1、 第二章第二章 生物制品的制备生物制品的制备 （Preparation） 第一节第一节 一般生物制品的制备方法一般生物制品的制备方法 (Preparation of general bio-preparate )(Preparation of general bio-preparate )一、生物制品原料的选择、预处理与保存方法一、生物制品原料的选择、预处理与保存方法 （Selection、pretreatment and preservation of raw material of biopreparate） （1 1）原料选择）原料选择 原料的选择原则原料的选择原则： 有效成分含量高，新
2、鲜；有效成分含量高，新鲜； 原料来源丰富，产地较近；原料来源丰富，产地较近； 原料中杂质含量少；原料中杂质含量少； 原料成本低等。原料成本低等。原料的选择注意事项：原料的选择注意事项： 植物原料生长的季节性；植物原料生长的季节性； 微生物原料的对数期；微生物原料的对数期； 动物原料的年龄与性别动物原料的年龄与性别。（2 2）原料的预处理与保存：）原料的预处理与保存： 动物原料动物原料：采集后要立即处理，去除结采集后要立即处理，去除结缔组织、脂肪组织等，并迅速冷冻贮存缔组织、脂肪组织等，并迅速冷冻贮存。植物原料植物原料：要择时采集并就地去除不用要择时采集并就地去除不用的部分，保鲜处理；的部分，保
3、鲜处理；微生物原料微生物原料：要及时将菌细胞与培养液要及时将菌细胞与培养液分开，进行保鲜处理分开，进行保鲜处理。 原料的保存方法主要有原料的保存方法主要有：冷冻法冷冻法。该方法适用于所有生物原料。常用该方法适用于所有生物原料。常用- -4040速速冻冻。有机溶剂脱水法有机溶剂脱水法。常用的有机溶剂是丙酮。常用的有机溶剂是丙酮。该法适用于原料少而价值高、有机溶剂对活性物该法适用于原料少而价值高、有机溶剂对活性物质没有破坏作用的原料，如脑垂体等质没有破坏作用的原料，如脑垂体等。防腐剂保鲜防腐剂保鲜。常用乙醇、苯酚等。该法适用常用乙醇、苯酚等。该法适用于液体原料，如发酵液、提取液等。于液体原料，如发
4、酵液、提取液等。 二、生物制品的提取（二、生物制品的提取（extraction） (1)(1)生物组织与细胞的破碎生物组织与细胞的破碎（obtrude of tissue and cell）：生物制品大部分存在于生物组织或细胞中，要）：生物制品大部分存在于生物组织或细胞中，要提高提取率，破碎过程是非常重要的。常用的破碎方提高提取率，破碎过程是非常重要的。常用的破碎方法：法： 磨切法磨切法，该法属于机械破碎方法，设备有组织捣碎该法属于机械破碎方法，设备有组织捣碎机、胶体磨、匀浆器、匀质机、球磨机、乳钵等机、胶体磨、匀浆器、匀质机、球磨机、乳钵等。压力法压力法，有加压、减压、渗透压三种有加压、减压
5、、渗透压三种 反复冻融法反复冻融法，设备简便，活性保设备简便，活性保持好，但用时较长持好，但用时较长。超声波振荡破碎法超声波振荡破碎法，该方法破碎该方法破碎效果较好，但由于局部发热，对效果较好，但由于局部发热，对活性有损失。活性有损失。自溶法或酶解法自溶法或酶解法，用得较少用得较少。（2 2）提取（）提取（extraction） 生物组织与细胞破碎后要立即进行提取。提取生物组织与细胞破碎后要立即进行提取。提取时，首先要根据活性物质的性质，时，首先要根据活性物质的性质， 选择提取试剂选择提取试剂。提取试剂主要有：水、缓冲提取试剂主要有：水、缓冲溶液、盐溶液、乙醇、其他有机溶剂（如氯仿、丙溶液、盐
6、溶液、乙醇、其他有机溶剂（如氯仿、丙酮等）。酮等）。 考虑提取溶剂的考虑提取溶剂的用量用量及提取及提取次数次数、提取、提取时间时间。 注意提取的注意提取的温度温度、pHpH、变性剂变性剂等因素。等因素。 三、蛋白质类制品的分离纯化方法三、蛋白质类制品的分离纯化方法（Isolation and depuration of protein production） 包括蛋白质、多肽和酶类等药物。分离纯化方法有：包括蛋白质、多肽和酶类等药物。分离纯化方法有： (1)(1)沉淀法沉淀法（precipitation）：）：蛋白质、酶的初步纯化往往用沉蛋白质、酶的初步纯化往往用沉淀法。原理是使蛋白质胶体颗粒
