量炎症细胞，且：G+双球菌,诊断肺炎链球菌：57%97%G-小杆菌,诊断流感嗜血杆菌：82
12、%99%4.支气管纤维镜标本定量培养的临床意义库什曼螺旋纤维呈毛虫状蜷曲，革兰染色可见中轴蓝染，边缘淡红色。因慢性炎症时细支气管分泌的粘液浓缩而成。夏科雷登结晶可见于支气管，为菱形或针状六边形无色透明结晶，其两端尖长，大小不等，折光性强，由嗜酸粒细胞破裂后嗜酸性颗粒相互融合而成, 可用碘染色。可在稍放置的痰中找到嗜酸性粒细胞堆。在对烟曲菌有变态反应的哮喘患者或肺部感染寄生虫患者的痰液中常见。弹性纤维肺组织有破坏性病变如肺脓肿、肺癌等时，痰中可出现弹性纤维，证明痰液标本来自下呼吸道。纤毛柱状上皮细胞纤毛柱状上皮细胞主要分布在下呼吸道内表面，在柱状细胞的游离面附有能摆动的纤毛，是能分泌粘液的借助纤
13、毛有节律性的摆动，将含有灰尘、细菌的粘液排除至喉部。肺泡巨噬细胞来自血中单核细胞，脱落的型肺泡上皮或肺泡间隔细胞。细胞体积大，胞质丰富，核圆形、卵圆形或肾形，略偏位，染色质细致均匀，偶见核仁，涂片中有巨噬细胞证明痰液标本来自下呼吸道。3.1 标本采集3.1.1 咳痰3.1.2 气管吸出物注：仅当出现肺炎的临床表现（如发热或浸润）时采集气管吸出物标本，否则勿培养气管吸出物，因气管在插管 24h 后即有定植菌，培养结果可能与疾病不符。3.1.3 血培养注：当下呼吸道感染患者伴有高热症状时，送检血培养（具体参考血培养标本采集和送检要求）3.1.4 诱导痰（通常不用于细菌培养）3.1.5 气管镜标本3
14、.1.5.1 采集气管镜标本注意事项3.5.1.2 支气管肺泡灌洗液标本(BAL)3.5.1.3 保护毛刷(PSB)3.2 标本运送注 1 ：若送检标本超过 2h，将导致有临床意义的致病菌数量减少，非苛养的口咽部定植菌过度生长。为防止口咽部正常菌群的过度生长，可将标本放置 2 8 环境，但培养分离到肺炎链球菌等苛养菌的机会和数量会减少。注 2 ：若标本延迟送检超过 2h后未冷藏（超过 2h24h， 2 8 ），应在报告中说明因延误送检标本，可能对培养结果造成的影响。3.3筛选并拒收下呼吸道细菌培养标本拒收24h内重复采集的痰细菌培养标本唾液鼻冲洗液和分泌物、鼻孔拭子咽部标本未经保护套管收集的支
15、气管刷培养标本痰的厌氧菌培养标本注：除支气管穿刺吸出物、 PSB 、活检标本、胸水或其他未经污染以外的标本做厌氧菌培养均不合格。诱导痰注：诱导痰标本只适用于检测卡氏肺孢子菌和结核分枝杆菌，对其他病原菌检出效果差。1+（偶见）2+ （ 少 量3+（中量）4+（大量）细胞计数（低倍镜）少于1个/LPF1个9个/LPF10个25个/LPF大于25个/LPF细胞计数（油镜）少于1个/OIF1个5个/OIF6个30个/OIF大于30个/OIF4.1 痰及气管吸出物标本处理4.1.1 标本处理要求接种标本及涂片操作必须在级生物安全柜中进行；应尽快处理所有标本，特别是来自急诊、新入院患者和有创方法采集的标本
16、（如：BAL和肺活检标本），以保证致病菌的活性，避免造成重复采集标本；使用全自动接种前处理系统的实验室按厂家说明书处理标本，洗痰、液化后自动接种和涂片革兰染色。4.1.2 接种标本4.1.3 培养4.1.4 标本涂片及革兰染色注 1 ：革兰染色脱色时间因选用不同的脱色剂而异。 1 ） 95% 乙醇脱色时间为 30s ； 2 ） 丙酮- 乙醇（体积比为 3:7, 棕色瓶室温保存，有效期 1 年）脱色时间 1s 5s ，脱色效果一致性好；3 ） 丙酮 （试剂纯）脱色时间最短，当标本中含大量宿主细胞时脱色效果好。注 2 ：使用革兰染色仪染色的实验室按照厂家操作说明书进行，注意条件优化，使涂片染色结果