7、破坏，从而沉淀蛋白质。常用淀法。原理是使蛋白质胶体颗粒破坏，从而沉淀蛋白质。常用的有盐析法（的有盐析法（salting out）、有机溶剂沉淀法（）、有机溶剂沉淀法（organic solvent precipitation）、等电点沉淀法（）、等电点沉淀法（isoelectric precipitation）、与）、与靶物质结合沉淀法（如抗体靶物质结合沉淀法（如抗体抗原）（抗原）（target banding precipitation）等。）等。 蛋白质蛋白质中性盐中和电荷中和电荷水化层减弱水化层减弱溶解度下溶解度下降，沉淀降，沉淀盐析法原理盐析法原理等电点沉淀法等电点沉淀法在等电点时，蛋
8、白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零(即正负电荷相等)，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。(2) (2) 按分子大小分离的方法按分子大小分离的方法：有有超滤法超滤法（ultrafiltration）和）和透折法透折法（d dialysis）（即）（即膜分离方法）膜分离方法）、凝胶层析法、凝胶层析法（gel chromatography）、）、超速离心法超速离心法（ultra centrifugation转速大于转速大于20 000r/min）等。等。其中膜分离
9、法可用于生物大分子物质的浓其中膜分离法可用于生物大分子物质的浓缩、分级和脱盐。缩、分级和脱盐。 凝胶层析又称分子筛层析，主要根据混合物中分子的大小和形凝胶层析又称分子筛层析，主要根据混合物中分子的大小和形状不同状不同 ，在通过凝胶时，分子的扩散速率各异而达到分离的，在通过凝胶时，分子的扩散速率各异而达到分离的目的。凝胶颗粒具有多孔性网状结构，小分子易进入凝胶网孔，目的。凝胶颗粒具有多孔性网状结构，小分子易进入凝胶网孔，流程长而移动速度慢，而大分子物质不能进入凝胶网孔，沿凝流程长而移动速度慢，而大分子物质不能进入凝胶网孔，沿凝胶颗粒间隙流动，流程短移动快。这种现象称为分子筛效应。胶颗粒间隙流动，
10、流程短移动快。这种现象称为分子筛效应。(3)(3)按分子所带电荷进行分离的方法按分子所带电荷进行分离的方法氨基酸、多肽、蛋白质、酶均为两性电解质。它氨基酸、多肽、蛋白质、酶均为两性电解质。它们具有们具有等电点等电点，在离开等电点的在离开等电点的pHpH时便会带正或时便会带正或负电荷。例如某蛋白质等电点为负电荷。例如某蛋白质等电点为7.07.0，当溶液，当溶液pHpH为为4.04.0时，分子则带有正电荷。由于具有该性质，利时，分子则带有正电荷。由于具有该性质，利用带电性质进行分离是极其有效的方法。利用电用带电性质进行分离是极其有效的方法。利用电学性质进行分离的方法有学性质进行分离的方法有离子交换
11、柱层析法离子交换柱层析法（ion-exchange chromatography）、）、电泳法电泳法（electrophoresis）、）、等电聚焦法等电聚焦法（isoelectric focusing）等。）等。（4 4）亲和层析法（）亲和层析法（affinity chromatography）大部分生物活性物质都有其作用的靶物质，如酶与大部分生物活性物质都有其作用的靶物质，如酶与底物（或抑制剂）、抗原与抗体、激素与受体等，底物（或抑制剂）、抗原与抗体、激素与受体等，它们之间有特异的亲合作用，利用该性质设计的特它们之间有特异的亲合作用，利用该性质设计的特异层析分离技术称为亲和层析。异层析分离
12、技术称为亲和层析。亲和层析亲和层析分离专一性强，操作简便，是当前应用很分离专一性强，操作简便，是当前应用很广泛的分离方法之一。广泛的分离方法之一。亲和色谱（亲和色谱（affinity chromatography） 1）基本概念（）基本概念（basic concept）亲和层析亲和层析是利用待分离物质与其特异性配基之间是利用待分离物质与其特异性配基之间特特异性的亲和力异性的亲和力进行分离的一类特殊的层析技术。进行分离的一类特殊的层析技术。配基（配基（ligand） ：被固定在基质上的分子称为配基，被固定在基质上的分子称为配基，配基和基质是以共价键结合的。配基和基质是以共价键结合的。基质（基质（
13、matrix）：）：亦称为载体（亦称为载体（vector），是构成固），是构成固定相的骨架定相的骨架 。2）亲和层析有如下特点）亲和层析有如下特点（Characteristics of Affinity Chromatography） 纯化纯化过程简单过程简单、迅速；、迅速； 分离分离效率效率高；高； 产物产物纯度纯度高；高； 必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件。的层析条件。 因此应用范围受到一定的限制。因此应用范围受到一定的限制。3）亲和层析的基本原理）亲和层析的基本原理（Mechanism of Affinity Chroma
14、tography）亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为载体相连作为固定相吸附剂固定相吸附剂。当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，其它没有亲和力的无关组份就随流固定相吸附结合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出。动相流出。然后改变流动相成份，将结合的亲和物洗脱下来。然后改变流动相成份，将结合的亲和物洗脱下来。（见（见Fig1、Fig2）。（ Fig1. Mechanism of
15、AC）（Fig2. Mechanism of AC）抗原专一抗体基质具有特异性亲和作用的生物分子具有特异性亲和作用的生物分子4）配基的种类）配基的种类 (sorts of ligand)抗原与抗体。抗原与抗体。DNA与互补与互补DNA或或RNA（cDNA、mRNA)。酶与其底物。酶与其底物。激素与其受体。激素与其受体。维生素与结合蛋白。维生素与结合蛋白。糖蛋白与植物凝集素。糖蛋白与植物凝集素。5）亲和层析载体的性质与选择）亲和层析载体的性质与选择亲和层析载体的选择亲和层析载体的选择（selection of vectors）多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分多孔的立体网状结构，能使被亲和
16、吸附的大分子自由通过。子自由通过。颗粒均匀，具有良好的流速。颗粒均匀，具有良好的流速。具有惰性，尽量减少非专一性吸附。具有惰性，尽量减少非专一性吸附。在温和的条件下在温和的条件下 能与配基共价偶联。能与配基共价偶联。6）常用的亲和层析载体）常用的亲和层析载体 （Vectors of Affinity Chromatography）纤维素（纤维素（cellulose）葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（Sephadex）琼脂糖凝胶（琼脂糖凝胶（Sepharose）聚丙烯酰胺凝胶（聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel）多孔玻璃珠（多孔玻璃珠（Bio-Glass）其它新型载体（其它新型载体（Other gels）7）
17、亲和层析配基的选择亲和层析配基的选择（Selection of ligand）1.纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力。纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力。2.但亲和力太高也是有害的，因为在解离配但亲和力太高也是有害的，因为在解离配 基复合物时所基复合物时所 需的条件就要强烈，这样可能需的条件就要强烈，这样可能使生物分子变性。使生物分子变性。3.配基必须具有适当的化学基团，可用于和配基必须具有适当的化学基团，可用于和载体相连，同时又不影响配基与生物分子之载体相连，同时又不影响配基与生物分子之间的亲和力。间的亲和力。8）载体、配基、目的物的连接）载体、配基、目的物的连接（Conjunction
18、 of vector、ligand and target material）载体（载体（Vectors or Matrix） +配基（配基（Ligand） +目的物（目的物（target material）Fig AC relies upon a reversible highly specific binding reaction.Fig Spacer arm principle A spacer is sometimes used to ensure full accessibility of the affinity ligand.Fig Principle of preparing A
19、C media9 9）亲和层析的基本操作方法：）亲和层析的基本操作方法：n平衡（平衡（ Equilibration） 用平衡用平衡Buffer冲洗柱体，至基线平稳冲洗柱体，至基线平稳.样品上柱和冲洗样品上柱和冲洗（Sample application and wash） 样品中的目的物与层析介质选择样品中的目的物与层析介质选择性的吸附，杂质不被吸附。用上样性的吸附，杂质不被吸附。用上样Buffer冲洗柱体，杂质被冲洗下来。冲洗柱体，杂质被冲洗下来。形成杂质峰（见下图）。形成杂质峰（见下图）。洗脱（洗脱（Elution） 选择适当的条件，将吸附在亲和介质上的目选择适当的条件，将吸附在亲和介质上的