17、达到满意效果。4.1.5显微镜观察革兰染色结果4.2 气管镜标本处理4.2.14.2.24.2.34.2.44.2.5支气管肺泡灌洗液定量培养保护毛刷定量培养接种其他培养基并培养革兰染色标本处理剩余BAL标本可用于其他病原检测（标本珍贵）对剩余BAL标本离心后，可根据需要进行病毒、分枝杆菌、军团菌和真菌培养；或做病毒、卡氏肺孢子菌、抗酸染色和真菌涂片染色 .4.3 连续培养并观察慢生长菌适用于检测条件致病菌的所有项目只用于诊断细菌性肺炎，定量培养和革兰染色4.4 分离并鉴定下呼吸道重要致病菌（参见附录C）“常见可疑菌落形态及经典快速鉴定方法(16种)”4.4.1链球菌属4.4.2苛养革兰阴性杆
18、菌（在麦康凯平板上难生长）4.4.3革兰阴性双球菌4.4.4革兰阴性杆菌（在麦康凯平板上生长良好）4.4.5葡萄球菌属4.4.6肠球菌属4.4.7革兰阳性杆菌4.4.8鉴定丝状真菌4.4.9涂片时可见但培养不生长的细菌4.5质量控制4.5.1革兰染色4.5.2抗酸染色4.5.3培养基4.5.4试剂4.5.4.1每批号、每周需做质控的试剂4.5.4.2每批号、每次试验需做质控的试剂5.1 革兰染色报告5.1.1痰标本报告原则（见表1）“痰 / 气管吸出物标本涂片革兰染色结果解释”5.1.2 BAL细胞离心涂片报告5.2 报告有临床意义的微生物5.2.1应报告的病原菌 （致病菌）5.2.2培养和涂
19、片相符合时报告的病原菌（与感染相关的定植菌）5.2.3有临床意义的数量5.2.4报告有临床意义数量的非优势菌5.2.5报告有临床意义数量的优势菌5.3 对非致病菌的报告5.3.1报告“肠杆菌科细菌”5.3.2报告“非发酵细菌”5.3.3只生长肠球菌和凝固酶阴性葡萄球菌5.3.4报告“分离到口咽部正常菌群”5.4 平板上无细菌生长5.5 结果解释不接受培养可接受培养提示感染特征性提示与感染相关的病原菌注意！用革兰染色来评估呼吸道标本是否合格10鳞状上皮细胞/LPF标本来自上呼吸道弹性纤维，中性粒细胞多，鳞状上皮细胞少，有代表性的好标本你看见多少种形态？几种细菌的混合形态，缺乏鳞状上皮细胞=混合厌
20、氧菌感染。如果是呼吸道标本可能是吸入性肺炎。报告临床医生“提示吸入性肺炎”细胞内细菌在使用抗生素之后链球菌常形态变得特别奇怪呼吸道标本中未被染色的，有折射的杆菌=抗酸杆菌5.2.1 应报告的病原菌 化脓链球菌 B群-溶血链球菌（儿童） 博德特菌属，特别是支气管博德特菌 奴卡菌属 新生隐球菌 弗朗西斯土拉菌（高致病菌） 鼠疫耶尔森菌（高致病菌） 炭疽芽孢杆菌（高致病菌） 丝状真菌（排除腐生菌污染）处理培养物应参考涂片的结果，应根据革兰染色所见炎症细胞和细菌的形态与培养物进行对照，当培养与涂片结果不相符时应重新读片。当培养生长的细菌在涂片中亦和炎症细胞相关时，报告以下两种病原菌：肺炎链球菌，并报告