20、目的物解吸下来（见下图）。的物解吸下来（见下图）。四、核酸类制品的分离纯化方法四、核酸类制品的分离纯化方法（Isolation and depuration of nucleic acid ）核酸类药物生产方法主要有核酸类药物生产方法主要有提取法和发酵法提取法和发酵法。提取法提取法生产生产DNADNA和和RNARNA，先提取核酸和蛋白质，先提取核酸和蛋白质复合物，再解离核酸与蛋白质，然后分离复合物，再解离核酸与蛋白质，然后分离RNARNA与与DNADNA。发酵法发酵法主要用于生产单核苷酸主要用于生产单核苷酸。高RNA含量酵母摇瓶发酵种子培养物连续发酵发酵液过滤酵母菌体NaOH20搅拌破壁氨水处
21、理离心上清液沉淀蛋白三氯乙酸酸调pH核酸粗品乙醇洗涤干燥RNA干品五、糖类制品的分离纯化方法五、糖类制品的分离纯化方法（ Isolation and depuration of sugar ） 由于各种糖类制品的性质和原料来由于各种糖类制品的性质和原料来源不同，没有统一规范的提取和纯化工源不同，没有统一规范的提取和纯化工艺。这里只介绍艺。这里只介绍多糖和粘多糖多糖和粘多糖的一般分的一般分离纯化方法。离纯化方法。 （1）提取方法）提取方法 （extraction） 非降解法非降解法适用于从含一种粘多糖的动物组织中适用于从含一种粘多糖的动物组织中提取粘多糖，提取采用的溶剂是水或盐溶液提取粘多糖，提
22、取采用的溶剂是水或盐溶液。 降解法降解法（degradation）适用于从组织中提取结）适用于从组织中提取结合比较牢固的粘多糖（合比较牢固的粘多糖（mucoitin）。如从软骨中分）。如从软骨中分离提取硫酸软骨素（离提取硫酸软骨素（chondroitin sulfate），就是），就是用碱处理进行降解。又如用酶处理法可提取与蛋用碱处理进行降解。又如用酶处理法可提取与蛋白质结合的多糖白质结合的多糖。 （2）分离方法）分离方法 （isolation） 常用的分离方法是沉淀法和离子交换层析法。常用的分离方法是沉淀法和离子交换层析法。 乙醇沉淀法乙醇沉淀法（alcohol precipitation）
23、：是从提）：是从提取液中沉淀多糖的最简易方法，也适用于分级取液中沉淀多糖的最简易方法，也适用于分级分离分离。4-54-5倍体积的乙醇可以使任何结缔组织中倍体积的乙醇可以使任何结缔组织中的粘多糖完全沉淀。用季铵化合物也可沉淀粘的粘多糖完全沉淀。用季铵化合物也可沉淀粘多糖。粘多糖的聚阴离子能与某些阳离子表面多糖。粘多糖的聚阴离子能与某些阳离子表面活性剂结合成不溶于水的盐，如十六烷基三甲活性剂结合成不溶于水的盐，如十六烷基三甲基铵（基铵（CTACTA）等）等。 离子交换层析法离子交换层析法（ion exchange chromatagraphy)：粘多糖的聚阴离子能：粘多糖的聚阴离子能够很好地被阴离
24、子交换剂吸附和分离，如够很好地被阴离子交换剂吸附和分离，如Dowex I-XDowex I-X2 2（商品名）离子交换树脂、（商品名）离子交换树脂、DEAE-DEAE-离子交换纤维素（二乙胺乙基）等。离子交换纤维素（二乙胺乙基）等。洗脱可用洗脱可用NaC1NaC1溶液进行梯度洗脱。溶液进行梯度洗脱。六、脂类制品的分离纯化方法六、脂类制品的分离纯化方法 （isolation and depuration of lipoid）（1 1）提取方法（）提取方法（extraction extraction ） 脂类自然状态下是以结合形式存在的。非极脂类自然状态下是以结合形式存在的。非极性脂是与其他脂质分
25、子或蛋白质分子的疏水区相性脂是与其他脂质分子或蛋白质分子的疏水区相结合的。结合的。提取脂质就是要选择适当的溶剂来破坏提取脂质就是要选择适当的溶剂来破坏这种结合键，将脂质溶解出来这种结合键，将脂质溶解出来。常用的溶剂有组常用的溶剂有组合溶剂，醇是其中的主要成分，此外还有氯仿、合溶剂，醇是其中的主要成分，此外还有氯仿、甲醇、水等。甲醇、水等。 （2）纯化方法（）纯化方法（depuration） 沉淀法沉淀法(precipitation) ：由于不同脂质在丙：由于不同脂质在丙酮中溶解度不同，故常用它进行沉淀。酮中溶解度不同，故常用它进行沉淀。吸附层析法吸附层析法(adsorption chromat
26、ography)：常用吸附剂有硅胶、氧化铝等。它是通过极常用吸附剂有硅胶、氧化铝等。它是通过极性和离子力等把各种化合物结合到固体吸附性和离子力等把各种化合物结合到固体吸附剂上。洗脱一般是采用极性逐渐增大的洗脱剂上。洗脱一般是采用极性逐渐增大的洗脱液来进行，非极性的先流出，极性的后流出液来进行，非极性的先流出，极性的后流出。 离 子 交 换 层 析 法离 子 交 换 层 析 法 （ I o n e x c h a n g e chromatography） : : 脂质分子的存在有脂质分子的存在有非解离、两性离子和酸式解离三种状态。非解离、两性离子和酸式解离三种状态。根据它们在一定根据它们在一定
27、pHpH条件下的解离情况，选条件下的解离情况，选择适当的择适当的离子交换剂离子交换剂可可将它们提纯。如将它们提纯。如TEAETEAE纤维素对分离脂肪酸和胆汁酸等特纤维素对分离脂肪酸和胆汁酸等特别有效。别有效。 七、氨基酸类制品的分离纯化方法七、氨基酸类制品的分离纯化方法 （isolation and depuration of Aa）（1）氨基酸的生产方法）氨基酸的生产方法（production of Aa）蛋白质水解法蛋白质水解法（protein hydrolysis）：）：水解水解法有酸水解（法有酸水解（acid hydrolysis）、碱水解（）、碱水解（base hydrolysis）
28、和酶水解（）和酶水解（enzyme hydrolysis）三种。）三种。 用用盐酸水解盐酸水解为常用方法，其优点是水解为常用方法，其优点是水解迅速、完全，产物全部是迅速、完全，产物全部是L L型氨基酸，型氨基酸，缺点是色氨酸全部被破坏，丝氨酸等部缺点是色氨酸全部被破坏，丝氨酸等部分被破坏。分被破坏。碱水解法碱水解法易产生消旋作用，较少应用易产生消旋作用，较少应用。酶水解法酶水解法水解不够完全。水解不够完全。 发酵法（发酵法（fermentation）：菌株经过发酵后，从培养液中提纯氨基酸。菌株经过发酵后，从培养液中提纯氨基酸。 化学合成与酶促合成法化学合成与酶促合成法化学合成法化学合成法一般得
29、到的是一般得到的是DL型氨基酸，尚型氨基酸，尚需要对异构体拆分；需要对异构体拆分；酶促合成法酶促合成法也是酶工程也是酶工程在医药工业上的应用，优点是技术工艺简单在医药工业上的应用，优点是技术工艺简单，转化率高，副产物少和易提纯等。，转化率高，副产物少和易提纯等。（2）氨基酸的分离方法（）氨基酸的分离方法（isolation of Aa） 有有沉淀法（沉淀法（percipitation）、吸附法（）、吸附法（adsorption）和离子交换法（和离子交换法（ion-exchange ) 。沉淀法沉淀法(percipitation)：根据形成沉淀的原理不同：根据形成沉淀的原理不同分为两种：分为两种
30、：是依据不同氨基酸在水中或其他溶是依据不同氨基酸在水中或其他溶剂中的溶解度差异进行沉淀分离。剂中的溶解度差异进行沉淀分离。是用特殊试是用特殊试剂沉淀某种氨基酸，如用邻二甲苯剂沉淀某种氨基酸，如用邻二甲苯-4-磺酸与亮氨磺酸与亮氨酸形成不溶性盐沉淀，再用氨水分解，使亮氨酸酸形成不溶性盐沉淀，再用氨水分解，使亮氨酸游离出来游离出来。 吸附法吸附法( (adsorption) )：这是利用吸附剂根据：这是利用吸附剂根据氨基酸吸附力的差异氨基酸吸附力的差异进行氨基酸分离的方法进行氨基酸分离的方法。苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的分离就是利。苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的分离就是利用活性炭对其吸附的原理用活性炭对
31、其吸附的原理。 离子交换法离子交换法（ion-exchange ) )：氨基酸是：氨基酸是两性电解质，在一定两性电解质，在一定pHpH条件下，条件下，不同氨基酸不同氨基酸带电性质及解离状态是不相同的带电性质及解离状态是不相同的，因此在离因此在离子交换剂上被吸附的强度不同。常用的离子子交换剂上被吸附的强度不同。常用的离子交换剂为强酸型阳离子交换树脂，洗脱主要交换剂为强酸型阳离子交换树脂，洗脱主要用用pHpH梯度洗脱。梯度洗脱。 第二节第二节 人体来源生物制品制备实例人体来源生物制品制备实例 （Example of bio-preparation application to human）一、人血