21、药敏结果流感嗜血杆菌，常规报告-内酰胺酶下呼吸道标本有意义的细菌浓度值（CFU/ml）标本自然咳痰诱导痰气管内吸取物支气管肺泡灌洗液保护性毛刷支气管灌洗液有意义的浓度 CFU/ml107不确定106104103不做培养a. 定性培养生长的病原菌数量达到以下情况时，判断为有临床意义：在平板第2区划线仍大量生长，或培养物生长量超过1/4平板；培养少量生长且革兰染色涂片可见此形态细菌与炎症细胞相关联的病原菌；在平板划线第1区生长且纯度超过90%以上时，同时革兰染色涂片可见此形态细菌与炎症细胞相关的病原菌。b. 定量培养有临床意义的数量： BAL：菌落计数 104 CFU/mL PSB：菌落计数 10
22、3 CFU/mL 取最高稀释度平板，分别对不同菌落形态的细菌计数，乘上稀释倍数即为菌落数。当培养达到5.2.3所示有临床意义的数量时，即使非优势菌也应报告的病原菌：a.卡他莫拉菌、脑膜炎奈瑟菌，常规报告-内酰胺酶；b.只对住院患者报告的病原菌有： 铜绿假单胞菌，并报告药敏结果 嗜麦芽窄食单胞菌，并报告药敏结果 不动杆菌属，特别是鲍曼不动杆菌，并报告药敏结果 洋葱伯克霍德菌，并报告药敏结果生长菌达有临床意义数量的优势菌，特别当涂片提示分离菌与多形核白细胞相关时报告的病原菌：a. 金黄色葡萄球菌，并报告药敏结果b. B群-溶血链球菌（成人）、C群或G群-溶血链球菌c. 单一形态革兰阴性杆菌（特别是
23、肺炎克雷伯菌），并报告药敏结果d. 苛养的革兰阴性杆菌，通常报告-内酰胺酶e. 脲酶阳性的棒状杆菌或来自ICU的患者f. 分离自免疫抑制患者的马红球菌5.3.1报告“肠杆菌科细菌”在麦康凯平板上生长 1种 G-b，经氧化酶(-)、乳糖产酸等试验初步鉴定为肠杆菌科细菌，报告：经鉴定生长“肠杆菌科细菌”。5.3.2报告“非发酵细菌”在麦康凯平板上生长 1种 G-b，经氧化酶(+)、克氏双糖铁上不发酵葡萄糖等试验初步鉴定，报告：经鉴定生长“非发酵细菌”。若只生长肠球菌属和/或凝固酶阴性葡萄球菌（有或无酵母样真菌），报告“革兰阳性球菌混合生长”;若培养物纯度达90%以上，则做初步鉴定到属水平并分别列出
24、。若未分离到致病菌，对分离的：草绿色链球菌和/或非致病奈瑟菌类白喉菌凝固酶阴性葡萄球菌罗斯菌属（Rothia spp.)F群链球菌厌氧菌嗜血杆菌属（非流感嗜血杆菌）艾肯菌属放线杆菌属嗜二氧化碳菌莫拉菌属肠球菌属酵母样真菌未达到有意义数量的金黄色葡萄球菌（如果医院感染控制要求可做药敏试验）革兰阴性杆菌及脑膜炎奈瑟菌，均报告：“分离到口咽部正常菌群”（可列出相应菌属）如任何平板上无细菌生长，报告“无细菌生长”。出现此种情况可能是使用抗菌药物抑制了正常菌群等原因。尽管培养到的肺炎链球菌或流感嗜血杆菌可能是定植菌，因而导致报告了假阳性结果，但通常仍在临床报告中提示分离菌是可疑致病菌。培养生长的革兰阴性杆菌或金黄色葡萄球菌是优势菌，且涂片也提示这些形态的细菌与感染相关时才报告。培养阴性时也不能排除患者的下呼吸道感染，因培养的阳性率低，经常分离不到致病菌。多数医生认为对通气相关肺炎和院内感染肺炎患者做气管吸出物或痰培养对临床诊断有帮助。通常治疗社区获得性肺炎使用青霉素类抗菌药物，如阿莫西林或阿莫西林/棒酸、一种氟喹诺酮类、一种大环内酯类抗菌药物，或联合抗菌药物治疗。行业标准力求科学性、原则性、易读性、可操作性；解决共性问题；不“完美”，改进和修订；结合各自的工作流程使用，符合相关原则和要素；标准的选择和制定也更规范。谢 谢！