32、浆白蛋白制剂的制备（一、人血浆白蛋白制剂的制备（preparation of human blood plasma albumin）（1）结构和性质）结构和性质 （structure and character）人血是一种红色混浊的、具有一定腥味与粘滞性的液体。用人血是一种红色混浊的、具有一定腥味与粘滞性的液体。用适当的抗凝剂除去其中的有形成分（如红血球）而得到淡黄色、适当的抗凝剂除去其中的有形成分（如红血球）而得到淡黄色、半透明的液体叫半透明的液体叫血浆血浆。血浆中除含有大量的水分以外，还含有血浆血浆中除含有大量的水分以外，还含有血浆蛋白等溶质。蛋白等溶质。白蛋白（白蛋白（albumin）又
33、称清蛋白，白蛋白是）又称清蛋白，白蛋白是血浆蛋白中含量最高（血浆蛋白中含量最高（3.84.8%）、分子量）、分子量最小、分子数最多的一类蛋白质。最小、分子数最多的一类蛋白质。白蛋白对治疗因失血、创伤、烧伤等引起的白蛋白对治疗因失血、创伤、烧伤等引起的休克，脑水肿和大脑损伤性所致的脑压增高，休克，脑水肿和大脑损伤性所致的脑压增高，防止低蛋白血症，肝硬化或者由肾病引起的水防止低蛋白血症，肝硬化或者由肾病引起的水肿与腹水等严重疾病具有良好疗效。肿与腹水等严重疾病具有良好疗效。白蛋白为单链分子，由白蛋白为单链分子，由584个氨基酸残基个氨基酸残基组成，组成，N端为天门冬氨酸，端为天门冬氨酸，C端为亮氨
34、酸，端为亮氨酸，分子量为分子量为6.6104，在离子强度为，在离子强度为0.15时，时，pI为为4.7，易溶于水，在，易溶于水，在60%硫酸铵饱和度硫酸铵饱和度以上沉淀。对酸较稳定，受热变性。以上沉淀。对酸较稳定，受热变性。从人体中分离的白蛋白有两种：从人体中分离的白蛋白有两种：一种是一种是从健康人血浆中分离制得的人血清白蛋白，从健康人血浆中分离制得的人血清白蛋白，另一种是从健康产妇胎盘中分离制得的胎另一种是从健康产妇胎盘中分离制得的胎盘白蛋白。盘白蛋白。 血（无抗凝剂）血（无抗凝剂）自然凝固自然凝固分离出血清分离出血清（无纤维蛋白酶原、凝血因子等）（无纤维蛋白酶原、凝血因子等）血血+混合抗凝
35、剂混合抗凝剂 草酸铵草酸铵草酸钾草酸钾离离 心心上清血浆上清血浆总蛋白：总蛋白：6.2-7.9%白蛋白：白蛋白：3.8-4.8%水：水：90-92%（现常用肝素、柠檬酸钠）（现常用肝素、柠檬酸钠）（2 2）工艺路线）工艺路线 利凡诺利凡诺,NaHCO3pH8.6,离心分离离心分离络合物蒸馏水，蒸馏水，NaCl，HCl弱酸性，弱酸性，40，离心，离心离心液浓浓 缩缩超超 滤滤浓缩液灭活病毒灭活病毒 65，1h；60，10h热处理液除菌除菌过滤白蛋白液干燥冷冻干燥白蛋白去杂蛋白人血浆（人血浆（% %）男性尿男性尿 沉淀沉淀1010下，下，pH8.5pH8.5上清尿液上清尿液酸酸 化化 pH5.0-
36、5.5pH5.0-5.5酸化尿酸化尿吸吸 附附硅藻土，硅藻土，55硅藻土吸附物硅藻土吸附物洗涤洗涤5，水，水硅藻土硅藻土柱柱洗脱洗脱0.02%氨水，氨水，0.1mol/L NaCl洗脱液洗脱液去热源、色素去热源、色素DEAE-SephadexA50柱，柱，pH8.0,（二乙氨乙基葡聚糖）（二乙氨乙基葡聚糖）流出液流出液（活性部分（活性部分）浓浓 缩缩羧甲基纤维素（羧甲基纤维素（CMCCMC柱，柱，pH4.2pH4.2)CMCCMC柱柱洗脱（洗脱（HAC-NaAC)NH3+NaCl,pH11.5-11.8洗脱液洗脱液透透 析析H2O,4透析液透析液冻冻 干干成品成品 孕妇尿粗制粗制尿：苯甲酸：乙
37、醇尿：苯甲酸：乙醇/1：0.075：5）用用HCl调调pH 4-5HCG(粗品）提取提取NaAC pH4.8提取液透析透析水，水，5以下以下透析内液吸附（吸附（CM SepharoseCI-6B）羧甲基琼脂糖凝胶羧甲基琼脂糖凝胶吸附后交换剂洗涤洗涤，峰峰NaAC,pH4.8,pH5.9洗涤后交换剂洗脱洗脱NaAC,pH8.5洗脱液冷冻干燥冷冻干燥 30HCG精品 溶解溶解蒸馏水，蒸馏水，10以下以下HCG溶液透析透析pH6.8, 5以下以下透析内液吸附吸附羟基磷灰石，羟基磷灰石，pH6.8吸附物解吸解吸0.5mmol/L,1.0mmol/L磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（PBS),pH6.8解吸液
38、干燥干燥30HCG纯品三、绒膜促性激素三、绒膜促性激素（HCG,怀孕怀孕4570天含量高）天含量高）的制备的制备治疗女性不育症，神经性皮炎治疗女性不育症，神经性皮炎,子宫出血和习惯性流产子宫出血和习惯性流产四、人体来源药物的研究前景四、人体来源药物的研究前景 （prospect）人体来源的原料虽只限于血液、胎盘、尿液人体来源的原料虽只限于血液、胎盘、尿液、毛发等有限几种，但利用前景很广阔、毛发等有限几种，但利用前景很广阔。1、可进一步开发新产品、可进一步开发新产品 exploitation of new productio）（1）血液的利用，血浆蛋白可分离为）血液的利用，血浆蛋白可分离为I-V
39、5个个成分。目前仅利用了其中的成分。目前仅利用了其中的I（纤维蛋白原）（纤维蛋白原）、II（免疫球蛋白）和（免疫球蛋白）和V（白蛋白）（白蛋白）3个组分个组分，III和和IV，目前基本未加以利用。，目前基本未加以利用。（2 2）对其他原料的利用）对其他原料的利用，胎盘是重要的人类胎盘是重要的人类原料之一，较好利用的只有胎盘球蛋白原料之一，较好利用的只有胎盘球蛋白、胎盘白蛋白等少数品种。、胎盘白蛋白等少数品种。 一、动物来源生物制品制备的实例一、动物来源生物制品制备的实例1 1、胰岛素的制备、胰岛素的制备 （production of insulin）（1）胰岛素的性质：）胰岛素的性质：pI=5
40、.3-5.4，由，由A链、链、B链链通过两个二硫键连接；通过两个二硫键连接；A链含链含21个氨基酸，个氨基酸，B链链含含30个氨基酸；是所有蛋白质中研究得最多，个氨基酸；是所有蛋白质中研究得最多，也是研究得最清楚的蛋白。也是研究得最清楚的蛋白。 第三节第三节 动物来源生物制品的制备动物来源生物制品的制备（2 2）工艺路线）工艺路线猪胰脏提取提取乙醇，草酸，乙醇，草酸，10-15提取液碱化碱化氨水，氨水，pH8-8.4碱化液酸化酸化硫酸，硫酸，pH3.6-3.8,5 酸化液浓缩浓缩30 以下，减压以下，减压浓缩液去脂去脂速热速冷速热速冷去脂溶液盐析盐析NaCl,pH2-2.5盐析物水、丙酮、氨水
41、（水、丙酮、氨水（pH4.24.3）除酸性蛋白除酸性蛋白滤液锌沉淀锌沉淀氨水，氨水，Zn（Ac）2，pH6.0沉淀除碱性蛋白，结晶除碱性蛋白，结晶Zn（Ac）2，丙酮、氨水，丙酮、氨水，pH8.0，5以下，柠檬酸调以下，柠檬酸调pH6.0结晶结晶洗涤，干燥洗涤，干燥水、丙酮、乙醚水、丙酮、乙醚胰岛素精品胰岛素精品2 2、超氧化物歧化酶（、超氧化物歧化酶（SOD）的制备）的制备超氧化物歧化酶（超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）与）与机体抗衰老、肿瘤发生、自身免疫疾病和辐射防护机体抗衰老、肿瘤发生、自身免疫疾病和辐射防护等有关。用于炎症、类风湿性关节炎、慢性多发性
42、等有关。用于炎症、类风湿性关节炎、慢性多发性关节炎及放射治疗后的炎症等。关节炎及放射治疗后的炎症等。SOD存在于动物、植物、微生物中，有存在于动物、植物、微生物中，有Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等。等。牛红细胞牛红细胞SOD为为Cu-Zn-SOD，由两个亚基组成，由两个亚基组成，每个亚基含每个亚基含1个个Cu和和1个个Zn。在。在pH7.6-9.0时稳定。它时稳定。它催化超氧负离子歧化为催化超氧负离子歧化为H2O2。 新鲜猪血新鲜猪血去血浆，离心去血浆，离心红细胞红细胞0.9%NaCl,反复洗涤反复洗涤3次次收集收集工艺路线工艺路线浮洗浮洗净红细胞净红细胞溶血溶血血去离子水，
43、血去离子水，5,30min溶血物溶血物去血红蛋白去血红蛋白乙醇，氯仿乙醇，氯仿,15min上清液上清液沉淀沉淀丙酮，丙酮，0沉淀物沉淀物去离子水去离子水55-65，10-15min黄绿色澄清液黄绿色澄清液沉去不溶蛋白，透析沉去不溶蛋白，透析丙酮，去离子水，丙酮，去离子水，0，6-8h透析液透析液吸附、吸脱、超滤、浓缩、干燥吸附、吸脱、超滤、浓缩、干燥DEAE-SephadexA50,磷酸缓冲液磷酸缓冲液（K3PO4），），pH7.6SOD成品成品第四节第四节 基因工程生物制品的制备基因工程生物制品的制备 先确定与某种疾病有关的具有预防或治疗作用的蛋先确定与某种疾病有关的具有预防或治疗作用的蛋白
44、质，然后将控制该蛋白合成的基因分离或进行人工合白质，然后将控制该蛋白合成的基因分离或进行人工合成，利用重组成，利用重组DNA技术将该基因加以改造，再将改造后技术将该基因加以改造，再将改造后的基因导入可以不断繁殖的受体细胞，从而大规模生产的基因导入可以不断繁殖的受体细胞，从而大规模生产具有预防和治疗这种疾病的蛋白质。通过这种方法生产具有预防和治疗这种疾病的蛋白质。通过这种方法生产的新型生物制品称为的新型生物制品称为基因工程生物制品基因工程生物制品。上游技术：工程菌的构建上游技术：工程菌的构建下游技术：目的基因产物的分离纯化下游技术：目的基因产物的分离纯化一、上游技术：工程菌的构建一、上游技术：工
45、程菌的构建1、目的基因的分离制备与鉴定、目的基因的分离制备与鉴定2、重组载体的选择与制备、重组载体的选择与制备3、目的基因与载体的重组、目的基因与载体的重组4、构建的重组载体转染适当的受体细胞（表达载体）、构建的重组载体转染适当的受体细胞（表达载体）5、筛选含有重组子的细胞进行扩增、筛选含有重组子的细胞进行扩增1、目的基因的分离制备与鉴定、目的基因的分离制备与鉴定（1）目的基因所处染色体的确定）目的基因所处染色体的确定（2）目的基因的获取）目的基因的获取 目的基因可以是染色体目的基因可以是染色体DNA、cDNA或人工合成的或人工合成的DNA，目的基因不同，获取方法也不同。目的基因不同，获取方法
46、也不同。A、限制性内切酶切取目的基因、限制性内切酶切取目的基因B、用逆转录酶制备、用逆转录酶制备cDNA（又称（又称cDNA法）法）C、化学合成目的基因、化学合成目的基因 用来分离原核基因的方法。获取的基因是染色体用来分离原核基因的方法。获取的基因是染色体DNA。 破碎细胞破碎细胞分离染色体分离染色体限制性内切酶作用限制性内切酶作用目的基因目的基因限制性内切酶切取目的基因限制性内切酶切取目的基因 用来分离真核基因的方法。以目的基因的用来分离真核基因的方法。以目的基因的mRNA为模板，反转录合成互补为模板，反转录合成互补DNA（cDAN）。）。用逆转录酶制备用逆转录酶制备cDNA（又称（又称cD
47、NA法）法）化学合成目的基因化学合成目的基因 利用磷酸二酯法、磷酸三酯法等方法合成。化学合利用磷酸二酯法、磷酸三酯法等方法合成。化学合成的先决条件是必须要知道成的先决条件是必须要知道DNA的碱基顺序。此法一的碱基顺序。此法一般只能合成较短的多肽激素基因。世界上第一个人工般只能合成较短的多肽激素基因。世界上第一个人工化学合成并表达的基因是生长素释放抑制素基因。化学合成并表达的基因是生长素释放抑制素基因。 在获取目的基因后，应首先考虑所得基因是否在获取目的基因后，应首先考虑所得基因是否是所需要的目的基因。是所需要的目的基因。凝胶电泳及酶切图谱测定凝胶电泳及酶切图谱测定核酸杂交核酸杂交DNA序列测定
48、序列测定（3）目的基因的鉴定）目的基因的鉴定常用的载体有：常用的载体有：细菌质粒细菌质粒 质粒是一些细菌的亚细胞结构，是存在于多种细菌染色体外的遗传质粒是一些细菌的亚细胞结构，是存在于多种细菌染色体外的遗传单位。是一类双链、闭环的单位。是一类双链、闭环的DNA分子，分子量约分子，分子量约1-200kb。质粒。质粒DNA分子可以游离存在于染色体外，在一定条件下又会可逆地整合到寄主分子可以游离存在于染色体外，在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂遗传给后代。染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂遗传给后代。作为载体，质粒可以接纳中等大小的作为载体
49、，质粒可以接纳中等大小的DNA片断，如小于片断，如小于10kb的的DNA；如果大于如果大于10kb的的DNA插入质粒，将大大降低重组质粒的转化率和产量。插入质粒，将大大降低重组质粒的转化率和产量。2、重组载体的选择与制备、重组载体的选择与制备 pBR322pBR322质粒来源：质粒来源：pSF2124pSF2124质粒的氨卞青霉素抗性质粒的氨卞青霉素抗性基因（基因（ApApr r）；）；pSC101pSC101质粒的四环素抗性基因（质粒的四环素抗性基因（TcTcr r）；）；ColEColE的派生质粒的复制起点（的派生质粒的复制起点（oriori）。在）。在ApApr r基因中基因中有一个有一
50、个PstPst切点，切点， TcTcr r基因中有一个基因中有一个BamHBamH和一个和一个SalSal切点。切点。pBR322AprTcrOriPstBamHSal 用限制性内切酶和连接酶将所需目的基因插入用限制性内切酶和连接酶将所需目的基因插入选定的载体中。选定的载体中。 一般通过抗性基因的酶切位点插入抗性基因中，一般通过抗性基因的酶切位点插入抗性基因中，从而导致抗性基因的失活。从而导致抗性基因的失活。3、目的基因与载体的重组、目的基因与载体的重组原核表达系统：原核表达系统：大肠杆菌大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌枯草芽孢杆菌、链霉菌。真核表达系统：真核表达系统：酵母酵母、昆虫细胞、哺乳类
